第二章 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)DNA2

第二章遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)一．遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)ThetransformingprincipleisDNA.ThegeneticmaterialofphageT2isDNA.二．核酸的結(jié)構(gòu)及理化特性以四種堿基構(gòu)成的脫氧核苷酸或核苷酸為基本單位通過3，5-磷酸二酯鍵連接成鏈狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成其一級結(jié)構(gòu)DNA的一級結(jié)構(gòu)中，有一些堿基可以通過加上一個甲基而被修飾，稱為DNA的甲基化(mythylationofDNA)。

1）原核生物（細(xì)菌）有限制一修飾系統(tǒng)①對自身DNA產(chǎn)生保護作用。

②抵御外源DNA（噬菌體）的入侵。

2）真核生物中的DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控中有重要作用NucleicAcidStructureDNAdoublehelixWatsonandCrick,1953.TwoseparatestrandsAntiparellel(5’

3’direction)Complementary(sequence)Basepairing:hydrogenbondingthatholdstwostrandstogetherEssentialforreplicatingDNAandtranscribingRNASugar-phosphatebackbones(negativelycharged):outsidePlannerbases(stackoneabovetheother):inside三級結(jié)構(gòu)：即超螺旋結(jié)構(gòu)（Supercoiling）三鏈、四鏈結(jié)構(gòu)：三鏈DNA、端粒RNA結(jié)構(gòu):

許多RNA分子以一單鏈狀態(tài)存在,其通過分子內(nèi)堿基的配對和相互之間的氫鍵結(jié)合，形成復(fù)雜構(gòu)像，而這種復(fù)雜性反映在細(xì)胞中RNA分子呈現(xiàn)不同角色的變化中。tRNARibozymeRNArRNA核酸的理化性質(zhì)物理性質(zhì)：a.核酸具有高度的粘性，這主要是因為其有高螺旋率和相對僵硬的緣故；b.其浮力密度為1.7g/cm-3，可通過密度梯度離心獲得DNA；c.核酸具有旋光性和熱特性，DNA和RNA的最大吸收波長均為260nm（用于定性定量檢測核酸，測定核酸純度），減色現(xiàn)象：雙鏈DNA與單鏈DNA或RNA以及單個核苷酸相比，表現(xiàn)為著色不足，因此對紫外線吸收的程度是dsDNA<ssDNA/RNA<nucleotide.在加熱的情況下DNA會發(fā)生變性成單鏈，溫度降低又可復(fù)性（回復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu)）。d.超螺旋：非正常的螺旋狀態(tài)，其中負(fù)超螺旋是進行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)，約占整個DNA的5%?；瘜W(xué)性質(zhì)：在pH4-11范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，過酸或過堿都會使其變性。堿變性提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA即是基于此原理。（一）核酸擴增、雜交變性，復(fù)性——PCR的依據(jù)解鏈溫度雜交——southern，northern，而westernblot雖與上述雜交相似，但所依據(jù)原理不同C0t1/2是指什么?三、核酸擴增雜交基礎(chǔ)及測序核酸分子雜交的基本原理

具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。探針帶有供反應(yīng)后檢測的合適標(biāo)記物，并僅與特異靶分子反應(yīng)。雜交有固液相雜交和液相雜交。變性復(fù)性DNA-DNA雜交雙鏈分子DNA變性與復(fù)性

1、DNA變性

（1）定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性（2）變性的方法：

a.熱變性：溫度升高到90~100℃時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵完全斷裂。

b.酸堿變性：pH值低于3或高于10時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。

c.化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。(3)變性后的理化性質(zhì)變化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加(4)DNA變性曲線AT區(qū)先解鏈GC區(qū)后解鏈階梯式曲線(5)GC含量與Tm值之間的關(guān)系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.32、復(fù)性

（1）定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。（2）復(fù)性過程A.單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈B.局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離C.局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列D.形成完整的雙鏈分子3、核酸變性后的復(fù)性速度取決于核酸分子的復(fù)雜性：（1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長度（2）Cot?與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成正比（3）兩個DNA樣品濃度絕對一致時，變性后的相對雜交率取決于DNA的相對復(fù)雜性Southern印跡雜交1、待測核酸樣品的制備

（1）裂解或破碎細(xì)胞

（2）抽取純化基因組DNA

（3）限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段雜交舉例2、待測DNA樣品的電泳分離

（1）瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠分離小片段用高濃度膠（2）凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子

DNA泳動慢,小分子DNA泳動快，大小相同的分子處于同一條帶

（3）分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)HindⅢ消化的λDNA，雜交所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記

3、凝膠中核酸的變性（堿變性）凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的單鏈DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液

4、Southern印跡根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由E.Southern于1975年首先設(shè)計出來的，故又叫SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片

5、Southern雜交

（1）預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液

（2）雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交

（3）洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的DNA

6、雜交結(jié)果檢測（1）放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針（2）比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標(biāo)記的探針SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片

水稻（OryzasativaL.)的葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標(biāo)記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶，表明含有水稻的psbA基因序列。Southern雜交分析示例

A.DNA體外重組實驗

B.抗生素篩選轉(zhuǎn)化子細(xì)胞

C.培養(yǎng)突變株細(xì)胞

D.Southern雜交實驗結(jié)果顯示，外源目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入突變株細(xì)胞中1973年，由美國斯坦福大學(xué)教授Cohn和美國加州大學(xué)教授Boyer帶領(lǐng)各自的研究組幾乎同時分別完成了DNA體外重組，一舉打開了基因工程學(xué)大門。Northern印跡雜交1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，與薩瑟恩DNA印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做諾賽恩RNA印跡技術(shù)（Northernblotting）。1、基本原理和基本過程與Southernblot基本相同2、鑒別RNA3、探針可用DNA或RNA片段4、待測樣品為總RNA或mRNANorthern印跡與Southern印跡的不同點

1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性

2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern印跡時，DNA轉(zhuǎn)膜前需進行堿變性及中和處理

3、靶核酸為RNADNA芯片（基因芯片）DNA芯片（DNAchip）技術(shù)，實際上就是利用核酸雜交的原理，將不同序列的DNA片段（探針）印記到小玻片或相應(yīng)介質(zhì)上，然后將待檢測DNA（帶有標(biāo)記）液與之孵育，經(jīng)洗脫后，檢測最終能夠發(fā)生結(jié)合的DNA，從而判定待檢測DNA序列的技術(shù)。（二）核酸測序Sanger的酶學(xué)測序原理

Gilbert的化學(xué)測序法自動測序儀的發(fā)明DNA序列測定常用方法有如下3種：1、末端終止法2、化學(xué)裂解法3、DNA測序自動化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長度僅相差1個核苷酸的ssDNA，從而完成測序的方法。用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標(biāo)記，計算機自動讀出。優(yōu)點簡便、迅速、應(yīng)用廣泛。不需酶促反應(yīng)，可以對寡核苷酸測序。1、高負(fù)荷，1塊膠可測16個樣品；2、機讀不需放射自顯影；3、安全不用同位素；4、簡單迅速8-10h。測序