實驗五 唾液淀粉酶的最適PH測定

生化實驗報告山東大學實驗報告2011年4月6日姓名張行潤系年級2009級生科4班學號200900140177同組者于潛科目生物化學實驗題目唾液淀粉酶的最適PH測定儀器編號105實驗目的1、了解pH對酶活力的影響2、了解什么叫最適pH，掌握測量pH對酶活力影響的基本原理和方法實驗原理影響酶反應活力的因素很多，影響胞外酶的因素主要包括PH值、溫度和金屬離子、抑制劑及其他小分子，以及酶濃度等因素。PH值對酶反應活力的影響：1、酸或堿可以使酶的空間結構破壞，引起酶的活力喪失，這種喪失活力可以是可逆的或者是不可逆的，對可逆的來說，改變PH值后可使活力恢復。2、酸或堿影響酶的活性部位催化基團的離解狀態(tài)，使得底物不能分解成產(chǎn)物。3、酸或堿影響酶的活性部位結合基團的離解狀態(tài)，使得底物不能和它結合。4、酸或堿影響底物的離解狀態(tài)，或使底物不能和酶結合。由于上述種種原因，各種酶的作用都有一個最適合的PH值范圍。最適pH酶的催化活性與pH環(huán)境有密切關系，通常各種酶只在一定pH范圍內才具有活性，酶活力最高時的pH，稱為酶的最適pH。高于或低于此pH時酶的活性逐漸降低。用酶活力對PH值作圖，往往是鐘罩形曲線。最適合的PH值還隨著底物濃度、溫度和其他條件的變化而變化，因此確定最適合的PH值應在所實驗的條件下測得。需要注意的是：酶的最適pH不是一個特征性常數(shù)。不同種類的酶其最適合的PH值范圍不同；同一種酶，來源不同，其最適合的PH值也有差異；同一種酶由于作用底物不同，酶最適合的PH值也不同；同一種酶作用于同一底物，隨著溫度等條件變化，最適合的PH值也有變化。如唾液淀粉酶最適pH為6.8，但在磷酸緩沖溶液中，其最適pH為6.4—6.6，而在乙酸緩沖溶液中則為5.6?？傊?，不同的酶在不同的PH值范圍不僅穩(wěn)定性不同，而且活力也不同，在最適合的PH值內活力最強，這是酶的一個重要特征，要仔細控制。實驗器材電熱恒溫水浴鍋，旋渦混合儀，電爐，電子秤，試管10支，試管架，100mL容量瓶，小燒杯，移液管（1mL，2mL，5mL，10mL），三角瓶7個，膠頭滴管，玻璃棒，白瓷板，洗耳球實驗材料0.3%NaCl的0.5%淀粉溶液100ml（新鮮配制）：稱取0.30gNaCl溶于80mL水中，電爐加熱煮沸，加入0.50g淀粉溶解至澄清透明，冷卻，定容至100mL0.2mol/LNa2HPO4溶液200ml0.1mol/L檸檬酸溶液100ml不同濃度的唾液淀粉酶（1：100，1：200，1：400···）碘液實驗步驟不同PH緩沖液的配制：表1：不同PH緩沖液的配制成分表試劑PH值5.46.06.46.87.27.68.00.2mol/LNa2HPO4溶液/mL11.1512.6313.8530.9017.3918.7319.450.1mol/L檸檬酸溶液/mL8.57.376.159.102.611.270.55總體積/mL20.020.020.040.020.020.020.0將配好的溶液分別置于已標號的三角瓶中待用唾液的獲?。赫麴s水漱口后在口中含蒸餾水，適宜時間后將蒸餾水連同唾液一同放置于事先準備好的容器中即可，在實驗過程中應注意酶的失活，為了防止此現(xiàn)象發(fā)生應將此液體置于冰水中冷卻；3、確定最佳保溫時間：取3支潔凈試管，分別加入0.3%NaCl的0.5%淀粉溶液2mL，然后加入PH6.8的Na2HPO4—檸檬酸緩沖溶液3mL，分別加入稀釋不同倍數(shù)的唾液淀粉酶各2mL，充分搖勻后，放入37℃水浴中保溫并計時，每隔1min用滴管取1滴混合液于點滴板上，加1滴碘液，檢驗淀粉水解程度，為橙黃色時，為水解完全，為進一步確定保溫時間，應加1滴碘液至試管中，若為橙黃色時表示反應完全，記錄所需保溫時間。最佳保溫時間應在8—12min左右，若偏差太大，應該加以稀釋，因此要掌握好唾液淀粉酶的稀釋濃度。4、測定唾液淀粉酶的最適PH：取7支干凈試管，編號后分別加入0.3%NaCl的0.5%淀粉溶液2mL，然后分別加入第一步中配制的PH5.4-8.0的Na2HPO4—檸檬酸緩沖溶液3mL，37℃恒溫水浴10min后，先往4號試管中加入2ml稀釋過的唾液，搖勻后并開始計時，此后每隔1min向下一個試管中加入2ml稀釋后的唾液并搖勻，均放入37℃恒溫水浴中，待各試管均加入唾液后，等計時到達最佳保溫時間，將4號試管取出并滴入一滴碘液，混勻后觀察顏色變化，此后每隔一分鐘按剛才加入唾液的順序將試管依次取出，均加入一滴碘液，混勻后觀察顏色變化，并做記錄。所加試劑如下表所示：表2：測定唾液淀粉酶最適PH所加試劑表管號12345670.3%NaCl的0.5%淀粉溶液(ml)2222222Na2HPO4—檸檬酸緩沖溶液PH（3ml）5.46.06.46.87.27.68.037℃恒溫水浴10min稀釋后的唾液（ml）2222222注意事項1、摸準保溫時間是實驗的關鍵，用滴管取保溫液前后，均應將試管內的溶液混勻，取出保溫液后，滴管仍放回試管中一起保溫，以減少實驗誤差。2、碘液不要過早的加到白瓷板上，以免碘液揮發(fā)，影響顯色效果。3、加入碘液后，立即搖勻，保證酶液與全部淀粉液接觸反應，才能得到理想效果。4、依照分子量算所需溶質質量的時候因結晶水的不同應按試劑瓶標簽上的計算。實驗結果顏色由深到淺，再到深，最適pH6.8，顏色最淺，近似焦黃色。如下圖所示：圖1：唾液淀粉酶的最適PH結果圖（從左到右為1-7號試管）從左到右依次是Na2HPO4—檸檬酸緩沖溶液PH5.4-8.0所配置的溶液，從左到右顏色先變淺后變深，其中5.4的顏色最深，因為偏酸性對唾液淀粉酶的酶活影響更大一些，PH6.8的試管中顏色最淺，由此可得出人的唾液淀粉酶的最適PH為6.8分析討論在本實驗中，最佳保溫時間是關鍵。此外，碘液的濃度也直接關系著實驗結果的準確觀察，若本實驗中配制的碘液濃度相對而言比較高，碘液的顏色將實際反應的顏色遮蔽，導致實驗結果不能準確觀察，為解決該問題，可將碘液