比格犬血漿中氫嗎啡酮的快速測定

比格犬血漿中氫嗎啡酮的快速測定

氫氧化酮（hyd）是一種半合成強(qiáng)鎮(zhèn)痛劑，具有類似于嗎啡的結(jié)構(gòu)，鎮(zhèn)痛作用約為嗎啡的8倍，副作用比嗎啡輕。它主要用于緩解疾病、術(shù)后和軟組織損傷引起的中強(qiáng)度疼痛。HYD在體內(nèi)發(fā)生廣泛的結(jié)合代謝,HYD-3-O-葡糖苷酸是其主要代謝物。HYD的消除半衰期僅為2.5h,為獲得良好鎮(zhèn)痛效果,HYD在臨床用藥時(shí)每隔4h給藥1次,為方便患者用藥,延長給藥間隔的緩釋制劑的研制引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。HYD血漿樣品測定方法主要有放射免疫法,高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。本實(shí)驗(yàn)旨在建立一種快速、靈敏的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定比格犬給予HYD緩釋制劑后血漿中HYD的濃度,以評價(jià)其緩釋特征。測定條件及色譜儀器美國Finnigan公司TSQ型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有大氣壓化學(xué)電離源(APCI)以及Xcalibur1.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);日本島津公司LC-10ADvp液相色譜輸液泵;美國Zymark公司TurboVap蒸發(fā)儀。藥品與試劑鹽酸氫嗎啡酮對照品(99.8%)由青海制藥有限公司提供;鹽酸特拉唑嗪對照品(99.8%)由廣州貝氏藥業(yè)有限公司提供;受試制劑鹽酸氫嗎啡酮緩釋片(規(guī)格:4mg/片)由青海制藥廠有限公司研制;參比制劑鹽酸氫嗎啡酮片(規(guī)格:4mg/片)由美國MallinckrodtInc.生產(chǎn);甲醇為色譜純,購于天津市康科德科技有限公司;β-葡糖苷酸酶(542200u·g-1)購自美國Sigma公司。色譜條件ZorbaxSBC8色譜柱(150mm×4.6mmID,5μm,美國安捷倫公司);流動相為甲醇-水-甲酸(65∶35∶1);流速0.55mL·min-1,柱溫20℃。質(zhì)譜條件離子源為大氣壓化學(xué)電離源(APCI),加熱毛細(xì)管溫度250℃,氣化室溫度450℃;鞘氣(N2)壓力600kPa;輔助氣(N2)流量3L·min-1;碰撞氣(Ar)壓力1.9Pa;碰撞誘導(dǎo)解離(CID)電壓分別為35eV(氫嗎啡酮)和30eV(特拉唑嗪);正離子方式檢測;掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)。用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z286→185(氫嗎啡酮)和m/z388→290(特拉唑嗪),掃描時(shí)間為0.3s。血漿樣品處理取血漿樣品0.1mL,加水100μL和內(nèi)標(biāo)(125μg·L-1特拉唑嗪水溶液100μL),混勻,加入β-葡糖苷酸酶(500ku·L-1,以50mmolNH4H2PO4緩沖液配制,pH5)200μL,40℃水浴溫孵16h,冷卻,加入飽和Na2CO3溶液500L混勻,用二氯甲烷-異丙醇(9∶1)3mL提取。渦流混合1min,往復(fù)振蕩15min,離心5min(3500r·min-1),分取有機(jī)相2mL,于40℃空氣流下吹干,殘留物加流動相100μL溶解,取20μL進(jìn)行分析測定。結(jié)果1分子離子峰的分布?xì)鋯岱韧c內(nèi)標(biāo)特拉唑嗪在APCI離子化方式下,主要生成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰,分別為m/z286和m/z388。選擇性對準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+進(jìn)行二級質(zhì)譜分析(圖1),氫嗎啡酮與內(nèi)標(biāo)生成的主要碎片離子分別為m/z185和m/z290,并將其作為定量分析時(shí)監(jiān)測的產(chǎn)物離子。2內(nèi)標(biāo)和氫嗎酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別取6只犬的空白血漿0.1mL,除不加內(nèi)標(biāo)外,按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作,進(jìn)樣20μL,得色譜圖2A;將一定濃度的氫嗎啡酮標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿中,依同法操作,得色譜圖2B。待測物氫嗎啡酮與內(nèi)標(biāo)特拉唑嗪的保留時(shí)間分別為2.3min和2.6min;取比格犬給藥后的血漿樣品,依同法操作,得色譜圖2C。結(jié)果表明,空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物氫嗎啡酮及內(nèi)標(biāo)物的測定。3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取空白血漿0.1mL,加氫嗎啡酮系列溶液100μL,配制成相當(dāng)于氫嗎啡酮血漿質(zhì)量濃度為0.80,3.0,10.0,40.0,100.0和200.0μg·L-1的血漿樣品,除不加入流動相100μL外,按“血漿樣品處理”項(xiàng)下依法操作,進(jìn)樣20μL,記錄色譜圖;以待測物濃度為橫坐標(biāo),待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo),用加權(quán)(1/C2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。氫嗎啡酮的典型回歸方程為:Y=4.44×10-4+4.51×10-3C,r=0.9987。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,氫嗎啡酮的線性范圍為0.80-200.0μg·L-1,定量下限為0.80μg·L-1。4質(zhì)量控制試驗(yàn)取空白血漿0.1mL,按“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)下方法制備氫嗎啡酮低、中、高3個(gè)濃度(氫嗎啡酮分別為0.80,10.0和180.0μg·L-1)的質(zhì)量控制(QC)樣品,每一濃度進(jìn)行6樣本分析,連續(xù)測定3d,并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行。以當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的濃度,將QC樣品的結(jié)果進(jìn)行方差分析,求算本法的準(zhǔn)確度與精密度,結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,日內(nèi)、日間精密度(RSD)均小于6.0%,準(zhǔn)確度(RE)在±1.0%以內(nèi)。5提取回收率的計(jì)算提取回收率考察時(shí),血漿樣品未經(jīng)孵化處理。取空白血漿0.1mL,按“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)下的方法制備低、中、高3個(gè)濃度(氫嗎啡酮分別為0.80,10.0和180.0μg·L-1)的樣品,每個(gè)濃度測定6個(gè)樣品。同時(shí)另取空白血漿0.1mL,按“血漿樣品處理”項(xiàng)下提取,殘留物以相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液溶解,進(jìn)樣分析,獲得相應(yīng)峰面積。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率。結(jié)果表明,氫嗎啡酮血漿濃度在0.80,10.0和180.0μg·L-1時(shí)的提取回收率分別為53.9%,53.5%和54.0%,內(nèi)標(biāo)溶液經(jīng)同法提取處理,其回收率為62.7%。本文考察了氫嗎啡酮血漿樣品在室溫放置及40℃孵化時(shí)的穩(wěn)定性。取低、中、高3個(gè)濃度(氫嗎啡酮分別為0.80,10.0和180.0μg·L-1)的血漿樣品,室溫放置2h后,經(jīng)液-液萃取處理,待測物血漿濃度的相對偏差(RE)在±6.1%之內(nèi);3個(gè)濃度的血漿樣品在40℃孵化16h,經(jīng)液-液萃取處理,氫嗎啡酮血漿濃度的相對偏差(RE)在±8.0%之內(nèi)。此外,本文還考察了內(nèi)標(biāo)特拉唑嗪在40℃孵化16h的穩(wěn)定性,結(jié)果表明特拉唑嗪分解30%以上,為保證處理過程的一致性,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備也經(jīng)孵化處理。6血藥濃度-時(shí)間曲線檢測血漿中dma-l-4-4.采用隨機(jī)雙交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì),6只比格犬(♀♂各半,平均體重為13.4kg)禁食12h后,單劑量po鹽酸氫嗎啡酮緩釋片(受試制劑)和鹽酸氫嗎啡酮片(參比制劑)各4mg后,于服藥前(0h)和服藥后0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,12.0,24.0和36.0h取后腿小隱靜脈血1mL,離心(4000r·min-1)10min,分離血漿。應(yīng)用本文的分析方法,分別測定血漿樣品中的氫嗎啡酮濃度,獲得血藥濃度-時(shí)間曲線,見圖3。結(jié)果可見,受試制劑與參比制劑的達(dá)峰時(shí)間Tmax分別為2.8h和1.3h,峰濃度Cmax分別為60.5μg·L-1和100.2μg·L-1。受試制劑的Cmax低于參比制劑,而Tmax大于參比制劑,顯示該受試制劑具緩釋特征。根據(jù)血藥濃度-時(shí)間曲線進(jìn)行參數(shù)計(jì)算,以半對數(shù)作圖法,由消除相的末4個(gè)濃度點(diǎn)計(jì)算T1/2。受試制劑與參比制劑的T1/2分別為10.2h和9.7h。提取溶劑的選擇口服HYD后,首過代謝程度很高,主要生成3-O-葡糖苷酸結(jié)合物。目前測定血漿中HYD的文獻(xiàn)方法主要為放射免疫法,高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。其中LC/MS法使用ESI源,正相色譜分離,1mL血漿,8mL提取溶劑,最低定量限可達(dá)0.05μg·L-1。在實(shí)驗(yàn)初期,作者曾嘗試采用ESI源測定犬血漿中HYD,使用0.1mL血漿,定量下限為0.1μg·L-1。但測定犬po鹽酸氫嗎啡酮片4mg后的血漿樣品時(shí)發(fā)現(xiàn),藥物濃度峰值低于3μg·L-1,僅能檢測到給藥后8h的藥物濃度。