細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)課件

細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)

9/21/20231

細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)8/1/2細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)種類

細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)主要是對各種免疫細(xì)胞進(jìn)行分離、鑒定、計數(shù)，并測定其功能。

細(xì)胞分離技術(shù)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測T細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測B細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測NK細(xì)胞活性的檢測吞噬細(xì)胞檢測技術(shù)9/21/20232細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)種類細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)主要是對各種免第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離技術(shù)一、標(biāo)本的采取與保存二、細(xì)胞分離技術(shù)三、分離標(biāo)本的保存技術(shù)9/21/20233第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離技術(shù)一、標(biāo)本的采取與保存8/1/202第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)一、標(biāo)本的采取與保存（一）血液標(biāo)本的采取無菌采血，抗凝1、機(jī)械去纖維蛋白法（玻璃珠法）采血過程中，邊采邊搖采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滾動，以機(jī)械地除去纖維蛋白，使血液不能凝固。本法雖較麻煩，但本法簡便、對淋巴細(xì)胞的活性影響最小，且可減少血小板的混雜。2、肝素抗凝法

肝素能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，進(jìn)而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白，防止血液凝固。3、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝法EDTA為螯合劑，可與血液中鈣離子結(jié)合而抗凝。馬、牛、羊等大動物一般從頸靜脈采血，豬從頸靜脈、前腔靜脈或耳靜脈采血，家禽由翼下靜脈或心臟采血，兔由心臟或耳靜脈采血，犬由頸靜脈或四肢靜脈采血，豚鼠由心臟采血，小白鼠則可斷尾或剪斷腋下血管或剪斷眼球采血。馬、牛、羊等大動物一般從頸靜脈采血，豬從頸靜脈、前腔靜脈或耳靜脈采血，家禽由翼下靜脈或心臟采血，兔由心臟或耳靜脈采血，犬由頸靜脈或四肢靜脈采血，豚鼠由心臟采血，小白鼠則可斷尾或剪斷腋下血管或剪斷眼球采血。9/21/20234第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)一、標(biāo)本的采取與保存馬、牛、羊等大動物第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)一、標(biāo)本的采取與保存（二）胸腺細(xì)胞懸液的制備【方法】4周齡健康小鼠，體重14~16g。（1）小鼠頸椎脫臼處死。（2）迅速取出胸腺。置于100目鋼網(wǎng)上。注意無菌，洗干凈胸腺上的血管。（3）輕輕研磨，制成細(xì)胞懸液。（4）用臺盼藍(lán)染色，計數(shù)?；罴?xì)胞數(shù)＞90%?？匆曨l9/21/20235第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)一、標(biāo)本的采取與保存看視頻8/1/20第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)一、標(biāo)本的采取與保存（三）巨噬細(xì)胞的采取1、人巨噬細(xì)胞的收集（斑蝥酊敷貼法）2、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備【方法】20-25g小白鼠（1）小鼠頸椎脫臼處死（2）腹部消毒，無菌注入肝素-Hanks液（3）吸出腹腔液，洗滌，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度9/21/20236第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)一、標(biāo)本的采取與保存8/1/20236第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)二、細(xì)胞分離技術(shù)（一）外周血白細(xì)胞的分離

根據(jù)人外周血紅細(xì)胞與白細(xì)胞的比重不同，其沉降速度隨之而異。1、自然沉降法利用RBC自然沉降率較快的分離法。抗凝血于室溫或37℃靜置30~60分鐘，血液即分成明顯的3層：上層為淡黃色血漿，緊貼紅細(xì)胞上面的灰白層為白細(xì)胞底層為紅細(xì)胞本法所得的白細(xì)胞損傷極輕微。9/21/20237第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)二、細(xì)胞分離技術(shù)8/1/2023第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)一、標(biāo)本的采取與保存（一）外周血白細(xì)胞的分離2、加速紅細(xì)胞沉降法

利用高分子量的聚合物（明膠）使紅細(xì)胞凝聚成串錢狀，借以加速紅細(xì)胞沉降，使之快速與白細(xì)胞分離。上層富含白細(xì)胞紅細(xì)胞凝聚成串錢狀沉積在底層，本法的細(xì)胞得率比自然沉降法高，但明膠增加白細(xì)胞粘性，對實驗有所影響。9/21/20238第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)一、標(biāo)本的采取與保存8/1/20238第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)一、標(biāo)本的采取與保存（二）外周血單個核細(xì)胞的分離（PBMC）[基本原理]根據(jù)人類各種血細(xì)胞的比重有所不同，利用一種比重介于1.075~1.092之間而接近等滲的分層液作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞群按相應(yīng)密度梯度分布，從而得以分離各種血細(xì)胞群。

表7人外周血細(xì)胞密度一覽表—————————————————細(xì)胞密度（kg/m3）—————————————————紅細(xì)胞＞1.092粒細(xì)胞1.070~1.090淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞1.060~1.075血小板1.030~1.035—————————————————9/21/20239第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)一、標(biāo)本的采取與保存表第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)一、標(biāo)本的采取與保存（三）淋巴細(xì)胞及其亞群的分離1、淋巴細(xì)胞的分離①玻器吸附法將分離的單個核細(xì)胞傾于無菌潔凈的玻璃平皿內(nèi)，置37℃30min～40min，用毛細(xì)吸管輕輕吸取懸液，即為淋巴細(xì)胞。用適量的Hank’s液沖洗平皿，收獲即為單核細(xì)胞懸液。

②L-亮氨酸甲基酯法

單核-巨噬細(xì)胞內(nèi)富含溶酶體酶，它能攝取嗜溶酶體的L-亮氨酸甲基酯，集中于溶酶體上，使該酯轉(zhuǎn)化為對細(xì)胞本身有毒性的L-lencyl亮氨酸甲基酯，但不影響T、B、NK等細(xì)胞。用本法獲得的淋巴細(xì)胞純度大于99％，活力＞95％。9/21/202310第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)一、標(biāo)本的采取與保存8/1/20231第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)一、標(biāo)本的采取與保存（三）淋巴細(xì)胞及其亞群的分離

2、淋巴細(xì)胞亞群的分離根據(jù)表面的標(biāo)志不同，建立能選擇性純化所需細(xì)胞的技術(shù)。①E花環(huán)試驗分離T細(xì)胞群②尼龍毛分離方法分離T、B細(xì)胞③親和層析原理分離淋巴細(xì)胞亞群去除某一細(xì)胞群④熒光激活細(xì)胞分離儀（FACS）最佳分離方法磁性微球用于細(xì)胞的分離和純化（MACS技術(shù)）9/21/202311第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)一、標(biāo)本的采取與保存8/1/20231免疫磁性微球的分離原理

直接法對細(xì)胞進(jìn)行分類抗CD3磁球磁球結(jié)合T細(xì)胞加入B和T細(xì)胞中負(fù)向選擇正向選擇磁架進(jìn)行分離間接法對T細(xì)胞進(jìn)行分離單克隆抗體CD3羊抗鼠修飾磁球BiomagT細(xì)胞T細(xì)胞9/21/202312免疫磁性微球的分離原理

直接法對細(xì)胞進(jìn)行分類抗CD3磁球磁球第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)三、分離標(biāo)本的保存技術(shù)液氮深低溫（－196℃）保存技術(shù)

但降溫過程由于冰晶的形成和滲透壓的改變，可導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和部分死亡。因此在冷凍過程要加冷凍保存劑，常用二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)。1、冷凍保存

將待凍細(xì)胞懸液加冷凍保存劑，并配成適當(dāng)濃度，分裝小管。采用兩步降溫法，即及時迅速地將其降溫至一選擇好的臨界低溫作為過渡站，如一80℃低溫冰箱過夜，或放在液氮罐液面以上一層空間15~20h，然后再移放或沉入液氮中。2、復(fù)蘇

復(fù)蘇解凍必須迅速，力爭在20s內(nèi)使細(xì)胞完全融化。從液氮中取出后迅速移至40℃溫水中，融化后要充分洗滌重懸于新鮮培養(yǎng)液中，使細(xì)胞恢復(fù)活力。9/21/202313第一節(jié)細(xì)胞的分離技術(shù)三、分離標(biāo)本的保存技術(shù)8/1/2023第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測

一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測

（一）T淋巴細(xì)胞受體的檢測1、E受體的檢測

（現(xiàn)多用于分離T細(xì)胞）2、白細(xì)胞介素-2受體的檢測

T細(xì)胞激活的特征

（多采用免疫組化學(xué)法）

9/21/202314第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（二）表面抗原的檢測

用單抗檢測T細(xì)胞表面抗原方法：標(biāo)記抗體著染法抗體致敏花環(huán)法

1、間接免疫熒光法

淋巴細(xì)胞+抗相應(yīng)CD的單抗→洗滌→再加熒光二抗→洗滌→取樣制片→熒光顯微鏡觀察計數(shù)l00~200個淋巴細(xì)胞，以熒光陽性細(xì)胞與計數(shù)細(xì)胞總數(shù)之比為相應(yīng)CD抗原陽性的T細(xì)胞百分率。9/21/202315第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（二）表面抗原的檢測

2、抗體致敏細(xì)胞花環(huán)法

淋巴細(xì)胞懸液+抗CD抗體致敏的RBC懸液→置室溫片刻，經(jīng)低速離心→移放室溫1小時/4℃過夜后→重懸取樣涂片染色鏡檢共計100~200個淋巴細(xì)胞，以花環(huán)形成細(xì)胞數(shù)與計數(shù)細(xì)胞總數(shù)之比為相應(yīng)CD抗原陽性細(xì)胞的百分率。9/21/202316第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（三）T細(xì)胞功能的檢測

1、T細(xì)胞增殖試驗（T細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗）判斷T細(xì)胞功能的一項非特異性體外免疫學(xué)檢測指標(biāo)。[基本原理]在體外T細(xì)胞與刺激物共育后，細(xì)胞代謝和形態(tài)相繼會發(fā)生一系列的變化，在24~48h內(nèi)，蛋白質(zhì)和核酸合成增加，最終T細(xì)胞呈母細(xì)胞化，出現(xiàn)分裂增殖現(xiàn)象。有形態(tài)計數(shù)法和放射性核素計數(shù)法兩種9/21/202317第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（三）T細(xì)胞功能的檢測

2、T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒（LMC）試驗評價機(jī)體細(xì)胞免疫水平的一種常用指標(biāo)，腫瘤患者的判斷預(yù)后和觀察療效的指標(biāo)之一。

（1）形態(tài)學(xué)檢查法

淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞→混合共溫培養(yǎng)后→瑞氏染色→光鏡計數(shù)殘留的腫瘤細(xì)胞數(shù)，計算殺傷率。

本法不需特殊設(shè)備，操作較方便，但敏感性較差，不能確切反映細(xì)胞的損傷和死亡9/21/202318第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（三）T細(xì)胞功能的檢測

2、T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒（LMC）試驗（2）放射性核素法一般采用125I-UdR摻入法或51Cr釋放法。

9/21/202319第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測一、T細(xì)胞標(biāo)志及功能的第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測二、B細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（一）受體的檢測

SmIg標(biāo)志的檢測多采用間接熒光免疫法或酶免疫組織化學(xué)法（二）表面抗原的檢測用相應(yīng)的CD系列單抗，用熒光免疫、酶免疫組織化學(xué)技術(shù)加以檢測CDl9、CD20、CD22、CD27等抗原9/21/202320第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測二、B細(xì)胞標(biāo)志及功能的第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測二、B細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（三）B細(xì)胞功能的檢測1、血清中免疫球蛋白含量測定檢測方法：瓊脂單向擴(kuò)散試驗，方法較粗糙；現(xiàn)用ICS儀作自動速率散射比濁法，迅速可靠。9/21/202321第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測二、B細(xì)胞標(biāo)志及功能的9/21/2023228/1/202322第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測二、B細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（三）B細(xì)胞功能的檢測

2、細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的體外試驗檢測B細(xì)胞體外產(chǎn)生抗體的能力，不僅可以了解B細(xì)胞功能，還可研究B細(xì)胞分化增殖所需的條件，以及T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等與B細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)機(jī)制。

9/21/202323第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測二、B細(xì)胞標(biāo)志及功能的第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測二、B細(xì)胞標(biāo)志及功能的檢測（三）B細(xì)胞功能的檢測

2、細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力的體外試驗（1）溶血空斑技術(shù)又稱空斑形成細(xì)胞試驗[基本原理]用SRBC免疫動物不同天數(shù)后，取脾臟制成細(xì)胞懸液。將其與SRBC在半固體瓊脂凝膠內(nèi)混合，傾注于平皿或玻片上使成薄層，置37℃溫育?？贵w生成細(xì)胞可釋放抗SRBC抗體，后者與周圍SRBC結(jié)合使補(bǔ)體活化而產(chǎn)生溶血，在細(xì)胞周圍形成一個肉眼可見的透明溶血區(qū)，稱為溶血斑。每個空斑表示一個抗體生成細(xì)胞。9/21/202324第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測二、B細(xì)胞標(biāo)志及功能的9/21/2023258/1/202325第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測三、NK細(xì)胞活性的檢測（一）NK細(xì)胞活性檢測的方法

1、形態(tài)學(xué)檢測法[基本原理]將效-靶細(xì)胞按一定比例混合共溫后，用臺盼藍(lán)、伊紅丫等（活細(xì)胞拒染）染料染色，分別計數(shù)著染的死細(xì)胞和不著染的活細(xì)胞，由此推算NK細(xì)胞的殺傷活性。用臺盼藍(lán)染色，須在3min內(nèi)完成計數(shù)，否則活細(xì)胞也將開始攝取染料而著染。伊紅丫染色在1~10min內(nèi)，死、活細(xì)胞比例不變。本法簡便易于掌握，但主觀因素較大，也無法計出遭輕微損傷的細(xì)胞。9/21/202326第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測三、NK細(xì)胞活性的檢測第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測三、NK細(xì)胞活性的檢測（一）NK細(xì)胞活性檢測的方法

2、酶釋放檢測法[基本原理]將效-靶細(xì)胞共育一段時間后，根據(jù)靶細(xì)胞破壞后釋放的酶量推斷死亡的細(xì)胞數(shù)。通常以乳酸脫氫酶和堿性磷酸酶為檢測指標(biāo)。取共育后離心的上清液，加酶底物顯色。根據(jù)光密度的變化確定酶含量的多少。[特點]經(jīng)濟(jì)、快速、簡便，可定量。[影響因素]有培養(yǎng)液、pH、溫度以及終止反應(yīng)的時間等。實際操作時要嚴(yán)格掌握條件9/21/202327第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測三、NK細(xì)胞活性的檢測第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測三、NK細(xì)胞活性的檢測（二）NK細(xì)胞活性檢測的臨床意義臨床的輔助診斷以及判斷預(yù)后，考核療效9/21/202328第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測三、NK細(xì)胞活性的檢測第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測四、吞噬細(xì)胞檢測技術(shù)（一）中性粒細(xì)胞的檢測

中性粒細(xì)胞的檢測包括數(shù)量、細(xì)胞運動功能以及吞噬和殺菌功能的檢測。1、中性粒細(xì)胞吞噬和殺菌功能的檢測受檢細(xì)胞懸液內(nèi)按一定比例加入活的白色念珠菌懸液，混合保溫后，加亞甲藍(lán)(美藍(lán))溶液作活體染色，取樣涂片作光鏡檢查。如胞內(nèi)白色念珠菌呈藍(lán)色，表示該菌已被殺死，共計100~200個細(xì)胞，分別求其吞噬率①和殺菌率②。9/21/202329第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測四、吞噬細(xì)胞檢測技術(shù)8第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測四、吞噬細(xì)胞檢測技術(shù)（一）中性粒細(xì)胞的檢測

中性粒細(xì)胞的檢測包括數(shù)量、細(xì)胞運動功能以及吞噬和殺菌功能的檢測。1、中性粒細(xì)胞吞噬和殺菌功能的檢測正常情況下，對大腸桿菌的殺菌率＞90％，對金黃色葡萄球菌的殺菌率＞85％

9/21/202330第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測四、吞噬細(xì)胞檢測技術(shù)8第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測四、吞噬細(xì)胞檢測技術(shù)（二）巨噬細(xì)胞功能的檢測巨噬細(xì)胞功能的檢測包括有炭粒廓清試驗、吞噬功能檢測、溶酶體酶的測定、巨噬細(xì)胞促凝血活性測定，以及分泌功能和表面標(biāo)志檢測等。9/21/202331第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測四、吞噬細(xì)胞檢測技術(shù)8第二節(jié)免疫細(xì)胞表面標(biāo)志和功能的檢測四、吞噬細(xì)胞檢測技術(shù)（二）巨噬細(xì)胞