《細(xì)胞生物學(xué)》教案-細(xì)胞2章細(xì)胞生物學(xué)研究方法-2

PAGE《細(xì)胞生物學(xué)》教案 （第2次課2學(xué)時(shí)）第二章細(xì)胞生物學(xué)研究方法（Chapter3.TechniquesinCellBiology）[教學(xué)要求]2.1知識(shí)目標(biāo)1.對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的研究手段和方法進(jìn)行初步了解，對(duì)不同的研究方法和手段在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用有初步的認(rèn)識(shí)；2.掌握光學(xué)顯微鏡的成像原理；3.通過(guò)實(shí)驗(yàn)課了解和掌握光學(xué)顯微鏡各部分的結(jié)構(gòu)和功能,，并學(xué)習(xí)正確使用光學(xué)顯微鏡的方法及維護(hù)常識(shí)。2.2能力目標(biāo)1.通過(guò)實(shí)際操作掌握普通光學(xué)顯微鏡的使用；2.通過(guò)實(shí)際操作掌握熒光顯微鏡的使用。2.3德育目標(biāo)1.要研究一個(gè)細(xì)胞生物學(xué)的問(wèn)題，首先要從全局給出一個(gè)基本的程序，引導(dǎo)學(xué)生考慮問(wèn)題要細(xì)致、全面、嚴(yán)謹(jǐn)；2.整個(gè)過(guò)程需要查閱文獻(xiàn)，分析總結(jié)，利用適合的儀器、技術(shù)等，才能得出可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，引導(dǎo)學(xué)生意識(shí)到查閱文獻(xiàn)的重要性，各種技術(shù)學(xué)習(xí)的重要性。[教學(xué)重點(diǎn)]儀器方法的基本原理和基本應(yīng)用[教學(xué)難點(diǎn)]電鏡制樣及分子雜交技術(shù)[教學(xué)時(shí)數(shù)]2學(xué)時(shí)[主要內(nèi)容]第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細(xì)胞及其組分的分析方法[參考資料]翟中和．細(xì)胞生物學(xué)，第五版．北京：高等教育出版社，2020．[教學(xué)內(nèi)容]這章主要講的是關(guān)于細(xì)胞生物學(xué)的一些技術(shù)問(wèn)題，廣義上從方法學(xué)上來(lái)說(shuō)，包括研究細(xì)胞生物學(xué)的一個(gè)問(wèn)題時(shí)如何設(shè)計(jì)，有一個(gè)基本的程序。preparatoryobserve：預(yù)先的觀察或者對(duì)你感興趣的問(wèn)題有一個(gè)靈感；putforwardtheoretics:你想探索這個(gè)問(wèn)題，你應(yīng)該做一個(gè)估計(jì)，用什么樣的假說(shuō)可以說(shuō)明這個(gè)問(wèn)題；designcontroltests:有了假說(shuō)，就要考慮如何設(shè)計(jì)這個(gè)實(shí)驗(yàn)，我想驗(yàn)證這個(gè)假說(shuō)，如何設(shè)計(jì)對(duì)照，即control；collectdata:有了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的想法后，開始收集資料；explainresults:大量資料積累后，就應(yīng)該做結(jié)果的分析；deviseconclusion:結(jié)果分析后，得到一個(gè)結(jié)論；在這個(gè)流程當(dāng)中，有兩個(gè)重要的問(wèn)題，你感興趣的問(wèn)題提出后，做了初步的觀察，然后開始設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程的時(shí)候，你應(yīng)該先查文獻(xiàn)（可能你孤陋寡聞，沒看到別人做過(guò)；可能別人已經(jīng)做了，paper也發(fā)了；可能別人沒做過(guò)），積累了大量的data，做出了分析，然后準(zhǔn)備寫文章了，要對(duì)你做出的data和分析，做文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，如果你的data和別人的并不完全一樣，但是結(jié)論跟別人是重復(fù)的，實(shí)際上你的文章意義并不大，因此這兩個(gè)階段的文獻(xiàn)復(fù)習(xí)對(duì)大家以后做研究工作是非常重要的問(wèn)題。那么從這樣一個(gè)程序，通過(guò)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)的操作，最后分析得到的結(jié)論，整個(gè)過(guò)程，data的收集（第二個(gè)重要的問(wèn)題就是方法學(xué)的問(wèn)題），你用什么樣的方法收集到這些數(shù)據(jù)，這就涉及到一個(gè)文章的技術(shù)含量高低的問(wèn)題，因此從整個(gè)細(xì)胞生物學(xué)研究的方法來(lái)說(shuō)，雖然不是靠講來(lái)解決的，但是思想里面，在學(xué)習(xí)一個(gè)課程，在科學(xué)研究中，這個(gè)問(wèn)題是個(gè)很重要的問(wèn)題，你怎樣設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，提出問(wèn)題，最后解決了問(wèn)題，得出了結(jié)論，對(duì)結(jié)論的可靠性你怎么做分析，因?yàn)橄襁@類實(shí)驗(yàn)，特別是生命科學(xué)，它是靠實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)話的，越復(fù)雜的問(wèn)題，越?jīng)]法回答，你只能根據(jù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)某一個(gè)問(wèn)題得到局部的解析，這里可能有一些同學(xué)要問(wèn)了，現(xiàn)在本科生強(qiáng)調(diào)創(chuàng)新思維的訓(xùn)練，本科做畢業(yè)論文，參加科研項(xiàng)目，都要做實(shí)驗(yàn)，這就涉及到你如何評(píng)判自己實(shí)驗(yàn)當(dāng)中得到的階段性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的問(wèn)題，有些同學(xué)發(fā)表文章的心很急切，做了一些實(shí)驗(yàn)，做生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)照（陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照）是最關(guān)鍵的，你能不能做好實(shí)驗(yàn)對(duì)照，不然你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒法說(shuō)明問(wèn)題。同樣的實(shí)驗(yàn)第一次結(jié)果為+，第二次結(jié)果為-，你只能做第三次+，再做第四次+，第二次的實(shí)驗(yàn)可能是操作或其他條件出了問(wèn)題，你討論這個(gè)問(wèn)題時(shí)才是有根據(jù)的。學(xué)習(xí)本章內(nèi)容對(duì)學(xué)生的要求：了解細(xì)胞生物學(xué)里有哪些方法；這些方法能解決一個(gè)什么樣的問(wèn)題?；局R(shí)：顯微鏡與分辨率明視距離：物體在人眼視網(wǎng)膜上成像的大小和物體與眼睛的距離有關(guān)。物體離眼睛的距離越近，視網(wǎng)膜上的物象就越大，但眼睛的曲光度就隨之增大，眼部肌肉就越發(fā)疲勞。經(jīng)測(cè)試在物體離人眼25cm時(shí)，看物體又清楚，眼肌也不疲勞，因此把人眼正常工作距離定為25cm，稱之為明視距離。分辨力和光鏡的分辨極限分辨力又叫分辨本領(lǐng)，是指將鄰近兩點(diǎn)清晰區(qū)分辨認(rèn)的能力。第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法真正觀察技術(shù)是顯微鏡，是細(xì)胞里最直接的觀察技術(shù)，是觀察的手段和工具，這里的內(nèi)容不跟生化、微生物、分子生物學(xué)以及遺傳學(xué)重復(fù)，這是細(xì)胞里用的最多的一個(gè)技術(shù)。幾種顯微鏡可觀察的樣品大?。^之間的范圍）及其分辨能力（右側(cè)箭頭所指位置）分辨率(resolution)：能區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離眼睛、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡的分辨率分別為：0.2mm、0.2μm和0.2nm一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)(lightmicroscopy)1、普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)普通光學(xué)顯微鏡（最大分辨率為0.2μm），主要由三部分組成：①光學(xué)放大系統(tǒng)，即目鏡和物鏡；②照明系統(tǒng)，包括光源和聚光鏡；③鏡架及樣品調(diào)節(jié)系統(tǒng)，鏡座、鏡柱、鏡臂、鏡筒、調(diào)焦裝置、載物臺(tái)（物鏡轉(zhuǎn)換器）。普通光學(xué)顯微鏡成像示意圖（從上面可以看到樣本的基本情況）放大倍數(shù)：目鏡的放大倍數(shù)х物鏡的放大倍數(shù)隨堂練習(xí)關(guān)于光鏡的使用，下列正確的是（ABD）A.觀察標(biāo)本時(shí)，應(yīng)雙眼同時(shí)睜開，雙手并用B.按照從低倍鏡到高倍鏡到油鏡的順序進(jìn)行操作C.使用油鏡時(shí)，需在標(biāo)本上滴香柏油，將聚光器降至最低，光圈關(guān)至最小D.使用油鏡時(shí)，不可一邊在目鏡中觀察，一邊下降鏡筒或上升載物臺(tái)分析：在使用油鏡的時(shí)候，光線應(yīng)該調(diào)到最強(qiáng)程度，即聚光器提高，光圈全部開放顯微鏡的性能優(yōu)劣決定于它的分辨率(resolution)。分辨率是指顯微鏡區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離。（顯微鏡的價(jià)值不在于它放大倍數(shù)的多少，關(guān)鍵是看它分辨率的大?。│?入射光的波長(zhǎng)(最短450nm)N=介質(zhì)折射率（空氣1；水1.33；香柏油1.515；α溴萘1.66）α=物鏡鏡口角（標(biāo)本在光軸上的一點(diǎn)即聚焦點(diǎn)對(duì)物鏡鏡口的張角，最大140°），N.A.=鏡口率（numericaperture）（指物鏡框口能夠納進(jìn)的光通量的大小而言）。分辨極限（limitofresolution）：對(duì)可見光來(lái)說(shuō)，能清楚分辨出相鄰兩點(diǎn)之間的最小間隔為0.2μm。R=0.61λ/N.Sinα/2=0.61х0.5μm/1.5х1=0.2μm數(shù)值孔徑N.A(N.Sinα/2):數(shù)值孔徑的大小代表了光鏡的會(huì)聚能力。數(shù)值孔徑越高，光鏡的分辨力越大，所呈影像的亮度越強(qiáng)。隨堂練習(xí)顯微鏡的分辨率與放大倍數(shù)無(wú)關(guān)（√）光學(xué)顯微鏡可以直接用于觀察單細(xì)胞生物或體外培養(yǎng)的細(xì)胞。如果觀察生物組織樣品，則需要對(duì)樣品進(jìn)行一定的處理。細(xì)胞20-30μm厚，沒法直接看，涉及到標(biāo)本的制備問(wèn)題，切片。生物樣品的制備過(guò)程：=1\*GB3①固定：可使生物大分子交聯(lián)，蛋白質(zhì)成分凝固，防止細(xì)胞自溶和破壞而產(chǎn)生人工假象（保持生活狀況下的情景）。常用固定劑：甲醛、戊二醛、乙醇=2\*GB3②包埋：為了便于切片，防止樣品移位（石蠟融化了后，包埋在石蠟里，做成蠟塊）常用包埋劑：石蠟=3\*GB3③切片：由于生物樣品太厚，不能直接用光鏡觀察，需切成1-10μm的薄片（再對(duì)蠟塊進(jìn)行修理，用切片機(jī)切片，刀頭上下往返運(yùn)動(dòng)）=4\*GB3④細(xì)胞不同成分的選擇性染色（切片展在載玻片上，脫蠟、透明處理后，進(jìn)行染色）細(xì)胞總重量的70%是水，對(duì)可見光來(lái)說(shuō)幾乎是透明的，因此未經(jīng)處理的細(xì)胞在普通光鏡下幾乎是看不見的，為使細(xì)胞成為可見的常用方法就是染色。常用的染料：蘇木精對(duì)負(fù)電荷分子有親和力，可顯示細(xì)胞內(nèi)核酸的分布(藍(lán)紫色）；伊紅可使細(xì)胞質(zhì)染色（紅色）。（生物體細(xì)胞里的元素C，H，O，N，原子核系數(shù)都比較低，沒染色時(shí)與照射光成像，背景差非常弱，看不清楚，為了增加反差對(duì)片子進(jìn)行染色，染料與周圍沒染色的背景之間有一個(gè)比較大的反差，才能更好地去觀察，光學(xué)顯微鏡下觀察的切片都需要染色，樣本是死的）2、相差顯微鏡技術(shù)（phase-contrastmicroscope）和微分干涉顯微鏡技術(shù)（differential-interferencemicroscope）只有光線通過(guò)染色體標(biāo)本時(shí)其波長(zhǎng)、振幅發(fā)生變化，人眼才能看見，但活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本由于光波長(zhǎng)和振幅不發(fā)生變化，人眼看不到，但其相位有變化，因此利用光的干涉和衍射效應(yīng)把透過(guò)標(biāo)本不同區(qū)域的光波程差轉(zhuǎn)變成振幅差，使細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間呈現(xiàn)清晰可見的明暗對(duì)比。（兩束光波之間的相互干涉；A：相位相同時(shí)，振幅增強(qiáng)，亮光B:相位相反時(shí)，振幅減弱，暗光）（相位：描述信號(hào)波形變化的度量）相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）：一種將相位差轉(zhuǎn)變成振幅差（明暗差）的顯微鏡，可觀察不染色的活細(xì)胞。微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）：一種將樣品厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別相差顯微鏡。condenser聚光器；specimen樣品；deflectedlight偏離的光相差顯微鏡比普通光鏡多了2個(gè)部件：（1）在聚光器上增加一個(gè)環(huán)形光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間（一個(gè)光圈，只有光圈的能透過(guò)，其他地方的光都被擋住了）（2）在物鏡后焦面增加一個(gè)相板（annularphaseplate），相板上有一個(gè)環(huán)形區(qū)，通過(guò)環(huán)形區(qū)的光比從其他區(qū)域透過(guò)的光超前或滯后1/4λ，這樣就使通過(guò)標(biāo)本不同區(qū)域光波的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹?。（光源和聚光器之間有一個(gè)光闌（選擇某些光通過(guò)，某些光被擋住了），經(jīng)過(guò)樣本時(shí)，通過(guò)標(biāo)本的各個(gè)局部的力度不一樣，就會(huì)產(chǎn)生光波相位的改變，光波相位的改變，代表了光波振幅的改變，振幅是代表光的明暗度的，振幅越大，光越亮，振幅越小，光就越弱，（染料染色時(shí)，在樣品上的沉積不同，光照到樣品上后，對(duì)光波的吸收情況不同，改變的是光的波長(zhǎng)，哪些波被吸收了，哪些波過(guò)去了，因此光波波長(zhǎng)的改變是顏色的改變）；相位的改變是亮度的改變；目鏡里還有一個(gè)特殊的相板，把相位改變后的光聚集在一起）光波的衍射光波的干涉（同一點(diǎn)光源發(fā)射，相位相同或相反）相位相同，則振幅增強(qiáng)，亮光；相位相反，則振幅減弱，暗光源。光通過(guò)標(biāo)本致密區(qū)時(shí)發(fā)生衍射，產(chǎn)生偏折光，相位和未受影響的直射光相比被推遲了1/4λ（經(jīng)過(guò)樣品后，直射光比偏折光超前了1/4λ的周期）。只有未發(fā)生偏折的直射光可通過(guò)相位板的環(huán)形區(qū)，其它的偏折光在物鏡的后焦面上產(chǎn)生了一個(gè)與通過(guò)相位板的環(huán)形區(qū)的光不同的1/4λ的光程差。兩組光在平面上成像。如相板的環(huán)形區(qū)使直射光超前1/4λ，加上開始直射光超前的1/4λ，直射光共超前1/2λ，直射光和偏折光疊加形成的合成波振幅減少，產(chǎn)生暗反差。如相板的環(huán)形區(qū)使直射光滯后1/4λ，加上開始直射光超前的1/4λ，兩者相抵直射光不發(fā)生變化，直射光和偏折光無(wú)相位變化，形成的合成波振幅增加，產(chǎn)生明反差。結(jié)果未經(jīng)染色的活細(xì)胞內(nèi)的各種組織就可顯現(xiàn)不同的明暗對(duì)比。用途：可以觀察未染色的活細(xì)胞相差顯微鏡可觀察活細(xì)胞的各種運(yùn)動(dòng)，如細(xì)胞遷移、分裂、運(yùn)動(dòng)等。甚至研究細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器的動(dòng)態(tài)。體外培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞的圖像A：普通顯微鏡所拍B：相差顯微鏡所拍光線在通過(guò)密度不同的介質(zhì)時(shí)，其滯留程度不同，即產(chǎn)生了光程差和相位差。相差顯微鏡的基本原理把光程差變成振幅差(即明暗)。從而提高樣品反差，故樣品不需染色，適合觀察活細(xì)胞。甚至研究細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器的動(dòng)態(tài)。它在結(jié)構(gòu)上與普通顯微鏡最大的不同是在物鏡后裝有相差板。隨堂練習(xí)關(guān)于相差顯微鏡的敘述，下列正確的是（ABC）A.用于觀察活細(xì)胞和未染色的生物標(biāo)本B.細(xì)胞各部分細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度不同，光波通過(guò)時(shí)，波長(zhǎng)和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化（振幅差），這種振幅差肉眼無(wú)法觀察C.相差顯微鏡通過(guò)改變相位差，并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相位差變?yōu)檎穹顏?lái)觀察活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本D.可以用于超微結(jié)構(gòu)的觀察3.微分干涉顯微鏡微分干涉顯微鏡用的是偏振光，偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。1952年，Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)硅藻（光路改變后形成一個(gè)浮雕的效果，觀察活細(xì)胞的效果比相差顯微鏡還好）AcomparisonofyeastcellsthatweregrowingonthevaginalepitheliumseenwithdifferenttypesofLM.a)underbright-field;b)phase-contrast;c)DIC錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）計(jì)算機(jī)輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)，在一定程度上可以填補(bǔ)光鏡與電鏡之間分辨率上的間隙。（錄像增強(qiáng)反差顯微鏡（video-enhancecontrastmicroscope）解決活細(xì)胞反差不夠，無(wú)法觀察的缺點(diǎn)，例如膜泡沿著微管的運(yùn)動(dòng)，可以錄像。）2、熒光顯微鏡技術(shù)（fluorescencemicroscopy）原理：細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后發(fā)出可見光線，稱為熒光；自發(fā)熒光：由細(xì)胞本身存在的物質(zhì)經(jīng)紫外線照射后發(fā)出的熒光。誘發(fā)熒光：另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料（酸性品紅、甲基綠、吖啶橙等熒光色素）或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，這種熒光叫誘發(fā)熒光。熒光顯微鏡可對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究。光源為紫外光，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡。是目前在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位最有力的工具。熒光顯微鏡技術(shù)主要是用于檢測(cè)細(xì)胞上的特異熒光材料，與普通光學(xué)顯微鏡不同的是熒光顯微鏡增加了兩套濾光片。第一套稱為激發(fā)光濾片，裝在光源和樣品之間，只有那些能激發(fā)熒光材料發(fā)光的特定波長(zhǎng)的光才能通過(guò)。第二套稱為阻斷濾片，裝在物鏡和目鏡之間，只讓染料所發(fā)出的熒光通過(guò)。在黑暗背景的襯托下，發(fā)出熒光的樣品很容易被觀察。（兩個(gè)濾光片和一個(gè)二色鏡）（在光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上衍伸出來(lái)的一種特殊光學(xué)顯微鏡，即熒光顯微鏡，主要差別在于它的光源；波長(zhǎng)比較短的光經(jīng)過(guò)激發(fā)光濾片的過(guò)濾，波長(zhǎng)比較短的光聚集在反光鏡上，然后再去照射標(biāo)本，因此這個(gè)標(biāo)本里邊原子核周圍的電子吸收了短波長(zhǎng)光的激發(fā)，物質(zhì)里有一些可發(fā)熒光的物種可發(fā)出一個(gè)長(zhǎng)波的熒光，然后熒光去成像，為了避免熒光跟激發(fā)光一起上來(lái)，用眼睛去觀察是有損傷的，因此放了一個(gè)屏蔽的濾片，即把波長(zhǎng)比較短的激發(fā)光濾掉，只讓熒光過(guò)來(lái)，看到的是熒光的成像；激發(fā)光和觀察的熒光的問(wèn)題，在生物材料里有一些樣本是有自發(fā)熒光的，例如線粒體，葉綠體，本身產(chǎn)生熒光，只是熒光強(qiáng)度很弱，不容易捕獲到）（利用熒光顯微鏡時(shí)，要用到很重要的工具，熒光探針，熒光探針有兩類：化學(xué)性質(zhì)的熒光染料，相對(duì)比較便宜；用熒光素或化學(xué)的熒光染料標(biāo)記的抗體，通過(guò)抗體抗原的結(jié)合，特異性地觀察目標(biāo)，比較貴，特別是單抗；還可以用GFP，水母中存在的一種發(fā)光蛋白質(zhì)，現(xiàn)在發(fā)展出來(lái)的有YFP（黃色熒光蛋白），CFP（藍(lán)色熒光蛋白），RFP（紅色熒光蛋白）與別的蛋白質(zhì)形成融合蛋白，GFP的基因作為報(bào)告基因，當(dāng)別的蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)，GFP也表達(dá)。）不同熒光素所需激發(fā)波長(zhǎng)與所產(chǎn)生的熒光波長(zhǎng)比較FITC（fluoresceinisothiocyanateisomer，異硫氰酸熒光素）能和各種抗體蛋白結(jié)合，結(jié)合后的抗體不喪失與一定抗原結(jié)合的特異性，并在堿性溶液中具有強(qiáng)烈的綠色熒光在有絲分裂中期中，紡錘體微管呈綠色，中期染色體呈藍(lán)色，原纖維狀蛋白呈紅色圖熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色）利用GFP進(jìn)行的蛋白質(zhì)的基因工程化改造熒光顯微鏡技術(shù)包括免疫熒光技術(shù)和熒光素直接標(biāo)記技術(shù)。例如，將標(biāo)記熒光素的純化肌動(dòng)蛋白顯微注射入培養(yǎng)細(xì)胞中，可以看到肌動(dòng)蛋白分子組裝成肌動(dòng)蛋白纖維。可將產(chǎn)生熒光的綠色熒光蛋白（greenfluorescent，GFP）基因與某種蛋白質(zhì)基因融合，在表達(dá)這種融合蛋白的細(xì)胞中，便可直接在活體狀態(tài)下觀察到該蛋白在活細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。不同熒光素的激發(fā)波長(zhǎng)范圍不同，所以同一樣品可以用兩種以上的熒光素標(biāo)記，同時(shí)顯示不同成分在細(xì)胞中的定位。（在紫外光顯微鏡基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，利用樣品自發(fā)熒光和誘發(fā)熒光，可以對(duì)某些生物大分子進(jìn)行定性和定位研究。不僅可以觀察固定切片標(biāo)本，還可以在活體染色后對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行研究。隨堂練習(xí)綠色熒光蛋白GFP（GreenFluorescentProtein）基因與目的基因融合后，轉(zhuǎn)入細(xì)胞后可以（ABD）A.檢測(cè)融合蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的準(zhǔn)確定位B.檢測(cè)目的基因所編碼的蛋白在細(xì)胞中的含量C.檢測(cè)目的基因所編碼的蛋白在細(xì)胞中的分子結(jié)構(gòu)D.檢測(cè)目的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)量分析：與綠色熒光蛋白形成融合蛋白后，目的基因編碼蛋白隨著綠色熒光蛋白的顯色而被追蹤，熒光的強(qiáng)弱能反映目的蛋白的表達(dá)情況及其在細(xì)胞中的含量3、激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡技術(shù)(laserscanningconfocalmicroscope)共焦點(diǎn)是指物鏡和聚光鏡同時(shí)聚焦到同一小點(diǎn)。它在某一瞬間只用一束通過(guò)檢測(cè)器前的小孔的光成像，可顯著提高分辨率?？梢杂^察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。原理和應(yīng)用：激光共聚焦掃描顯微鏡（laserconfocalscanningmicroscope）用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。由于激光束的波長(zhǎng)較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)，調(diào)焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過(guò)計(jì)算機(jī)重新組合，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)，給出細(xì)胞內(nèi)各部分之間的定量關(guān)系及各種結(jié)構(gòu)線度。優(yōu)點(diǎn)：排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng)圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。

應(yīng)用：激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的定量，在研究亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與組分的定位及動(dòng)態(tài)變化等方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。(激光掃描共焦顯微鏡的原理圖:激光束經(jīng)雙色鏡反射后，通過(guò)物鏡匯聚到樣品某一焦點(diǎn)；從焦點(diǎn)發(fā)射的熒光經(jīng)透鏡匯聚成像，被檢測(cè)器檢出；樣品其他部位發(fā)射的熒光不會(huì)聚焦成像，因而檢測(cè)器不能檢出。）（照射的光源，給他的激發(fā)光是激光，觀察的樣本是在某一個(gè)特定的焦平面上成像，假如觀察一個(gè)較厚的標(biāo)本，用光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡觀察到的是，不同的焦平面上成像最后在你的視網(wǎng)膜上成像的結(jié)果，看到的總是很模糊，如果微調(diào)的話就到了不同層面了如果固定一個(gè)焦平面看清楚的話，其他上下平面又比較模糊；由不同的焦平面的圖像，一個(gè)焦平面一個(gè)焦平面的掃描移動(dòng)照像，若干個(gè)清晰的圖像合成后的一個(gè)混合圖像，最后重建成一個(gè)立體的狀態(tài)）激光掃描共焦顯微鏡是在熒光顯微鏡基礎(chǔ)上裝有激光掃描裝置，以單色激光作為光源，使樣品被激發(fā)出熒光，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像。共焦顯微鏡利用激光掃描束經(jīng)照明孔形成點(diǎn)光源對(duì)標(biāo)本內(nèi)焦平面上的每一點(diǎn)掃描，由于照明孔與檢測(cè)孔相對(duì)于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明孔和檢測(cè)孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在檢測(cè)孔處成像，這樣就得到了樣本清晰的光學(xué)切面圖，克服了普通光鏡圖像模糊的缺點(diǎn)。在顯微鏡載物臺(tái)上加一個(gè)微量步進(jìn)馬達(dá)，使載物臺(tái)上下移動(dòng)，改變焦平面，不同層次的光切面圖像經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像三維重組，就能獲得樣品的立體結(jié)構(gòu)圖像。熒光顯微鏡（A）和激光掃描共焦顯微鏡（B）所觀察圖像的比較隨堂練習(xí)關(guān)于激光掃描共焦顯微鏡的敘述，錯(cuò)誤的是（D）A.共焦點(diǎn)是指物鏡和聚光鏡同時(shí)聚焦到一個(gè)小點(diǎn)B.可以自動(dòng)改變觀察的焦平面而且縱向分辨率得到改善C.可以通過(guò)光學(xué)切片觀察樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并可重構(gòu)三維圖像D.相比普通熒光顯微鏡分辨率提高50倍二、電子顯微鏡技術(shù)（一）電子顯微鏡基本知識(shí)1、電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別電鏡與光鏡的區(qū)別顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LM200nm可見光（400-700nm）玻璃透鏡不要求真空利用樣品對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化100nm紫外光（約200nm)玻璃透鏡不要求真空TEM0.1nm電子束（0.01-0.9nm）電磁透鏡要求真空

1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差2.電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)與有效放大倍數(shù)光鏡分辨極限為0.2μm，小于0.2μm的微細(xì)結(jié)構(gòu)的光波可產(chǎn)生衍射現(xiàn)象，這種光波經(jīng)過(guò)物體時(shí)可繞過(guò)物體就像無(wú)物體經(jīng)過(guò)一樣，因此無(wú)法用光鏡觀察。這就需要一種更大分辨力的儀器來(lái)觀察比0.2μm更小的物體的微細(xì)結(jié)構(gòu)。電子波長(zhǎng)比光波短得多，用電子波代替光波可提高顯微鏡的分辨力。電鏡就是根據(jù)這樣的原理產(chǎn)生的。電子顯微技術(shù)中的常用度量單位是埃（?）；(1?=10-1nm=10-4μm=10-7mm=10-10m)相鄰兩個(gè)金屬原子之間的距離是2?光學(xué)顯微鏡的分辨率為0.2μm左右，其放大倍數(shù)為0.2mm/0.2μm，即1000倍分辨率最終決定于光的波長(zhǎng)，由于使用電子束作光源，電鏡的分辨率大大提高。電鏡的分辨率常是超薄切片厚度的1/10，它的分辨率可達(dá)0.2nm，其放大倍數(shù)為106倍。上述放大倍數(shù)稱之為有效放大倍數(shù)電鏡的分辨本領(lǐng):是指電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨率電鏡的實(shí)際分辨率常常受到生物制樣技術(shù)本身的限制3.電子顯微鏡的基本構(gòu)造電鏡的基本構(gòu)造包括：①電子束照明系統(tǒng)；②電磁透鏡成像系統(tǒng)；③真空系統(tǒng)；④記錄系統(tǒng)；⑤電源系統(tǒng)。電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)（A）和成像原理（B）4、1932年Ruska制備第一臺(tái)電子顯微鏡。1935年法國(guó)的卡諾爾提出掃描電鏡的設(shè)計(jì)思想和工作原理。1942年劍橋大學(xué)的馬倫首次制成世界第一臺(tái)掃描電鏡。5、分類：透射電鏡（TransmissionelectronMicroscope,TEM）掃描電鏡（ScanningelectronMicroscope,SEM）=1\*GB2⑴透射電鏡：第一臺(tái)透射電鏡放射倍數(shù)大概是12倍；一年后突飛猛進(jìn)達(dá)到5000倍，現(xiàn)在達(dá)到上萬(wàn)倍。透射電鏡標(biāo)本制備過(guò)程：取材：盡可能保持生活狀態(tài)，避免損傷，必須耐真空；由于電子穿透力弱，標(biāo)本必須超薄，標(biāo)本反差盡可能大（生物材料原子系數(shù)低，圖像反差差，不易出現(xiàn)明暗差別）固定：為防止生物樣品在死亡后和脫水過(guò)程中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)改變，離體生物標(biāo)本迅速固定。常用戊二醛和四氧化鋨固定；戊二醛在蛋白質(zhì)分子之間形成共價(jià)鍵，將它們交聯(lián)在一起。四氧化鋨除與蛋白共價(jià)結(jié)合外，還對(duì)脂類有良好的固定效果。脫水：標(biāo)本必須置于高真空中進(jìn)行電鏡觀察，但電鏡不能觀察含水的生物標(biāo)本，因此需經(jīng)脫水處理。另外由于包埋劑與水不溶，用脫水劑可將組織中游離水脫去，有利包埋。包埋：為使柔軟生物組織制成超薄切片，并使切片耐受高真空、電子轟擊，則在切片前將標(biāo)本進(jìn)行包埋，常用環(huán)氧樹脂。切片：電子穿透力很弱，需將樣品制成50-100nm厚的薄片。染色：生物分子由原子序數(shù)低的輕元素組成，它們散射電子能力弱，在電鏡下幾乎不存在明暗反差，為加大生物樣品反差，進(jìn)行染色。常用的染色劑：醋酸鈾、枸櫞酸鉛。提高樣品反差的方法：負(fù)染法：將病毒、纖維、核糖體或分離的生物大分子樣品放于覆有親水性支持膜的載網(wǎng)上，滴加磷鎢酸，樣品干燥后重金屬鹽沉積于樣品周圍使樣品和背景形成顯著的明暗對(duì)比，這種染背景而不染樣品的方法叫負(fù)染（只染背景，不染樣品，襯托出樣品；）真空鍍膜法：把鉑或銫等重金屬接受高溫蒸發(fā)，金屬顆粒以一定傾斜角度噴落在樣品表面形成不同厚度的薄膜，膜的厚度反映了樣品的表面輪廓，主要觀察病毒、噬菌體或大分子的形狀。整裝細(xì)胞電鏡技術(shù)：應(yīng)用高錳酸鉀固定劑，將細(xì)胞中大部分蛋白質(zhì)性結(jié)構(gòu)破壞，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等膜性細(xì)胞器保存下來(lái)。這樣不需超薄切片，細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜系統(tǒng)及高爾基復(fù)合體、溶酶體和線粒體等膜性結(jié)構(gòu)就能顯現(xiàn)出來(lái)。冷凍蝕刻復(fù)型電鏡技術(shù)：將標(biāo)本用液氮超低溫冷凍，真空中割斷，升溫使冰升華，細(xì)胞內(nèi)外凡含水多的地方因失水而下陷，膜和其它一些結(jié)構(gòu)顯露出來(lái)，增強(qiáng)了斷面的浮雕效果；標(biāo)本蝕刻后以45O噴金，90O噴碳后將組織溶解掉，剩下的碳-金屬膜就是復(fù)型。將復(fù)型膜置于透射電鏡下觀察，可觀察蝕刻面所暴露的各種微細(xì)結(jié)構(gòu)。冷凍：制冷劑（一般為液態(tài)氮）快速冷凍，使樣品固定。斷裂：在低溫真空中將樣品劈開，斷裂面上可見各種細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。蝕刻：升溫使冰升華，細(xì)胞內(nèi)外含水較多的地方因失水而下陷，膜和其它結(jié)構(gòu)顯露出來(lái)，增強(qiáng)了斷面的浮雕效果。復(fù)型：45O噴金，90O噴碳固定，顯示立體結(jié)構(gòu)。剝膜：將樣品取出，浸泡于腐蝕液中將生物組織腐蝕掉，只剩下鉑-碳復(fù)型膜，撈于載網(wǎng)上干燥后透射電鏡觀察。（肌動(dòng)蛋白纖維經(jīng)冷凍蝕刻復(fù)型技術(shù)后的影像）=2\*GB2⑵掃描電子顯微鏡：與透射電鏡的區(qū)別，不要打到標(biāo)本透射過(guò)去的光，而是要標(biāo)本反射回去的光，檢測(cè)器收集二次電子，整合再用熒光屏顯現(xiàn)。特點(diǎn)：高的分辨率；很強(qiáng)的立體感；放大倍率范圍廣；應(yīng)用范圍廣；樣品適應(yīng)性大；生物樣品制備：SEM所取得的迅速發(fā)展表明，儀器本身性能（如分辨力、多功能等）的不斷提高固然重要，但樣品制備技術(shù)的改良和日趨完善，則對(duì)SEM的應(yīng)用和發(fā)展確實(shí)起到了積極促進(jìn)作用；同時(shí)，樣品制備的質(zhì)量如何，也是能否發(fā)揮SEM儀器最佳性能，拍出理想圖像照片的關(guān)鍵所在。因此，SEM生物樣品制備技術(shù)問(wèn)題，一直是電鏡工作者不斷創(chuàng)新的一個(gè)重要領(lǐng)域。SEM生物樣品制備基本要求：生物樣品與金屬、礦物等材料不同，它具有質(zhì)地柔軟、容易變形、導(dǎo)電性能差、二次電子發(fā)射率低以及含水量多等特點(diǎn)。因此，在處于高真空狀態(tài)下的掃描電鏡內(nèi)觀察生物樣品時(shí)，必須嚴(yán)格地遵循一定的原則和操作程序，對(duì)樣品進(jìn)行必要的預(yù)處理。在進(jìn)行SEM樣品制備時(shí)，一般應(yīng)掌握以下原則：（一）每一步處理步驟及操作過(guò)程中，都應(yīng)注意防止對(duì)樣品的污染和損傷，使被觀察的樣品盡可能地保持原有形象及微細(xì)結(jié)構(gòu)。（二）去除樣品內(nèi)的水分，以利于維持SEM的真空度和防止對(duì)鏡筒的污染。但在脫水和干燥處理時(shí)，要盡量避免和減少樣品體積變小，表面收縮變形等人工損傷。（三）降低樣品表面的電阻率，增加樣品的導(dǎo)電性能，以提高二次電子發(fā)射率，建立適當(dāng)?shù)姆床詈蜏p少樣品的充放電效應(yīng)。（四）無(wú)論觀察組織、細(xì)胞的表面或內(nèi)部微細(xì)構(gòu)造，都應(yīng)注意辨認(rèn)和保護(hù)觀察面。取材-清洗-固定-脫水-干燥-鍍膜-觀察；前四步與透鏡一樣。臨界點(diǎn)干燥法的工作原理：臨界點(diǎn)干燥，是根據(jù)物質(zhì)存在著臨界狀態(tài)的物理特性而研制的。在溫度和壓力的變動(dòng)之下，任何物質(zhì)存在的固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)三種形式都可以相互轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)溫度、壓力達(dá)到一定的數(shù)值時(shí)，氣體的密度可增大到與液態(tài)一樣，此時(shí)氣相與液相的界面消失，液體的表面張力亦會(huì)隨之消失，物理學(xué)中，將上述情況稱為臨界狀態(tài)，將此時(shí)的溫度和壓力，分別稱為臨界溫度和臨界壓力。臨界點(diǎn)干燥，就是利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)下液體表面張力被消除的特性，客服樣品干燥過(guò)程中的變形，保持樣品原狀，達(dá)到干燥的目的。臨界液的選擇：一般將臨界干燥中起臨界干燥作用的液體稱為媒介液（又稱過(guò)渡液），它的選擇條件是臨界溫度及壓力較低、價(jià)格便宜而且保存方便。液態(tài)CO2的臨界溫度為31.4℃，臨界壓力為72kg/cm2，與其它媒介液相比更符合選擇條件。因此，在臨界點(diǎn)干燥時(shí)，液態(tài)CO2已被普遍使用。臨界點(diǎn)干燥的操作程序：樣品預(yù)處理；放置樣品；注入液體CO2；CO2置換；臨界處理；放氣取樣。生物樣品的導(dǎo)電處理:生物樣品尤其是經(jīng)干燥處理的樣品，其表面電阻率很高，導(dǎo)電性能很差，當(dāng)接受電子束照射時(shí)，易造成充電和放電效應(yīng)，以致圖像模糊不清。此外生物樣品元素成分原子序數(shù)低，二次電子發(fā)射率低，也難得到反差適當(dāng)?shù)膱D像，為增加導(dǎo)電性能，提高二次電子發(fā)射率，必須對(duì)樣品進(jìn)行導(dǎo)電處理。（注射針頭的掃描電鏡照片）（二）主要電鏡制樣技術(shù)介紹1.超薄切片技術(shù)（ultrathinsection)：切片厚度一般僅為40～50nm樣品制備技術(shù)的特殊要求：①樣品要?。虎诟玫乇３謽悠返木?xì)結(jié)構(gòu)；③樣品具有一定的反差。薄切片技術(shù)；是觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。用于電鏡觀察的樣本制備。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式推進(jìn)樣品切片，切片厚度20-50nm。超薄切片技術(shù)顯示的動(dòng)物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)隨堂練習(xí)用電子顯微鏡觀察的生物樣品會(huì)有一些特殊要求，如要求樣品很薄及更好地保持樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)（√）2.負(fù)染色技術(shù)(negativestaining)：用重金屬鹽對(duì)電鏡樣品進(jìn)行染色的技術(shù)，使得重金屬鹽沉積在樣品周圍，而樣品不被染色，從而襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。家蠶細(xì)小病毒負(fù)染色電鏡照片（病毒直徑20nm）Examplesofnegtivelystainedandmetal-shadowedspecimens.Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegtivestainingwithpotassiumphosphotungstate(a)orshadowcastingwithchromium(b).3.冷凍蝕刻技術(shù)(freezeetching)：（冷凍斷裂和冷凍蝕刻電鏡技術(shù)技術(shù)；又稱冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來(lái)觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。）樣品經(jīng)冷凍斷裂后，在真空中短暫暴露，使斷裂面上的一層薄冰升華，暴露出蝕刻面，以便在電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。隨堂練習(xí)經(jīng)冷凍蝕刻技術(shù)處理后的樣品，在電子顯微鏡下所觀察到的圖像是樣品本身所形成的（×）分析：是金屬膜和碳膜成像4.電鏡三維重構(gòu)與低溫電鏡技術(shù)電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前在結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）領(lǐng)域用于研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實(shí)驗(yàn)手段。低溫電子顯微技術(shù)：其樣品不經(jīng)固定、染色和干燥，直接包被在約100nm厚的冰膜中，在電鏡內(nèi)-160℃低溫下利用相位襯度成像；研究生物大分子及其復(fù)合物表面與內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu)。單顆粒技術(shù)：研究核糖體的三維結(jié)構(gòu)及在蛋白質(zhì)合成中的動(dòng)態(tài)變化電子掃描斷層成像技術(shù)：研究細(xì)胞核細(xì)胞器三維精細(xì)結(jié)構(gòu)電子掃描斷層成像技術(shù)顯示細(xì)菌的部分鞭毛及其復(fù)雜的基部結(jié)構(gòu)（箭頭所指）5.掃描電鏡技術(shù)（Scanningelectronmicroscope，SEM）：利用電子在樣品表面掃描產(chǎn)生二次電子成像的顯微鏡。是觀察細(xì)胞表面形的有力工具。電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測(cè)器收集二次電子成像。CO2臨界點(diǎn)干燥法防止