結(jié)核病藥敏實驗

結(jié)核病實驗室檢查方法及質(zhì)量控制銅陵市疾控中心左延才主要內(nèi)容痰涂片（簡單法）結(jié)核菌培養(yǎng)結(jié)核菌藥敏實驗液體培養(yǎng)結(jié)核菌涂片鏡檢標準化操作涂片鏡檢是發(fā)現(xiàn)結(jié)核病傳染源的最主要方式是療效判斷的重要依據(jù)技術(shù)簡單、不需要特殊設(shè)備快速：2小時可報告結(jié)果最具成本/效益TB

可疑者TB

病人標本收集及保存標本接收和登記涂片染色顯微鏡檢結(jié)果記錄材料準備涂片保存用于EQA標本/污染物的安全丟棄結(jié)果報告對象結(jié)核病可疑者咳嗽、咳痰超過2周咳血或伴有血痰發(fā)熱或胸痛超過2周胸部X線異常確診并正在接受治療的結(jié)核病人標本收集指南安全意識:患者比標本有危險!告知患者咳嗽時掩口；收集痰標本時：室外或單獨的留痰室，且避開他人。只有高質(zhì)量的痰才能有準確可信的抗酸菌結(jié)果

提高痰菌檢出率的要素1.認識查痰的重要性2.固定痰檢人員3.加強工作責(zé)任心4.較好的痰檢設(shè)備5.重視留痰質(zhì)量6.提高查痰技術(shù)7.使用合格的染液和耗材8.對可疑排菌者多次查痰9.加強痰檢質(zhì)控痰涂片鏡檢室間質(zhì)量控制提高痰涂片的可信性和可靠性提供更可靠的支持提高痰涂片檢查的敏感性室間質(zhì)量評估現(xiàn)場評價：頻率要求：國家參比室每年不定期對省級參比室進行現(xiàn)場評價，同時抽查市及縣級實驗室省級參比室對市級參比室半年進行一次，市級參比室半對縣級結(jié)核病實驗室每季度一次；

督導(dǎo)方式：

——現(xiàn)場督導(dǎo)上級實驗室檢驗人員赴基層實驗室現(xiàn)場指導(dǎo)，抽取痰片復(fù)驗。

——非現(xiàn)場督導(dǎo)基層實驗室將保存近期3個月的全部痰片，及實驗記錄，送上級實驗室復(fù)驗。（涂片保存量要求：棄舊存新、保存近期3個月、年涂片量不足500全部保留，近3個月超過1000張，按照棄舊存新保存近期1000張。）

室間質(zhì)量評估盲法復(fù)檢原則：盲法、隨機實施模式：兩種模式，第一種：同級實驗室作為第一復(fù)檢，上級實驗室作為第二復(fù)檢；第二種：也可由上級實驗室進行第一復(fù)檢，然后再由該實驗室的另一實驗員進行第二復(fù)檢（由省參比室決定并核準采取何種方式）。室間質(zhì)量評估盲法復(fù)檢現(xiàn)場抽片方法：計算抽片量、抽樣間隔、抽片、填寫表5涂片號、變更涂片號、初檢結(jié)果、表6涂片號。若抽樣片丟失或者損壞，選擇下一張涂片，并填寫變更涂片號，并在備注欄說明原因，但其它編號不變，即未丟失或損壞的涂片仍按原抽取的編號進行抽片。室間質(zhì)量評估盲法復(fù)檢結(jié)果評價量化誤差：同一張陽性涂片初檢者和復(fù)檢者陽性級別判斷相差2個及以上。定性偏差：在盲法復(fù)檢中，如果一次盲法復(fù)檢中出現(xiàn)1個及1個以上高假陽或高假陰涂片，或者一次盲法復(fù)檢中低假陽與低假陰片數(shù)達到或超過2個分枝桿菌分離培養(yǎng)（簡單法）為什么進行培養(yǎng)對痰涂片陰性的病人進行診斷獲得藥敏試驗所需的純培養(yǎng)物-MDR診斷：是獲得藥敏試驗所需純培養(yǎng)物的前提和基礎(chǔ)-療效判斷：是評價治療效果的重要指標結(jié)核分枝桿菌的生長要求：

專性需氧菌最適生長溫度為37℃

最適PH為6.5～7.2

營養(yǎng)要求：氮源、碳源、無機鹽（磷、鐵、鎂、鉀、硫等）、生長因子培養(yǎng)標本的選擇診斷病例－3涂2培3份痰標本均為陽性：選取陽性級別高的2份痰標本進行培養(yǎng)；3份痰標本2份陽性：選取2份陽性痰標本進行培養(yǎng)；3份痰標本1份陽性：選取陽性標本和1份質(zhì)量好的陰性標本進行培養(yǎng)3份痰標本均為陰性：不培養(yǎng)（不是符合條件的耐多藥可疑者）隨訪病例－2涂2培無論涂片結(jié)果如何，2份隨訪標本均做培養(yǎng)分離培養(yǎng)的操作程序

培養(yǎng)基的準備標本前處理（去污染）接種孵育報告結(jié)果標本收集、儲存和運輸

收集：即時痰、夜間痰、晨痰保存：4℃保存運輸（UN3373類包裝）：3天內(nèi)必須運送到實驗室，7天內(nèi)必須進行培養(yǎng)痰標本1－2倍4%

NaOH振蕩勻化靜置15分鐘均勻接種0.1ml,2支/標本斜面向上，37℃水平放置24小時37℃豎直培養(yǎng)8周分枝桿菌培養(yǎng)陰性：斜面無菌落生長報告實際菌落數(shù)：菌落生長不足斜面面積1/4分枝桿菌培養(yǎng)陽性（1+）：菌落生長占斜面面積的1/4分枝桿菌培養(yǎng)陽性（2+）：菌落生長占斜面面積的1/2分枝桿菌培養(yǎng)陽性（3+）：菌落生長占斜面面積的3/4分枝桿菌培養(yǎng)陽性（4+）：菌落生長布滿整個斜面報告方式分枝桿菌培養(yǎng)陽性藥物敏感性試驗

藥敏試驗的目的開展耐藥監(jiān)測以了解某一地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的耐藥水平診斷耐藥結(jié)核病、選擇和調(diào)整耐藥結(jié)核病治療方案耐藥的產(chǎn)生耐藥是細菌群體的一種基本的現(xiàn)象。對于空洞型肺結(jié)核病患者，在開放性空洞中細菌的含量可達107-109，而干酪樣壞死病變中細菌含量一般不超過102-104。結(jié)核分枝桿菌存在自發(fā)的突變，每代每個細菌對以下藥物的平均突變概率分別為：

INH：3×10-8，

SM：3×10-8，

EMB：1×10-7，

RMP：2×10-10，

理論上對兩種藥物同時耐藥的突變概率為10-15。耐藥的產(chǎn)生根據(jù)廣泛認同的理論，耐藥的產(chǎn)生是由于在治療過程中對患者體內(nèi)已存在的耐藥突變菌選擇和增殖的結(jié)果。在應(yīng)用鏈霉素治療結(jié)核病的過程中發(fā)現(xiàn)耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生。如果單獨給予鏈霉素，開始時患者的癥狀迅速改善，痰菌減少；但隨后患者的癥狀惡化，痰菌增多，表現(xiàn)出耐藥，患者的分離菌株可以在含鏈霉素的培養(yǎng)基上生長。藥敏試驗方法基于檢測標本直接方法直接用涂陽標本進行試驗優(yōu)點：快速得到結(jié)果，較好地反應(yīng)病變部位菌群的耐藥性；缺點：容易失敗，很難確定接種量/菌活性。間接方法使用培養(yǎng)物進行藥敏試驗優(yōu)點：更好地控制接種量/菌活性缺點：耗時長試驗方法世界衛(wèi)生組織推薦的藥敏試驗方法基于生長觀察：固體培養(yǎng)方法比例法絕對濃度法基于生長檢測（產(chǎn)生二氧化碳、消耗氧氣等）液體藥敏法基于基因突變檢測探針雜交、測序等方法

從實驗室操作角度講，比例法與絕對濃度法并無很大差別，但由于比例法是通過計算耐藥菌比例來解釋結(jié)果的，對藥敏試驗中的重要變異因素——接種量進行了一定程度的校正，故結(jié)果較之絕對濃度法更為穩(wěn)定。比例法原理野生菌群的結(jié)核分枝桿菌都含有一定數(shù)量的突變菌株，所謂敏感株和突變株的不同在于總菌群中突變菌所占比例高低的不同。如果一個試驗?zāi)軌驅(qū)⑦@一比例計算出來，則能區(qū)分耐藥和敏感株。首先要得到活菌的總數(shù)和突變菌的數(shù)目。這可以通過將適宜稀釋度的菌液接種于不含藥、含藥的培養(yǎng)基上，然后計數(shù)菌落數(shù)來獲得，進而得到突變菌占總菌群的百分比。比例法藥敏試驗流程基礎(chǔ)液改良L-J對照培養(yǎng)基含藥培養(yǎng)基藥物儲存液混合、搖勻100ml1ml磨菌分裝凝固分裝凝固1mg/ml菌懸液10-4mg/ml

10-2mg/ml

100倍稀釋100倍稀釋接種0.01ml接種0.01ml2-3周新鮮菌落生物安全要求按照高致病性病原微生物的要求進行檢測；實驗室應(yīng)為P2及以上級別的實驗室，應(yīng)有生物安全柜和防止氣溶膠產(chǎn)生的儀器和設(shè)備；標準化的操作流程；良好的個人防護措施以及定期對操作人員進行體檢并進行生物安全培訓(xùn)和教育；實驗室應(yīng)有完善的規(guī)章制度和應(yīng)急預(yù)案等。結(jié)果報告按以下方式記錄菌落生長情況：少于50個菌落：實際菌落數(shù)50-100個菌落：1+100-200個菌落：2+大部分融合（200-500個菌落）：3+融合（大于500個菌落）：4+結(jié)果報告

計算耐藥百分比：含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)耐藥百分比=--------------------------×100%

對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)若耐藥百分比大于或等于1%，則認為受試菌對該抗結(jié)核藥耐藥。

絕對濃度法

該法是目前我國普遍采用的藥敏試驗方法。它是將一種濃度的細菌接種在二種濃度的含藥培養(yǎng)基上，并以不含抗結(jié)核藥物的培養(yǎng)基作對照。

判斷標準是對照培養(yǎng)基上分支桿菌生長良好,含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)≥20個判為耐藥。

絕對濃度法藥物濃度（ug/ml）

藥名低濃度高濃度

INH110SM10100PAS110EMB550

RFP50250

絕對濃度法

結(jié)果報告按下列方式報告對照及含藥培養(yǎng)基上菌落生長情況：分枝桿菌培養(yǎng)陰性：斜面無菌落生長分枝桿菌培養(yǎng)陽性（1+）：菌落生長占斜面面積的1/4分枝桿菌培養(yǎng)陽性（2+）：菌落生長占斜面面積的1/2分枝桿菌培養(yǎng)陽性（3+）：菌落生長占斜面面積的3/4分枝桿菌培養(yǎng)陽性（4+）：菌落生長布滿整個斜面培養(yǎng)基斜面上菌落數(shù)少于20個時，報告菌落數(shù)。絕對濃度法

結(jié)果解釋

敏感：培養(yǎng)基斜面上無菌落低濃度耐藥：培養(yǎng)基斜面上菌落數(shù)（1+）~（4+）不等高濃度耐藥：培養(yǎng)基斜面上菌落數(shù)（1+）~（4+）不等實報菌落數(shù)：含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)<20個比例法和絕對濃度法的一致性綜合以往國內(nèi)有關(guān)比例法和絕對濃度法的試驗報道，對2種方法研究結(jié)果顯示,比例法和絕對濃度法檢測結(jié)果的一致率4藥均高達96%以上,對于結(jié)核分支桿菌,二種方法測試H、S、R和E的耐藥率均無顯著性差異。我國逐漸用比例法替代絕對濃度法，將會使我們的藥敏試驗結(jié)果與國際接軌，與國際具有可比性，而不會影響到與我國既往資料的連續(xù)性和可比性。

分枝桿菌液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)優(yōu)勢分枝桿菌生長更好比固體培養(yǎng)基的陽性率更高(15-30%)對非肺部樣本,其檢出率更高對涂片陰性樣本,其檢出率更高適用于更多種類的分枝桿菌生長報告時間更快(12-14天)更好和更快的藥敏試驗結(jié)果(6-12天)自動化肉湯系統(tǒng)Bactec460TBBBLMGITMGIT960VersaTREKBACT/ALERTMP系統(tǒng)檢測方法放射測量法熒光測定法熒光測定法壓力測量法比色法容納能力60取決于人工960384240自動化半自動否是是是藥敏試驗是否是是是陽性檢測方法

放射測量法放射標記的

CO2，使用?-計數(shù)儀檢測熒光測定法熒光可被培養(yǎng)基里的O2抑制，隨著氧的消耗而釋放出來比色法CO2的產(chǎn)生可改變傳感器的顏色，被折光束檢測出來

壓力測量法隨著氣體產(chǎn)生壓力增加，可被壓力檢測儀器檢測出來陰性培養(yǎng)陽性培養(yǎng)無或微弱熒光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2強熒光傳感器對氧氣高度敏感的釕復(fù)合物肉湯改良Middlebrook7H9肉湯上部空間已預(yù)先充填10%CO2BACTEC?MGIT?960操作系統(tǒng)

液體培養(yǎng)對象初診的肺結(jié)核可疑癥狀者隨訪的肺結(jié)核患者痰標本采集、保存和運輸痰標本采集：即時痰、夜間痰、晨痰痰標本保存：4℃保存運輸（UN3373類包裝）：3天內(nèi)必