蛇龍珠自然發(fā)酵過程酵母菌的種類和動態(tài)變化

蛇龍珠自然發(fā)酵過程酵母菌的種類和動態(tài)變化宋育陽，裴穎芳，劉延琳*(西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌712100)摘要:利用WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，對蛇龍珠CarbernetGernischet葡萄酒自然發(fā)酵不同階段分離的94株酵母菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，供試酵母菌屬于4個屬5個種：釀酒酵母Saccharomycescerevisiae、葡萄汁有抱漢遜酵母Hanseniasporauvarum、季也蒙有抱漢遜酵母Hanseniasporaguilliermondii、克魯維畢赤酵母Pichiakluyver和假絲酵母Candidazemplinin，分別占分離總菌株的68%、1.06%、6.38%、19.15%、5.41%。關(guān)鍵詞：葡萄酒；酵母鑒定；自然發(fā)酵SpeciesofYeastsandtheDynamicChangesduringSpontaneous

FermentationRelatedtoCarbernetGernischetSongYuyang,PeiYingfang,LiuYanlin*(CollegeofEnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shannxi,712100China)Abstract94yeastsisolatedfromspontaneousfermentationofCarbernetGernischetwereidentifiedprimarilyonWallersteinLaboratoryNutrientAgar(WLagar).FivespeciesoffourgenerabelongingmainlytoSaccharomycescerevisiae、Hanseniasporauvarum>Hanseniasporaguilliermondii、PichiakluyverandCandidazemplininwerefoundamongallstains,withproportionof68%、1.06%、6.38%、19.15%、5.41%respectively.Keywords:wine;yeastidentification;spontaneousfermentation葡萄酒發(fā)酵過程是一個復(fù)雜的生態(tài)和生化過程，包含不同酵母屬種此消彼長的變化。多種酵母在發(fā)酵過程中的相互協(xié)作，可以有效地增加葡萄酒風(fēng)味的多樣性［1］，但也可能影響葡萄酒質(zhì)量的穩(wěn)定性⑵。研究發(fā)酵過程中酵母菌的動態(tài)變化，揭示在發(fā)酵不同階段酵母菌的消長規(guī)律，有利于葡萄酒發(fā)酵過程中的微生物學(xué)控制，也可以為研究酵母菌對葡萄酒風(fēng)味的影響提供依據(jù)⑶。一種快速準(zhǔn)確的身份識別手段正成為酵母使用者和生產(chǎn)者必須考慮的因素［4.5］。要達(dá)到快速簡便的監(jiān)測發(fā)酵過程中的微生物變化，Wallerstein實驗室設(shè)計了一種觀測釀造和工業(yè)發(fā)酵過程中微生物種群的非選擇型培養(yǎng)基一WL營養(yǎng)培養(yǎng)基(Wallersteinlaboratorynutrientagar)［6］，可用來區(qū)分和鑒定一些常見的葡萄酒相關(guān)酵母。研究表明葡萄酒自然發(fā)酵過程中出現(xiàn)的大多數(shù)典型的酵母菌都可以基于其在WL培養(yǎng)基上生長所形成的菌落顏色及形態(tài)進(jìn)行歸類和區(qū)別［6-8］，并通過分子方法驗證了其結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究利用WL營養(yǎng)瓊脂對寧夏蛇龍珠葡萄自然發(fā)酵不同階段分離的酵母進(jìn)行分類，觀察了發(fā)酵過程中菌群種類和變化，旨在揭示寧夏葡萄自然發(fā)酵過程中酵母菌的消長規(guī)律。為發(fā)酵工業(yè)的微生物控制及后續(xù)研究提供依據(jù)。1材料和方法［基金項目］國家葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項經(jīng)費資助*［通訊作者］劉延琳，［作者間介］宋育陽(1983-)，女，浙江余姚市人，碩士研究生，主要從事釀酒微生物研究。E-mail:*［通訊作者］劉延琳，E-mail:lylsun@1.1材料：1.1.1菌株：寧夏蛇龍珠葡萄品種自然發(fā)酵過程中分離的酵母菌株。1.1.2分離用培養(yǎng)基YPD培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，pH值自然，121°C滅菌20min,添加100mg/L的氯霉素以排除細(xì)菌的干擾。固體培養(yǎng)基可加入2%瓊脂。酵母菌株的初步形態(tài)分類用WL營養(yǎng)培養(yǎng)基［調(diào)pH至6.5,121C滅菌20min。1.2方法1.2.1菌株分離將成熟果粒破碎、帶皮進(jìn)行自然發(fā)酵。分別在葡萄酒發(fā)酵的初期、中期、后期3個時期取樣。采來的樣用稀釋梯度涂布法接種于固體YPD培養(yǎng)基上，在28C下培養(yǎng)3d,然后根據(jù)菌落顏色及形態(tài)，每平板選擇15?20個單菌落在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1d，活化的菌液與30%的無菌甘油以1：1混合于1.5mL離心管中，-70C下保藏。1.2.2菌株的WL培養(yǎng)基聚類分析將保藏的酵母菌株用液體YPD培養(yǎng)基活化后，劃線接種于WL培養(yǎng)基上，28C培養(yǎng)5?7d后，觀察記錄菌落的顏色和形態(tài)，并根據(jù)菌落的顏色和形態(tài)進(jìn)行聚類。2結(jié)果與分析2.1葡萄酒自然發(fā)酵中酵母菌的種類表1蛇龍珠自然發(fā)酵分離菌株WL形態(tài)描述鑒定Tab.1DescriptionsofyeastcoloniesonWLmediumseparatingfromCarbernetGernischet菌株Strain菌落顏色ColonycolorWL形態(tài)描述ColonyonWL培養(yǎng)類型TypeSs1-15深綠色I(xiàn)ntensegreen扁平，表面光滑，不透明，黃油狀Flat,smooth,opaque,consistencyofbutter葡萄汁有抱漢遜酵母HanseniasporauvarumS1-2,S1-4,S1-6?S1-10,S1-13,S1-15,S2-2白色帶淡綠色表面褶皺，粗糙，扁平畢赤克魯維S2-4,S2-5,S2-7,S2-8,S3-3,Ss3-7,Ss3-13,Ss3-22WhitewithpalegreenWrinklesurface,roughness,flatPichiakluyveriSs1-7,S2-11,Ss3-15,Ss3-20,SS3-21中央深綠色泛白Greenwithwhiteincenter四周淺黃色透明，扁平，表面光滑transparentyellowaround,flat,smooth季也蒙有抱漢遜酵母HanseniasporaguilliermondiiS1-1,S1-3,S1-5,S1-11?S1-13,S2-1?S2-4奶油色帶綠色球形突起，表面光滑，不透明，奶釀酒酵母S2-6,S2-9,S2-10,S2-12,S3-1?S3-9,S3-11Ss1-1?Ss1-6,Ss1-8,Ss1-10?Ss1-14,Ss1-16,Ss1-18,Ss2-1?Ss2-4,Ss2-6?Ss2-8,Ss2-10,Ss2-13,Ss2-14,Ss3-2,Ss3-3,Ss3-5,Ss3-6,Ss3-8?Ss3-14,Ss3-16?Ss3-19Creamtogreen油狀Knobike,surface,smooth,opaque,consistencyofcreamSaccharomycescerevisiaeS3-10，Ss2-5，Ss2-9，Ss2-11，Ss2-15中央奶油色邊緣綠色Creamandgreenfrink扁平，光滑，不透明Flatsurface:smooth,opaque假絲酵母Candidazemplinina注：Ss、自然發(fā)酵時添加SO2(40mg/L)；S、自然發(fā)酵未添加SO2;1、2、3為發(fā)酵的初期、中期、后期Note：Ss、fermentation,addSO2(40mg/L);S、fermentation,notaddSO?.】，2，3：theearlystage，middlestage，endstageofthespontaneousfermentation本研究在蛇龍珠發(fā)酵的初、中、后期總共分離得到94株葡萄酒相關(guān)酵母菌。利用WL培養(yǎng)基對自然發(fā)酵過程中分離的酵母菌的培養(yǎng)形態(tài)進(jìn)行觀察，參照Christina實驗結(jié)果⑹及楊瑩等［7］對WL培養(yǎng)基類型的描述以及分子生物學(xué)驗證鑒定結(jié)果，將分離獲得的菌株分為五種不同的培養(yǎng)類型(表1)，分別是釀酒酵母Saccharomycescerevisiae、葡萄汁有抱漢遜酵母Hanseniasporauvarum、季也蒙有抱漢遜酵母Hanseniasporaguilliermondii、克魯維畢赤酵母Pichiakluyver和假絲酵母Candidazemplinin。分別占到了分離總菌株的68%、1.06%、6.38%、19.15%、5.41%。2.2自然發(fā)酵過程中酵母菌群的變化自然發(fā)酵過程中，酵母種類會隨發(fā)酵時間有規(guī)律地消長。本試驗在自然發(fā)酵各時期出現(xiàn)的酵母菌中，發(fā)酵初期分離得到了S.cerevisiae^H.uvarum、H.guilliermondii和P.kluyver；自然發(fā)酵中期和后期出現(xiàn)的類型有S.cerevisiae^H.guilliermondii、P.kluyver和C.zemplinin，其比例詳見表2。本研究在自然發(fā)酵初期監(jiān)測到的菌種有H.uvarum、H.guilliermondii、S.cerevisiae、Pkluyver為發(fā)酵的啟動菌種，其中S.cerevisiae和Pkluyver為啟動發(fā)酵的主要菌種。隨著發(fā)酵過程中乙醇的產(chǎn)生，這些非釀酒酵母開始逐漸減少和死亡，3-4天后，到發(fā)酵中期監(jiān)測到H.uvarum死亡，但H.guilliermondii數(shù)量增多，P.kluyver比初期的含量有所下降，同時S.cerevisiae由于其良好的酒精耐受力而在發(fā)酵液中占主導(dǎo)地位，中期還分離得到C.zemplinin。到發(fā)酵后期S.cerevisiae成為主要發(fā)酵群體。結(jié)合表2可以看出，在發(fā)酵前期，啟動發(fā)酵的有一些非酵母屬酵母，隨著發(fā)酵的進(jìn)行和酒度的升高，能分離到的主要是較耐酒精的酵母，但以釀酒酵母占絕對優(yōu)勢，這也與釀酒酵母是酒精生產(chǎn)和果汁發(fā)酵釀酒的主要菌種的結(jié)果相符［9］。表2 發(fā)酵各階段酵母菌種類、數(shù)量和比例Table2Speciesandproportionofyeastindifferentstageofmustfermentation分離源：蛇龍珠自然發(fā)酵醪From:spontaneousfermentingmash分離源：添加40mg/LSO2的蛇龍珠自然發(fā)酵醪From:fermentingmashsupplementedwith40mg/LSO2種名Nameofspecies酵母數(shù)量:株數(shù)(比例/%)Yeaststrainnumber/(Proportion%)酵母數(shù)量:株數(shù)(比例/%)Yeaststrainnumber/(Proportion%)發(fā)酵前期Beginningstage發(fā)酵中期Middlestage發(fā)酵末期Finalstage發(fā)酵前期Beginningstage發(fā)酵中期Middlestage發(fā)酵末期FinalstageS.cerevisiae6/(40)8/(61.5)10/(91)14/(87.5)11/(64.7)15/(68.2)H.uvarum———1/(6.25)——H.guilliermondii———1/(6.25)2/(11.8)3/(13.6)P.kluyver9/(60)5/(38.5)1/(9)——3/(13.6)C.zemplinina————4/(23.5)1/(4.6)注：一未檢出Note：—nodetected2.3SO2S自然發(fā)酵中對酵母種類的影響從表2可以看出，在添加，。2的情況下，對SO2不太敏感的C.zemplinina在發(fā)酵中后期都分離得到。在未添加SO2時，P.kluyver在發(fā)酵前期濃度較大，發(fā)酵活性較高，為啟動發(fā)酵的主要菌種，添加SO2后，P.kluyver數(shù)量被抑制，但隨著游離SO2降低，其數(shù)量有所上升。而對SO2敏感的H.uvarum在發(fā)酵的中后期未分離到，H.guilliermondii在發(fā)酵中期游離，。2降低得比較多的時候數(shù)量有所上升。進(jìn)入發(fā)酵中期直至發(fā)酵末期，絕大部分酵母為釀酒酵母。不過發(fā)酵末期從葡萄醪中還能分離到耐SO2和酒精的C.zemplinina。本實驗中，在加入40mg/LSO^然發(fā)酵初期分離到的S.cerevisiae占初期分離酵母的87.5%，而在未加，。2的自然發(fā)酵初期S.cerevisiae僅占到40%，發(fā)酵初期添加SO2的發(fā)酵醪中S.cerevisiae的數(shù)量是未添加SO2時的1倍以上。無論是否添加SO2,發(fā)酵后期都是釀酒酵母S.cerevisiae占據(jù)主導(dǎo)地位。3討論WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(wallersteinlaboratorynutrientagar)最初被設(shè)計用來檢測飲料中微生物菌群，隨后，在葡萄酒相關(guān)酵母的鑒定中證實，其對葡萄汁自然發(fā)酵過程中出現(xiàn)的絕大多數(shù)菌種具有很好的鑒別力[12]可以簡化后續(xù)分子鑒定的程序，同時可以避免生理生化分析很大的工作量，作為酵母菌鑒定的輔助手段。WL營養(yǎng)瓊脂是相當(dāng)簡便、快速并且十分有效和節(jié)儉的方法。根據(jù)酵母菌落在WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上顏色和形態(tài)的不同可以把大多數(shù)酵母菌區(qū)分開來。本研究結(jié)果為篩選適合該產(chǎn)區(qū)葡萄酒生產(chǎn)的優(yōu)良釀酒酵母菌種奠定了基礎(chǔ)，但有關(guān)該產(chǎn)區(qū)野生酵母的發(fā)酵特性及其利用價值還需做進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：SpencerJFT,RagoutAL,SpencerCL.Non-conventionalyeasts.AppliedMicrobiolBiotechnol,2002,58:147156.⑵張紅梅，郭俊艷，于蓮波.葡萄酒的生產(chǎn)及對微生物的控制.食品工業(yè)，2003(4):27-28.[3]SchullerD,ValeroE,DequinS.Surveyofmolecularmethodsforthetypingofwineyeaststrains.FEMSMicrobiology,2004,231:19-26.[4]Deltell，張利中，郭永亮.酵母選用與接種技術(shù)在葡萄酒生產(chǎn)中的實踐意義中外葡萄與葡萄酒，2003,(3):39-43.LavalleeF,SalvasYPCRandDNAfingerprintingusedasqualitycontrolintheproductionofwineyeaststrains.EnologyViticulture,1994,45:86-9