綠體春化型大蒜葉片在春化過(guò)程中的生理生化變化

綠體春化型大蒜葉片在春化過(guò)程中的生理生化變化李彤;栗孟飛;李唯;李甜甜;周蘭蘭【摘要】以大蒜(Alliumsativum)為試驗(yàn)材料,對(duì)低溫春化作用過(guò)程中葉片組織內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、SOD活性、內(nèi)源激素ABA、GA和IAA水平及特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定與分析.結(jié)果表明：春化作用過(guò)程中,可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖含量及IAA水平無(wú)顯著變化,SOD活性、ABA和GA水平均逐漸增加,IAA/ABA、IAA/GA和GA/ABA逐漸降低的趨勢(shì)；春化作用完成后，可溶性蛋白質(zhì)含量,SOD活性,ABA和GA水平均顯著下降而可溶性糖含量、IAA水平及IAA/ABA、IAA/GA和GA/ABA顯著增加；另外低溫春化作用后室溫生長(zhǎng)一定時(shí)期可誘導(dǎo)特異性蛋白質(zhì)(44.3~29.0kU)的合成與積累.結(jié)果顯示，綠體春化型大蒜只有在春化作用完成后，經(jīng)歷適宜的生長(zhǎng)條件下一定時(shí)期，才會(huì)呈現(xiàn)明顯的生理生化反應(yīng)并開始迅速的生長(zhǎng)發(fā)育.％ThecharacteristicsofphysiologicalandbiochemicalchangesinleavesofAlliumsativumdur-ingvernalizationwerestudiedbydetectingandanalyzingthecontentsofsolubleprotein,solublesugar,to-talactivityofsuperoxidedismutase(SOD),thelevelsofendogenoushormonesABA,GA,IAAandthera-tiosofIAA/ABA,IAA/GAandGA/ABA,includingthespecificproteinsseparation.Theresultsshowedthatduringvernalizationthecontentofsolubleproteinandsugar,thelevelofIAAhadnosignificantdiffer-ence,theactivityofSODandthelevelsofABAandGAincreased,theratioofIAA/ABA,IAA/GAandGA/ABArepresentedthetrendsofdecreasing.Aftervernalization,thecontentofsolubleprotein,theactiv-ityofSODandthelevelsofABAandGAdecreasedmarkedly,whilethecontentofsolublesugar,thelevelofIAAandtheratioofIAA/ABA,IAA/GAandGA/ABAincreasedsignificantly.Inaddition,thespecificprotein(44.3~29.0kU)wassynthesizedandaccumulatedatroomtemperatureaftervernalization.Allofwhichindicatedthatwithasuitablegrowthconditionsthecharacteristicsofphysiologicalandbiochemical changedsignificantlyinleavesofAlliumsativumLaftervernalization.Theresultsoftheresearchwouldprovideatheoreticalbasisforthefurtherstudyontheseedlingvernalizationtypeplants.【期刊名稱】《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)》【年(卷)，期】2014(000)002【總頁(yè)數(shù)】6頁(yè)(P96-101)【關(guān)鍵詞】大蒜;春化作用;可溶性蛋白質(zhì);可溶性糖;SOD;內(nèi)源激素;特異性蛋白質(zhì)【作者】李彤;栗孟飛;李唯;李甜甜;周蘭蘭【作者單位】甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070;甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州|730070;甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070;甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070;甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類】S633.4植物生長(zhǎng)發(fā)育受外界環(huán)境的影響較大，如溫度、光照等.一些2年生和冬性1年生的植物成花主要受低溫的影響，低溫成為花誘導(dǎo)所必需的條件，這種低溫誘導(dǎo)及促進(jìn)植物開花的效應(yīng)被稱為低溫誘導(dǎo)作用或春化作用（vernalization）.植物對(duì)春化作用的反應(yīng)特征可以從外部形態(tài)（葉數(shù)、莖粗、株高、抽薹等）、生理生化（蛋白質(zhì)、糖、酶、激素等）和分子生物學(xué)（蛋白質(zhì)、核酸、甲基化等）3個(gè)大方面得到體現(xiàn)［1］.低溫誘導(dǎo)植物開花的機(jī)理一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn).早在20世紀(jì)40年代，Wort［2］通過(guò)研究北美地區(qū)不同品種春小麥對(duì)春化作用的響應(yīng)后發(fā)現(xiàn)，低溫可以促進(jìn)春小麥開花數(shù)量的增加.另外，低溫或光周期的變化會(huì)對(duì)植株葉片、莖干質(zhì)量及葉片、分蘗數(shù)產(chǎn)生明顯的改變.隨后，很多學(xué)者就春化作用對(duì)種子或植株體內(nèi)物質(zhì)的變化進(jìn)行了較為全面的分析，比如脂類［3］、蛋白質(zhì)［4］、碳水化合物［5］、氨基酸［6］、GA［7］、細(xì)胞分裂素［8］、生長(zhǎng)素［9］、ABA［10］等.近年來(lái)，對(duì)于春化作用的研究大多集中在分子生物學(xué)方面，比如FLC［11］、VRN1［12］、VIP4［13］、MAF［14］、SOC1［15］、Ppd-H1［16］等基因以及甲基化水平［17］、蛋白質(zhì)表達(dá)［18］、代謝調(diào)控［19］和信號(hào)傳導(dǎo)［20-21］等方面.低溫對(duì)植物來(lái)講具有多種效應(yīng)，對(duì)于需要春化的作物來(lái)講，首先是獲得抗性，而后在漫長(zhǎng)的春化進(jìn)程中，完成由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖發(fā)育的轉(zhuǎn)換［22］.根據(jù)植物開始感受低溫的時(shí)期，可將植物分為種子萌動(dòng)春化型（如小麥、黑麥等）和綠體植株春化型（如芹菜、白菜、大蒜等）［1］.到目前為止，對(duì)于春化作用的研究大多針對(duì)種子萌動(dòng)春化型植物，比如，小麥、黑麥和擬南芥，其中尤以模式植物擬南芥最多；而對(duì)綠體植株春化型的研究較少.大蒜是百合科、蔥屬2年生草本植物，屬于綠體植株春化型，低溫（0~4。030-40d就能順利通過(guò)春化作用，室溫長(zhǎng)日照條件下進(jìn)行生殖生長(zhǎng).生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，大蒜鱗莖的形成及數(shù)量受到低溫時(shí)長(zhǎng)的影響，即低溫效應(yīng)越長(zhǎng)，花芽和鱗芽分化提前且鱗莖數(shù)目減少.本研究擬以大蒜為試驗(yàn)材料，通過(guò)嚴(yán)格控制溫度、光照及營(yíng)養(yǎng)條件，測(cè)定低溫春化作用對(duì)葉片中可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、SOD活力、內(nèi)源激素ABA、GA和IAA水平等變化的影響，旨在探討綠體春化型植株春化作用過(guò)程中生理生化的變化特征，以期豐富綠體春化型植物的研究?jī)?nèi)容，最終為大蒜高效生產(chǎn)提供基礎(chǔ)技術(shù)資料.1材料與方法1.1試驗(yàn)材料'隴南遲蒜’由甘肅省隴南市成縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心提供.采用盆栽的方式滿足大蒜的萌發(fā)與生長(zhǎng)，定期澆灌Hogland營(yíng)養(yǎng)液保證植株的生長(zhǎng)與發(fā)育.植株生長(zhǎng)到4~5個(gè)葉片時(shí)，置人工氣候箱中進(jìn)行4~6°C低溫春化處理，光照周期8/16h(76~114pmol/m2-s);低溫處理后的植株在(25±1)C,光照周期12/12h(76~114pmol/m2-s)的培養(yǎng)箱中進(jìn)行生長(zhǎng).1.2藥品及儀器試驗(yàn)中生理生化測(cè)定所用藥品均為分析純，ABA、GA和IAA標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，購(gòu)于Sigma公司；主要儀器有紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析TU-1810)，低溫高速離心機(jī)(Eppendorfcentrifuge5415R),高效液相色譜儀(AgilentZORBAXEclipseXDB-C18)等.1.3試驗(yàn)方法分別取低溫處理第5、10、15、20、25、30、35天和低溫處理后第5、10、15天的大蒜葉片進(jìn)行相應(yīng)生理生化指標(biāo)的測(cè)定.可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法，可溶性糖含量采用蒽酮比色法，SOD總活力采用氮藍(lán)四唑(NBT)法，特異性蛋白質(zhì)分離采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳[23].內(nèi)源激素ABA、GA和IAA采用HPLC法，具體步驟與方法如下：1.3.1待測(cè)樣品溶液的制備準(zhǔn)確稱量1.0g大蒜葉片；加入8mL80%(v/v)的預(yù)冷甲醇(4C),充分研磨至勻漿后，置于低溫(4。。浸提12h;4C下10000r/min離心10min，上清液減壓濃縮(35°C)揮發(fā)去除甲醇；水相加入等體積乙酸乙酯進(jìn)行萃取，混勻后靜置30min,重復(fù)3次，合并乙酸乙酯相，減壓濃縮(35C)揮發(fā)去除乙酸乙酯；濃縮液加入1mL甲醇，混勻后用0.22pm有機(jī)濾膜過(guò)濾，得到樣品提取液.1.3.2色譜條件C18色譜柱(150mmx4.6mm,5pm),流動(dòng)相乙腈：甲醇：0.6%乙酸=10:50:40,流速0.7mL/min，柱溫35C,檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，進(jìn)樣量20.0pL.1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別配制20.0pg/mL的溶液，然后采用梯度濃度稀釋法分別獲得10.0、5.0、5pg/mL的低濃度溶液.以峰面積(y)對(duì)進(jìn)樣量(刃進(jìn)行回歸計(jì)算，得到標(biāo)準(zhǔn)品ABA、GA和IAA的標(biāo)準(zhǔn)方程分別為y=24.607x+171.06(r2=0.994)、y=0.140X+0.670(r2=0.991)和y=3.003x+22.33(r2=0.994).1.4數(shù)據(jù)處理每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，應(yīng)用MicrosoftOfficeExcel2007和SPSS11.5軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并進(jìn)行差異顯著性分析.2結(jié)果與分析2.1低溫春化作用對(duì)大蒜可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖含量及SOD活性變化的影響低溫處理5~35d,大蒜葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量沒有顯著性變化，在6.37~15.67mg/g之間；而在春化作用后，可溶性蛋白質(zhì)含量顯著地增加，第5天達(dá)到最大值55.00mg/g，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其含量又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖1-A).可溶性糖含量的變化在低溫處理5~15d逐漸降低，第20天又顯著增加，然后緩慢下降，在春化作用完成后期顯著增加；而在春化作用后呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，在第15天達(dá)到最大值54.77mg/g(圖1-B).SOD活性在5~15d沒有顯著變化，而在第20天顯著性下降，然后又顯著性地增加，在第35天達(dá)到最大值160.12U/g；在春化作用后SOD活性顯著性降低，在第15天達(dá)到最小值72.58U/g（圖1-C）.不同字母表示不同時(shí)期差異顯著（P<0.05）.圖1春化作用過(guò)程中大蒜葉片內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖含量和SOD活性的變化Fig.1ChangesofsolubleproteinandsugarcontentsandSODactivityinleavesofAlliumsativumduringthevernalization2.2低溫春化作用對(duì)大蒜ABA、GA和IAA水平變化的影響圖2-A結(jié)果顯示，ABA水平在5~30d緩慢增加，第35天顯著增加，相對(duì)于第30天增加了約14.5倍，而春化作用后5~15d顯著下降.GA水平的變化趨勢(shì)與ABA基本相似，不同之處在于在春化作用后第5天達(dá)到最大值595.32pg/g（圖2-B）.IAA與ABA和GA的變化水平差異較大，在低溫春化作用第15天IAA水平相對(duì)于其它顯著地增加之外，其它各時(shí)期均沒有顯著差異，而在春化作用后5~15d時(shí)期內(nèi)，IAA水平顯著地增加，第15天達(dá)到最大值125.27pg/g（圖2-C）.不同字母表示不同時(shí)期差異顯著（P<0.05）.圖2春化作用過(guò)程中大蒜葉片內(nèi)ABA、GA和IAA水平的變化Fig.2ChangesofABA、GAandIAAlevelsinleavesofAlliumsativumduringthevernalization2.3低溫春化作用對(duì)大蒜ABA、GA和IAA之間比值變化的影響IAA/ABA在低溫春化作用5~15d沒有顯著性變化，第20天顯著性下降，第35天達(dá)到最低，而在春化作用后顯著地增加，在第15天達(dá)到最大值，約為春化作用第35天的27倍（圖3-A）.IAA/GA的變化與IAA/ABA的變化類似，不同之處在低溫春化作用第15天時(shí)，IAA/GA有一個(gè)顯著性的增加（圖3-B）.GA/ABA在低溫春化作用時(shí)期沒有顯著性變化，而在春化作用后顯著地增加，第15天達(dá)到最大值，約為春化作用第35天的3.26倍（圖3-C）.不同字母表示不同時(shí)期差異顯著（P<0.05）.圖3春化作用過(guò)程中大蒜葉片內(nèi)IAA/ABA、IAA/GA和GA/ABA比值的變化Fig.3ChangesofIAA/ABA、IAA/GAandGA/ABAratiosinleavesofAlliumsativumduringthevernalization2.4低溫春化作用對(duì)大蒜特異性蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)從圖4結(jié)果可知，未低溫處理室溫生長(zhǎng)10d、低溫春化作用后室溫生長(zhǎng)10d和低溫春化作用生長(zhǎng)10d的大蒜葉片內(nèi)蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，在116、97.2、66.4-44.3.29.0、14.3kU處均具有明顯的蛋白質(zhì)條帶，但在44.3-29.0kU之間只有低溫春化作用后室溫生長(zhǎng)10d的處理有一明顯條帶，以此可以推測(cè)春化作用后，大蒜經(jīng)過(guò)一定時(shí)期的室溫生長(zhǎng)，誘導(dǎo)了植株體內(nèi)特異性蛋白質(zhì)的合成與積累.圖中1、2和3分別代表未低溫處理室溫10d、低溫春化作用后室溫10d和低溫春化作用10d的處理.圖4低溫對(duì)大蒜葉片內(nèi)特異性蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)Fig.4InductionofspecificproteinsinleavesofAlliumsativumunderlowtemperature3討論糖是植物生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝的物質(zhì)能量基礎(chǔ)，也是春化階段碳代謝的結(jié)果[24].細(xì)胞內(nèi)清除活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的酶系統(tǒng)有SOD、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbateperoxidase,APX)等，其中SOD第1個(gè)參與的清除反應(yīng)，在抗氧化酶類中處于重要地位[25-26].植物激素是細(xì)胞間通訊的化學(xué)信息，在代謝、生長(zhǎng)、形態(tài)建成等植物生理活動(dòng)的各個(gè)方面均起到十分重要的作用[27].ABA是調(diào)控植物體生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)外界應(yīng)激的重要植物激素之一[28].IAA是天然植物生長(zhǎng)素的主要活性成分，影響植物細(xì)胞的伸長(zhǎng)和分裂、花器官的形成等[29].赤霉素GAs具有代替某些植物開花所需低溫的作用，促進(jìn)開花[1].更為重要的是，植物體內(nèi)激素之間相克相成，相互制約而又相互促進(jìn)，各種激素相互作用的平衡狀態(tài)比單一激素對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及其調(diào)節(jié)作用更為重要[30].春化作用是一個(gè)低溫誘導(dǎo)體內(nèi)特異蛋白質(zhì)表達(dá)的過(guò)程［31-32］.在植物接受低溫處理過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生一系列的生理生化變化，包括糖的合成與代謝，抗氧化酶系統(tǒng)的應(yīng)急變化，激素的變化及信號(hào)傳導(dǎo)等，進(jìn)而影響相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)特異蛋白質(zhì)的合成，最終調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程.本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低溫春化作用初期，大蒜植株為了適應(yīng)低溫的環(huán)境，糖代謝加強(qiáng)，從而可溶性糖含量降低，經(jīng)過(guò)一定時(shí)期的低溫適應(yīng)，糖合成能力又逐漸提高.為了抵抗低溫的傷害，抗氧化酶SOD隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，在第35天達(dá)到最大值.激素的變化影響植物細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，春化作用過(guò)程中，IAA水平無(wú)顯著變化，ABA和GA水平均逐漸增加，IAA/ABA、IAA/GA和GA/ABA逐漸降低的趨勢(shì)，而春化作用完成后，ABA和GA水平顯著下降，而IAA水平及IAA/ABA、IAA/GA和GA/ABA顯著增加.激素與相關(guān)靶細(xì)胞的受體結(jié)合，轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N或若干種胞內(nèi)信號(hào)，進(jìn)而啟動(dòng)特定的生理反應(yīng)，調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)，誘導(dǎo)特異蛋白質(zhì)的合成.在低溫春化作用時(shí)期內(nèi)，大蒜葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量沒有顯著變化，而在春化作用后，可溶性蛋白質(zhì)含量顯著增加，第5天達(dá)到最大值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其含量又呈現(xiàn)下降趨勢(shì).另外，低溫春化作用后室溫生長(zhǎng)—定時(shí)期可誘導(dǎo)特異性蛋白質(zhì)(44.3-29.0kU)的合成與積累.綜上所述，植物在低溫春化作用過(guò)程中，體內(nèi)生理生化物質(zhì)會(huì)發(fā)生規(guī)律性的變化，并且根據(jù)植物種類不同(種子萌動(dòng)春化型和綠體植株春化型)，其變化規(guī)律也有差異.綠體春化型大蒜葉片中可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及ABA、GA和IAA水平在春化作用過(guò)程中均呈現(xiàn)一定的變化變化規(guī)律.其中，可溶性蛋白質(zhì)含量、特異性表達(dá)以及內(nèi)源激素ABA、GA和IAA水平在春化作用完后變化最為顯著.正如所言，植物春化作用機(jī)制是受到基因遺傳調(diào)控的，在低溫春化作用過(guò)程中，植物體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列的生理生化變化［33］，但是植物只有在春化作用完成后適宜的生長(zhǎng)條件下一定時(shí)期，才會(huì)做出明顯的反應(yīng)，并開始迅速的生長(zhǎng)和發(fā)育.對(duì)于低溫春化作用后誘導(dǎo)的特異性蛋白質(zhì)的生物學(xué)特征，還有待于進(jìn)一步研究.參考文獻(xiàn)胡巍，侯喜林,史公軍.植物春化特性及春化作用機(jī)理[J].植物學(xué)通報(bào),2004,21(1):26-36WortDJ.Responsesofvariousspringwheattovernalization[J].PlantPhysiol,1940,15(1):137-141ThomsonLW,ZalikS.Lipidsinryeseedlingsinrelationtovernalization[J].PlantPhysiol,1973,52(3):268-273JosephN.Accumulationofadistinctmacromolecularcomponentinryeembryosasaresultsofvernalization[J].Nature,1962,194(4826):400-401TrioneEJ.MetabolicchangesassociatedwithvernalizationofwheatI:Carbohydrateandnitrogenpatterns[J].PlantPhysiol,1966,41(2):277-281WeinbergerP,GodinC.ChangesintheaminoacidcontentofthefirstthreeleavesofRideauwheatfollowingv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