分光光度計(jì)基本原理與結(jié)構(gòu)

分光光度計(jì)基本原理與結(jié)構(gòu)1許多化學(xué)物質(zhì)具有顏色，有些無(wú)顏色的化合物也可以與顯色劑作用，生成有色物質(zhì)。實(shí)踐證明，有色溶液的濃度越大，顏色越深；濃度越小，顏色越淺。因此，可以通過(guò)比較溶液顏色深淺的方法來(lái)確定有色溶液的濃度，對(duì)溶液中所含的物質(zhì)進(jìn)行定量分析?；诒容^顏色深淺對(duì)溶液進(jìn)行定量分析的方法稱為比色分析法。2溶液為什么會(huì)有顏色，顏色又為什么與濃度有關(guān)呢？下面就討論這個(gè)問(wèn)題。一、光的互補(bǔ)及有色物質(zhì)的顯色原理1．光的波粒二象性光是能的一種表現(xiàn)形式，是電磁波的一種。光在真空中以直線方式傳播，在不同的介質(zhì)處發(fā)生反射、折射、衍射、色散、干涉和偏振等現(xiàn)象?？捎貌ㄩL(zhǎng)、頻率、傳播速度等參量來(lái)描述，即光具有“波動(dòng)性”。光的顏色即由光的波長(zhǎng)決定，人眼能感覺(jué)到的光稱為可見(jiàn)光，其波長(zhǎng)在400～750nrn之間。在可見(jiàn)光之外是紅外光和紫外光。3同時(shí)，光也具有“粒子性”，光電效應(yīng)就是一個(gè)很好的例子。光的粒子性理論認(rèn)為，光是由“光子”（或稱“光量子”）所組成。在輻射能量時(shí)，光是以一份一份的能量E的形式輻射的，同時(shí)光被吸收時(shí)，能量也是一份一份被吸收的。這每一份能量的大小為hυ。光子的能量與波長(zhǎng)的關(guān)系為E=hυ=hc／λ式中E為光子的能量（J：焦耳），υ為頻率，h為普朗克常數(shù)（6.63×10-34J?S），c為光速，λ為光的波長(zhǎng)4因此，不同波長(zhǎng)的光，其能量不同，短波能量大，長(zhǎng)波能量小。2。光的顯色原理若把某兩種顏色的光，按一定的強(qiáng)度比例混合，能夠得到白色光，則這兩種顏色的光叫做互補(bǔ)色。圖4－1中處于直線關(guān)系的兩種光為互補(bǔ)色。如綠光和紫光為互補(bǔ)色，黃光和藍(lán)光為互補(bǔ)色等等。各種溶液會(huì)呈現(xiàn)出不同的顏色，其原因是溶液中有色質(zhì)點(diǎn)（分子或離子）選擇性地吸收某種顏色的光。實(shí)驗(yàn)證明：溶液所呈現(xiàn)的顏色是其主要吸收光的互補(bǔ)色。如一束白光通過(guò)高錳酸鉀溶液時(shí)，綠光大部分被選擇吸收，其它的光透過(guò)溶液。從互補(bǔ)色示意圖可以看出，透過(guò)光中只剩下紫色光，所以高錳酸鉀溶液呈紫色。56二、朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律溶液顏色的深淺與濃度之間的關(guān)系可以用吸收定律來(lái)描述。它是由朗伯定律和比爾定律相結(jié)合而成的，所以叫朗伯-比爾定律。原子吸收分光光度計(jì)也符合這個(gè)定律。溶液對(duì)光的吸收當(dāng)一束強(qiáng)度為I的平行單色光照到溶液時(shí)，一部分光被溶液吸收，一部分光被界面散射，其余的光則透過(guò)溶液，如圖4-2所示78有：I0=Ia+Ir+ItI0--入射光強(qiáng)度Ia--吸收光強(qiáng)度Ir--反射光強(qiáng)度It--透射光強(qiáng)度通常由于Ir很小可忽略不計(jì)，上式可簡(jiǎn)化為I0=Ia+It透射光It與入射光強(qiáng)度I0之比為透光率或透光度，用T表示：T=It/Ia透光率的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度或光密度或消光度，用A表示：A=－lgT=lg1/T=lgIa/It9吸光度越大，表示該物質(zhì)對(duì)光的吸收越強(qiáng)。透光度和吸光度都是用來(lái)表示入射光被吸收的程度，它們之間可據(jù)式相互換算。實(shí)驗(yàn)證明，單色光經(jīng)過(guò)有色溶液時(shí)，透過(guò)溶液的光強(qiáng)度不僅與溶液的濃度有關(guān)，而且還與溶液的厚度以及溶液本身對(duì)光的吸收性能有關(guān)。其規(guī)律可用下式表示為A＝KCL式中：A（E）——吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）；K——某溶液的消光（吸收）系數(shù)；C——溶液的濃度；L——光程，即溶液的厚度。10消光系數(shù)K是一個(gè)常數(shù)。一種有色溶液對(duì)于一定波長(zhǎng)（單色光）的入射光的K值具有一定的數(shù)值。若溶液的濃度以摩爾／升表示，溶液厚度以厘米表示，則此時(shí)的K值稱為摩爾消光系數(shù)。摩爾消光系數(shù)是有色化合物的重要特性之一，根據(jù)這個(gè)數(shù)值的大小，可以估計(jì)顯色反應(yīng)的靈敏程度。從上式可以看出，當(dāng)K和L不變時(shí)，光密度E與溶液濃度C成正比關(guān)系，也可以說(shuō)，當(dāng)一束單色入射光經(jīng)過(guò)有色溶液且入射光、消光系數(shù)和溶液厚度不變時(shí)，吸光度A是隨著溶液濃度而變化的。11這種單色光與有色溶液的關(guān)系稱為朗伯-比爾定律。光電比色計(jì)和分光光度計(jì)的比色分析方法就是根據(jù)這一定律來(lái)進(jìn)行的。但是，朗伯-比爾定律只適用于單色光和低濃度的有色溶液。三、朗伯-比爾定律的應(yīng)用1．等吸光度法從朗伯-比耳定律可知，當(dāng)用同一光源照射同一物質(zhì)的不同濃度溶液時(shí)，若吸光度相等，則兩溶液各自的濃度和透光液層厚度的乘積也相等。利用此關(guān)系在可見(jiàn)光區(qū)用眼作檢測(cè)器（目視比色法），即可求出待測(cè)溶液的濃度。122．計(jì)算法根據(jù)被測(cè)溶液濃度的大致范圍，先配制一已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用同樣的方法處理標(biāo)準(zhǔn)溶液與被測(cè)溶液，使其成色后，在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下用同一臺(tái)儀器分別測(cè)定它們的吸光度。在標(biāo)準(zhǔn)溶液中：As=KsCsLs在待測(cè)溶液中：Ax=KxCxLx如果測(cè)定時(shí)選用相同厚度的比色皿使L相等，并使用同一波長(zhǎng)的單色光，保持溫度相同，則K也相等。將兩式相除可得As/Ax=Cs/Cx13由此可見(jiàn)，在滿足上述條件下，吸光度與溶液成正比。如果設(shè)計(jì)一種儀器，可以測(cè)量吸光度A值，則待測(cè)溶液的濃度即可求出Cx=Ax/As?Cs由于儀器的性能和實(shí)驗(yàn)環(huán)境在不斷的變化，所以在采用計(jì)算法時(shí)，必須每次都要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液和被測(cè)液進(jìn)行測(cè)量，然后利用上式進(jìn)行計(jì)算，否則會(huì)帶來(lái)較大的測(cè)量誤差。由于一般光電比色計(jì)在結(jié)構(gòu)上有不少偏離朗伯一比耳定律的地方，故欲得到較準(zhǔn)確的結(jié)果，常采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。143．標(biāo)準(zhǔn)曲線法這種方法分以下幾步：（1）先配制五種以上標(biāo)準(zhǔn)濃度的溶液。（2）測(cè)出每種溶液的吸光度A。（3）做A～C標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖4－3所示。有了標(biāo)準(zhǔn)工作曲線便可對(duì)溶液進(jìn)行測(cè)量。在同樣的條件下，用儀器測(cè)出A后，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得被測(cè)溶液的濃度值Cx。1516由于光電比色計(jì)工作在可見(jiàn)光區(qū)，只適合在有限個(gè)波長(zhǎng)下測(cè)量，且波長(zhǎng)的半寬度大。因此，它不能滿足不同分析工作的需要。其次，光電比色計(jì)的靈敏度也低。為了克服以上不足，便發(fā)展了性能更好的分析方法：紫外--分光光度法。它利用單色器分光，其單色光純度高，波長(zhǎng)范圍寬，并可連續(xù)變化，解決了光電比色計(jì)存在的問(wèn)題。17一、分光光度計(jì)基本原理和結(jié)構(gòu)分子，包括雙原子分子的光譜，要比原子光譜復(fù)雜得多。這是由于在分子中，除了電子相對(duì)于原子核的運(yùn)動(dòng)外，還有核間相對(duì)位移引起的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)。這三種運(yùn)動(dòng)能量都是量子化的，并對(duì)應(yīng)有一定的能級(jí)。分子的總能量可以認(rèn)為是這三種能量的總和，即E=E。＋E振＋E轉(zhuǎn)18當(dāng)用頻率為υ的電磁波照射分子，而該分子的較高能級(jí)與較低能級(jí)之差⊿E恰好等于該電磁波的能量hυ時(shí)，即有⊿E=hυ這里，h為普朗克常數(shù)。此時(shí)，在微觀上出現(xiàn)分子由較低的能級(jí)躍遷到較高的能級(jí)，在宏觀上則表現(xiàn)為透射光的強(qiáng)度變小。若用一連續(xù)輻射的電磁波照射分子，將照射前后光強(qiáng)度的變化轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，并記錄下來(lái)，就可以得到一張光強(qiáng)度變化對(duì)波長(zhǎng)的關(guān)系曲線圖——分子吸收光譜圖。19紫外--可見(jiàn)區(qū)的分子吸收光譜一般是譜帶較寬的帶狀光譜，它是由于電子能級(jí)躍遷而產(chǎn)生的光譜，因此又叫做電子光譜。分子吸收光譜與物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)，吸光度的大小與物質(zhì)的含量有關(guān)，我們利用吸收光譜的形狀和吸收程度的大小即可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析。這種分析方法叫做分光光度法。二、分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)與光電比色計(jì)相比，在結(jié)構(gòu)上分光光度計(jì)用單色器代替了濾光片，其它部分兩者比較相似。20（－）單色器：?jiǎn)紊魇侵敢粋€(gè)光學(xué)系統(tǒng)，它比濾光片能更有效地提供帶寬窄的單色光。單色器的主要組件是玻璃棱鏡、復(fù)合濾光片或光柵。來(lái)自光源的光線，可直接通過(guò)單色器的狹縫，照到分光部件上。單色器的效率比普通濾光片高。在紫外和可見(jiàn)光范圍內(nèi)，半寬度不超過(guò)1nm。1．棱鏡單色器從幾何光學(xué)我們知道，當(dāng)一束光從一種介質(zhì)射到另一種介質(zhì)時(shí)，在界面會(huì)發(fā)生折射和反射，如圖4-3所示。設(shè)入射角為i，折射角為θ，則其折射率n為:n=Sini/sinθ21不同的光學(xué)材料具有不同的折射率，這是眾所周知的。即使使用同一種光學(xué)材料，以相同的人射角照射，若波長(zhǎng)不同，得到的折射角也不一樣。透明物質(zhì)的折射率n和入射光波長(zhǎng)的關(guān)系可以用下列經(jīng)驗(yàn)式表示：n＝A＋B/λ2＋C/λ4＋…式中A、B、C的數(shù)值與物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。從式中可以看出，波長(zhǎng)越長(zhǎng)，折射率越小。一束復(fù)合光進(jìn)入棱鏡，由于不同波長(zhǎng)的光，其折射率不同，通過(guò)棱鏡后，復(fù)色光就按不同的波長(zhǎng)分開(kāi)來(lái)了，如圖4－4所示。2223實(shí)驗(yàn)證明，棱鏡的色散具有非線性，即①譜線彎曲；②不同波長(zhǎng)區(qū)域色散效果不同，紅端色散差，紫端色散較好。雖然在實(shí)際應(yīng)用中的棱鏡單色器與圖示的不盡相同，然而它們的工作原理是一樣的。2．光柵單色器衍射光柵也可用作單色器。衍射光柵是由一系列刻劃在高光潔度反射表面上溝紋組成的。溝紋排列異常密集，每英寸長(zhǎng)度上有15000或30000條。將光柵放在一平行光束里，光柵的一面被照亮，這一面可看作是塊非常小的反射鏡。24從溝紋反射鏡反射出的光線相重疊，發(fā)生干涉，如圖4－5所示。另一方面，如果在光線方向上的溝紋條數(shù)是波長(zhǎng)的整數(shù)倍時(shí)，光線就被溝紋分開(kāi)，這種波就是同向的，射線被反射。當(dāng)它不是波長(zhǎng)的整數(shù)倍時(shí)，光線被抵消，沒(méi)有反射現(xiàn)象。改變光線照到光柵上的角度，就可以改變反射光的波長(zhǎng)。射線波長(zhǎng)λ與反射角θ的關(guān)系，如下式：mλ=2dsinθ式中，d是溝紋之間的距離，θ是光柵常數(shù)；m是干涉價(jià)數(shù)。當(dāng)m=1時(shí)，為一階譜；m=2時(shí)，為二階譜。25光柵的分辨能力取決于它的mN值，N是光柵上總溝紋數(shù)或總條數(shù)。條數(shù)多時(shí)，一階譜的分辨力高。與棱鏡相比，光柵的分辨能力更高些，并能用于所有譜段范圍，光柵的色散呈線性。2627光柵的表面鍍有鋁膜，質(zhì)地松軟，極易擦傷。所以在維護(hù)時(shí)嚴(yán)禁用任何擦拭物擦拭，更不能用手去觸摸，否則，會(huì)造成永久損壞。也不準(zhǔn)用嘴去吹光柵上的灰塵。光柵萬(wàn)一臟了，可以用洗耳球吹去表面上的灰塵。如不奏效，可以在光柵上均勻地涂上一層粘膠棉（俗稱火棉膠）液，等膠液干了以后，將液膜輕輕揭下。此法可以將光柵上的臟物去掉?，F(xiàn)在有的光柵已鍍有保護(hù)膜。28（二）準(zhǔn)直鏡和聚光鏡：準(zhǔn)直鏡用來(lái)減小光束的尺寸并提供平行光，其多由凹面鏡制成。凹面鏡的反射鏡面大都是鍍鋁的。在可見(jiàn)光區(qū)，鋁膜外面常常再鍍上一層SiO2保護(hù)層。但在紫外區(qū)，為了保證較高的反射效率。常常不鍍此SiO2保護(hù)膜，這種準(zhǔn)直鏡的維護(hù)方法與光柵相同。聚光鏡為一凸透鏡。點(diǎn)光源發(fā)出的光，經(jīng)聚光鏡后，變成平行光，然后再進(jìn)入棱鏡（或光柵）色散系統(tǒng)。色散后的平行光再經(jīng)聚光鏡會(huì)聚后，照射到比色皿上。29三、分光光度計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)簡(jiǎn)介分光光度計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)有許多類型，不同類型的光學(xué)系統(tǒng)，對(duì)測(cè)量方法和結(jié)果都有一定影響，下面，我們介紹幾種常用分光光度計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)。（－）單光束光學(xué)系統(tǒng)：它是分光光度計(jì)中最簡(jiǎn)單的和應(yīng)用最普遍的一種。它的特點(diǎn)是只有一條光束。通過(guò)交換參比和樣品的位置，使其分別進(jìn)入光路。在參比（溶劑）進(jìn)入光路時(shí)，調(diào)零。然后將樣品進(jìn)入光路的信號(hào)和參比信號(hào)進(jìn)行比較，就可在顯示器上讀出樣品的透過(guò)率和吸光度。結(jié)構(gòu)如圖4－6所示。3031單光束分光光度計(jì)由于在每個(gè)波長(zhǎng)都需要變換參比和樣品的位置，所以只能手動(dòng)，不能掃描吸收光譜。它的結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，使用也有一定限制，但如配置程序控制和打印裝置，則對(duì)一些常規(guī)的定量測(cè)定（如醫(yī)院化驗(yàn)室）還是比較適用的。國(guó)產(chǎn)754型、WFD－SA型、WFZ800D型分光光度計(jì)，以及國(guó)外的貝克曼DU型、島津QC－50、QR－50、日立EPU－2A型、希爾格H700型、C－4型等都屬于這種類型的儀器。32（二）雙光束光學(xué)系統(tǒng)：?jiǎn)喂馐止夤舛扔?jì)雖簡(jiǎn)單價(jià)廉，但有如下缺陷：即它要求在整個(gè)測(cè)定過(guò)程中光源必須穩(wěn)定不變；另外光電轉(zhuǎn)換器和放大器如有不規(guī)則的特性