結(jié)核病藥敏實(shí)驗(yàn)

結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查方法及質(zhì)量控制銅陵市疾控中心左延才主要內(nèi)容痰涂片（簡(jiǎn)單法）結(jié)核菌培養(yǎng)結(jié)核菌藥敏實(shí)驗(yàn)液體培養(yǎng)結(jié)核菌涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作涂片鏡檢是發(fā)現(xiàn)結(jié)核病傳染源的最主要方式是療效判斷的重要依據(jù)技術(shù)簡(jiǎn)單、不需要特殊設(shè)備快速：2小時(shí)可報(bào)告結(jié)果最具成本/效益TB

可疑者TB

病人標(biāo)本收集及保存標(biāo)本接收和登記涂片染色顯微鏡檢結(jié)果記錄材料準(zhǔn)備涂片保存用于EQA標(biāo)本/污染物的安全丟棄結(jié)果報(bào)告對(duì)象結(jié)核病可疑者咳嗽、咳痰超過(guò)2周咳血或伴有血痰發(fā)熱或胸痛超過(guò)2周胸部X線異常確診并正在接受治療的結(jié)核病人標(biāo)本收集指南安全意識(shí):患者比標(biāo)本有危險(xiǎn)!告知患者咳嗽時(shí)掩口；收集痰標(biāo)本時(shí)：室外或單獨(dú)的留痰室，且避開他人。只有高質(zhì)量的痰才能有準(zhǔn)確可信的抗酸菌結(jié)果

提高痰菌檢出率的要素1.認(rèn)識(shí)查痰的重要性2.固定痰檢人員3.加強(qiáng)工作責(zé)任心4.較好的痰檢設(shè)備5.重視留痰質(zhì)量6.提高查痰技術(shù)7.使用合格的染液和耗材8.對(duì)可疑排菌者多次查痰9.加強(qiáng)痰檢質(zhì)控痰涂片鏡檢室間質(zhì)量控制提高痰涂片的可信性和可靠性提供更可靠的支持提高痰涂片檢查的敏感性室間質(zhì)量評(píng)估現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)：頻率要求：國(guó)家參比室每年不定期對(duì)省級(jí)參比室進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)，同時(shí)抽查市及縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室省級(jí)參比室對(duì)市級(jí)參比室半年進(jìn)行一次，市級(jí)參比室半對(duì)縣級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室每季度一次；

督導(dǎo)方式：

——現(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)上級(jí)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員赴基層實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)場(chǎng)指導(dǎo)，抽取痰片復(fù)驗(yàn)。

——非現(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)基層實(shí)驗(yàn)室將保存近期3個(gè)月的全部痰片，及實(shí)驗(yàn)記錄，送上級(jí)實(shí)驗(yàn)室復(fù)驗(yàn)。（涂片保存量要求：棄舊存新、保存近期3個(gè)月、年涂片量不足500全部保留，近3個(gè)月超過(guò)1000張，按照棄舊存新保存近期1000張。）

室間質(zhì)量評(píng)估盲法復(fù)檢原則：盲法、隨機(jī)實(shí)施模式：兩種模式，第一種：同級(jí)實(shí)驗(yàn)室作為第一復(fù)檢，上級(jí)實(shí)驗(yàn)室作為第二復(fù)檢；第二種：也可由上級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行第一復(fù)檢，然后再由該實(shí)驗(yàn)室的另一實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行第二復(fù)檢（由省參比室決定并核準(zhǔn)采取何種方式）。室間質(zhì)量評(píng)估盲法復(fù)檢現(xiàn)場(chǎng)抽片方法：計(jì)算抽片量、抽樣間隔、抽片、填寫表5涂片號(hào)、變更涂片號(hào)、初檢結(jié)果、表6涂片號(hào)。若抽樣片丟失或者損壞，選擇下一張涂片，并填寫變更涂片號(hào)，并在備注欄說(shuō)明原因，但其它編號(hào)不變，即未丟失或損壞的涂片仍按原抽取的編號(hào)進(jìn)行抽片。室間質(zhì)量評(píng)估盲法復(fù)檢結(jié)果評(píng)價(jià)量化誤差：同一張陽(yáng)性涂片初檢者和復(fù)檢者陽(yáng)性級(jí)別判斷相差2個(gè)及以上。定性偏差：在盲法復(fù)檢中，如果一次盲法復(fù)檢中出現(xiàn)1個(gè)及1個(gè)以上高假陽(yáng)或高假陰涂片，或者一次盲法復(fù)檢中低假陽(yáng)與低假陰片數(shù)達(dá)到或超過(guò)2個(gè)分枝桿菌分離培養(yǎng)（簡(jiǎn)單法）為什么進(jìn)行培養(yǎng)對(duì)痰涂片陰性的病人進(jìn)行診斷獲得藥敏試驗(yàn)所需的純培養(yǎng)物-MDR診斷：是獲得藥敏試驗(yàn)所需純培養(yǎng)物的前提和基礎(chǔ)-療效判斷：是評(píng)價(jià)治療效果的重要指標(biāo)結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)要求：

專性需氧菌最適生長(zhǎng)溫度為37℃

最適PH為6.5～7.2

營(yíng)養(yǎng)要求：氮源、碳源、無(wú)機(jī)鹽（磷、鐵、鎂、鉀、硫等）、生長(zhǎng)因子培養(yǎng)標(biāo)本的選擇診斷病例－3涂2培3份痰標(biāo)本均為陽(yáng)性：選取陽(yáng)性級(jí)別高的2份痰標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)；3份痰標(biāo)本2份陽(yáng)性：選取2份陽(yáng)性痰標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)；3份痰標(biāo)本1份陽(yáng)性：選取陽(yáng)性標(biāo)本和1份質(zhì)量好的陰性標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)3份痰標(biāo)本均為陰性：不培養(yǎng)（不是符合條件的耐多藥可疑者）隨訪病例－2涂2培無(wú)論涂片結(jié)果如何，2份隨訪標(biāo)本均做培養(yǎng)分離培養(yǎng)的操作程序

培養(yǎng)基的準(zhǔn)備標(biāo)本前處理（去污染）接種孵育報(bào)告結(jié)果標(biāo)本收集、儲(chǔ)存和運(yùn)輸

收集：即時(shí)痰、夜間痰、晨痰保存：4℃保存運(yùn)輸（UN3373類包裝）：3天內(nèi)必須運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，7天內(nèi)必須進(jìn)行培養(yǎng)痰標(biāo)本1－2倍4%

NaOH振蕩勻化靜置15分鐘均勻接種0.1ml,2支/標(biāo)本斜面向上，37℃水平放置24小時(shí)37℃豎直培養(yǎng)8周分枝桿菌培養(yǎng)陰性：斜面無(wú)菌落生長(zhǎng)報(bào)告實(shí)際菌落數(shù)：菌落生長(zhǎng)不足斜面面積1/4分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性（1+）：菌落生長(zhǎng)占斜面面積的1/4分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性（2+）：菌落生長(zhǎng)占斜面面積的1/2分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性（3+）：菌落生長(zhǎng)占斜面面積的3/4分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性（4+）：菌落生長(zhǎng)布滿整個(gè)斜面報(bào)告方式分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性藥物敏感性試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)的目的開展耐藥監(jiān)測(cè)以了解某一地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的耐藥水平診斷耐藥結(jié)核病、選擇和調(diào)整耐藥結(jié)核病治療方案耐藥的產(chǎn)生耐藥是細(xì)菌群體的一種基本的現(xiàn)象。對(duì)于空洞型肺結(jié)核病患者，在開放性空洞中細(xì)菌的含量可達(dá)107-109，而干酪樣壞死病變中細(xì)菌含量一般不超過(guò)102-104。結(jié)核分枝桿菌存在自發(fā)的突變，每代每個(gè)細(xì)菌對(duì)以下藥物的平均突變概率分別為：

INH：3×10-8，

SM：3×10-8，

EMB：1×10-7，

RMP：2×10-10，

理論上對(duì)兩種藥物同時(shí)耐藥的突變概率為10-15。耐藥的產(chǎn)生根據(jù)廣泛認(rèn)同的理論，耐藥的產(chǎn)生是由于在治療過(guò)程中對(duì)患者體內(nèi)已存在的耐藥突變菌選擇和增殖的結(jié)果。在應(yīng)用鏈霉素治療結(jié)核病的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生。如果單獨(dú)給予鏈霉素，開始時(shí)患者的癥狀迅速改善，痰菌減少；但隨后患者的癥狀惡化，痰菌增多，表現(xiàn)出耐藥，患者的分離菌株可以在含鏈霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。藥敏試驗(yàn)方法基于檢測(cè)標(biāo)本直接方法直接用涂陽(yáng)標(biāo)本進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)：快速得到結(jié)果，較好地反應(yīng)病變部位菌群的耐藥性；缺點(diǎn)：容易失敗，很難確定接種量/菌活性。間接方法使用培養(yǎng)物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)：更好地控制接種量/菌活性缺點(diǎn)：耗時(shí)長(zhǎng)試驗(yàn)方法世界衛(wèi)生組織推薦的藥敏試驗(yàn)方法基于生長(zhǎng)觀察：固體培養(yǎng)方法比例法絕對(duì)濃度法基于生長(zhǎng)檢測(cè)（產(chǎn)生二氧化碳、消耗氧氣等）液體藥敏法基于基因突變檢測(cè)探針雜交、測(cè)序等方法

從實(shí)驗(yàn)室操作角度講，比例法與絕對(duì)濃度法并無(wú)很大差別，但由于比例法是通過(guò)計(jì)算耐藥菌比例來(lái)解釋結(jié)果的，對(duì)藥敏試驗(yàn)中的重要變異因素——接種量進(jìn)行了一定程度的校正，故結(jié)果較之絕對(duì)濃度法更為穩(wěn)定。比例法原理野生菌群的結(jié)核分枝桿菌都含有一定數(shù)量的突變菌株，所謂敏感株和突變株的不同在于總菌群中突變菌所占比例高低的不同。如果一個(gè)試驗(yàn)?zāi)軌驅(qū)⑦@一比例計(jì)算出來(lái)，則能區(qū)分耐藥和敏感株。首先要得到活菌的總數(shù)和突變菌的數(shù)目。這可以通過(guò)將適宜稀釋度的菌液接種于不含藥、含藥的培養(yǎng)基上，然后計(jì)數(shù)菌落數(shù)來(lái)獲得，進(jìn)而得到突變菌占總菌群的百分比。比例法藥敏試驗(yàn)流程基礎(chǔ)液改良L-J對(duì)照培養(yǎng)基含藥培養(yǎng)基藥物儲(chǔ)存液混合、搖勻100ml1ml磨菌分裝凝固分裝凝固1mg/ml菌懸液10-4mg/ml

10-2mg/ml

100倍稀釋100倍稀釋接種0.01ml接種0.01ml2-3周新鮮菌落生物安全要求按照高致病性病原微生物的要求進(jìn)行檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)室應(yīng)為P2及以上級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)有生物安全柜和防止氣溶膠產(chǎn)生的儀器和設(shè)備；標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程；良好的個(gè)人防護(hù)措施以及定期對(duì)操作人員進(jìn)行體檢并進(jìn)行生物安全培訓(xùn)和教育；實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有完善的規(guī)章制度和應(yīng)急預(yù)案等。結(jié)果報(bào)告按以下方式記錄菌落生長(zhǎng)情況：少于50個(gè)菌落：實(shí)際菌落數(shù)50-100個(gè)菌落：1+100-200個(gè)菌落：2+大部分融合（200-500個(gè)菌落）：3+融合（大于500個(gè)菌落）：4+結(jié)果報(bào)告

計(jì)算耐藥百分比：含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)耐藥百分比=--------------------------×100%

對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)若耐藥百分比大于或等于1%，則認(rèn)為受試菌對(duì)該抗結(jié)核藥耐藥。

絕對(duì)濃度法

該法是目前我國(guó)普遍采用的藥敏試驗(yàn)方法。它是將一種濃度的細(xì)菌接種在二種濃度的含藥培養(yǎng)基上，并以不含抗結(jié)核藥物的培養(yǎng)基作對(duì)照。

判斷標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)照培養(yǎng)基上分支桿菌生長(zhǎng)良好,含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)≥20個(gè)判為耐藥。

絕對(duì)濃度法藥物濃度（ug/ml）

藥名低濃度高濃度

INH110SM10100PAS110EMB550

RFP50250

絕對(duì)濃度法

結(jié)果報(bào)告按下列方式報(bào)告對(duì)照及含藥培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)情況：分枝桿菌培養(yǎng)陰性：斜面無(wú)菌落生長(zhǎng)分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性（1+）：菌落生長(zhǎng)占斜面面積的1/4分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性（2+）：菌落生長(zhǎng)占斜面面積的1/2分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性（3+）：菌落生長(zhǎng)占斜面面積的3/4分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性（4+）：菌落生長(zhǎng)布滿整個(gè)斜面培養(yǎng)基斜面上菌落數(shù)少于20個(gè)時(shí)，報(bào)告菌落數(shù)。絕對(duì)濃度法

結(jié)果解釋

敏感：培養(yǎng)基斜面上無(wú)菌落低濃度耐藥：培養(yǎng)基斜面上菌落數(shù)（1+）~（4+）不等高濃度耐藥：培養(yǎng)基斜面上菌落數(shù)（1+）~（4+）不等實(shí)報(bào)菌落數(shù)：含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)<20個(gè)比例法和絕對(duì)濃度法的一致性綜合以往國(guó)內(nèi)有關(guān)比例法和絕對(duì)濃度法的試驗(yàn)報(bào)道，對(duì)2種方法研究結(jié)果顯示,比例法和絕對(duì)濃度法檢測(cè)結(jié)果的一致率4藥均高達(dá)96%以上,對(duì)于結(jié)核分支桿菌,二種方法測(cè)試H、S、R和E的耐藥率均無(wú)顯著性差異。我國(guó)逐漸用比例法替代絕對(duì)濃度法，將會(huì)使我們的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與國(guó)際接軌，與國(guó)際具有可比性，而不會(huì)影響到與我國(guó)既往資料的連續(xù)性和可比性。

分枝桿菌液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)分枝桿菌生長(zhǎng)更好比固體培養(yǎng)基的陽(yáng)性率更高(15-30%)對(duì)非肺部樣本,其檢出率更高對(duì)涂片陰性樣本,其檢出率更高適用于更多種類的分枝桿菌生長(zhǎng)報(bào)告時(shí)間更快(12-14天)更好和更快的藥敏試驗(yàn)結(jié)果(6-12天)自動(dòng)化肉湯系統(tǒng)Bactec460TBBBLMGITMGIT960VersaTREKBACT/ALERTMP系統(tǒng)檢測(cè)方法放射測(cè)量法熒光測(cè)定法熒光測(cè)定法壓力測(cè)量法比色法容納能力60取決于人工960384240自動(dòng)化半自動(dòng)否是是是藥敏試驗(yàn)是否是是是陽(yáng)性檢測(cè)方法

放射測(cè)量法放射標(biāo)記的

CO2，使用?-計(jì)數(shù)儀檢測(cè)熒光測(cè)定法熒光可被培養(yǎng)基里的O2抑制，隨著氧的消耗而釋放出來(lái)比色法CO2的產(chǎn)生可改變傳感器的顏色，被折光束檢測(cè)出來(lái)

壓力測(cè)量法隨著氣體產(chǎn)生壓力增加，可被壓力檢測(cè)儀器檢測(cè)出來(lái)陰性培養(yǎng)陽(yáng)性培養(yǎng)無(wú)或微弱熒光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2強(qiáng)熒光傳感器對(duì)氧氣高度敏感的釕復(fù)合物肉湯改良Middlebrook7H9肉湯上部空間已預(yù)先充填10%CO2BACTEC?MGIT?960操作系統(tǒng)

液體培養(yǎng)對(duì)象初診的肺結(jié)核可疑癥狀者隨訪的肺結(jié)核患者痰標(biāo)本采集、保存和運(yùn)輸痰標(biāo)本采集：即時(shí)痰、夜間痰、晨痰痰標(biāo)本保存：4℃保存運(yùn)輸（UN3373類包裝）：3天內(nèi)必