基于氣相色譜指紋圖譜鑒別葡萄酒真?zhèn)舞b別方法的研究

基于氣相色譜指紋圖譜鑒別葡萄酒真?zhèn)舞b別方法的研究

近年來，世界葡萄酒產(chǎn)量幾乎為800萬(wàn)公里，其中葡萄糖種植面積超過600萬(wàn)公里。世界葡萄酒總產(chǎn)量幾乎為2700萬(wàn)噸左右。2009年世界葡萄酒消費(fèi)2366萬(wàn)t;2010年國(guó)際葡萄酒貿(mào)易量較2009年增長(zhǎng)了6.7%,全球葡萄酒消費(fèi)總量維持在2360萬(wàn)t左右。我國(guó)葡萄酒年產(chǎn)量平均以每年15%左右的速度遞增,葡萄酒消費(fèi)也呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。2009年全國(guó)葡萄酒產(chǎn)量為96萬(wàn)t,同比增長(zhǎng)27.63%。但是,仍有個(gè)別企業(yè)和經(jīng)營(yíng)者一味追求高額利潤(rùn),傍品牌、冒名牌、披上洋外衣、以次充好等制造、銷售假冒偽劣葡萄酒等行為,嚴(yán)重?cái)_亂了正常的市場(chǎng)秩序。國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上常見的3種摻假葡萄酒為:摻水稀釋葡萄酒、濃縮葡萄汁調(diào)配假冒葡萄酒、人工勾兌假葡萄酒(所謂“三精一水”勾兌產(chǎn)品)。有的不法商家為了獲得更大的利潤(rùn),甚至用工業(yè)酒精代替無水乙醇進(jìn)行人工勾兌,嚴(yán)重危害了廣大消費(fèi)者的健康。目前,對(duì)紅葡萄酒進(jìn)行真假鑒別主要是從標(biāo)簽的識(shí)別、感官檢查、人工合成色素的檢測(cè)及酒精與干抽出物的比值等方面綜合評(píng)價(jià)進(jìn)行鑒別。單從感官及簡(jiǎn)單的理化指標(biāo)去甄別紅葡萄酒是有一定效果,但不夠準(zhǔn)確和嚴(yán)謹(jǐn),已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)和應(yīng)對(duì)當(dāng)前國(guó)內(nèi)葡萄酒市場(chǎng)所面對(duì)的嚴(yán)峻形勢(shì)。指紋圖譜技術(shù)是近十年來快速發(fā)展的一種對(duì)復(fù)雜物質(zhì)的研究方法,為國(guó)際社會(huì)所認(rèn)可,已經(jīng)在中藥及中成藥的鑒別和質(zhì)量控制中得到應(yīng)用。紅葡萄酒具有類似于中藥的復(fù)雜體系,應(yīng)用指紋圖譜技術(shù)可以全面反映葡萄酒內(nèi)在化學(xué)成分的種類與數(shù)量、有效地表征葡萄酒質(zhì)量、進(jìn)行葡萄酒的溯源。而將指紋圖譜方法引入酒類化學(xué)鑒定中,不用將葡萄酒中的物質(zhì)進(jìn)行定性鑒別,避免了使用昂貴的標(biāo)準(zhǔn)品,簡(jiǎn)化了葡萄酒鑒定的繁瑣過程,方法易于推廣,具有重要的意義。已有部分文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用化學(xué)指紋圖譜技術(shù)進(jìn)行葡萄酒釀造不同品種的識(shí)別;利用快速無損的近紅外光譜分析技術(shù)建立了判別葡萄酒原產(chǎn)地的預(yù)測(cè)模型;應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)茅臺(tái)酒酒樣進(jìn)行指紋圖譜測(cè)定,建立了貴州茅臺(tái)酒的共有指紋圖譜,應(yīng)用于白酒的質(zhì)量控制及真?zhèn)伪鎰e[9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]。但是,目前在利用葡萄酒化學(xué)指紋圖譜進(jìn)行葡萄酒真假鑒別上缺少系統(tǒng)的研究,個(gè)別文獻(xiàn)也只是在技術(shù)方法的探索上,還沒有形成可以實(shí)際應(yīng)用的葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)指紋圖譜庫(kù),更沒有建立可以實(shí)際應(yīng)用的鑒別葡萄酒真假的化學(xué)指紋圖譜方法。本研究通過對(duì)10個(gè)主要葡萄酒生產(chǎn)國(guó)所產(chǎn)85種紅葡萄酒進(jìn)行氣相色譜分析,采集氣相色譜指紋圖譜,利用中藥指紋圖譜分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,提取紅葡萄酒典型的共有峰,構(gòu)建紅葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜,計(jì)算其相似度閾值,進(jìn)行定量、客觀判別葡萄酒的真假,快速甄別市場(chǎng)上常見的3種所謂“三精一水”勾兌摻假葡萄酒。本研究基于氣相色譜指紋圖譜法,結(jié)合中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)軟件建立紅葡萄酒真假鑒別方法,以期為紅葡萄酒的監(jiān)管、促進(jìn)紅葡萄酒生產(chǎn)和市場(chǎng)向規(guī)范化發(fā)展提供一種值得借鑒的紅葡萄酒真假鑒別方法。1材料和方法1.1不同種類葡萄酒的半干成分配和保護(hù)真紅葡萄酒:法國(guó)、意大利、澳大利亞等10個(gè)國(guó)家知名品牌的干紅葡萄酒,85個(gè),來源于廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心食品實(shí)驗(yàn)室。2個(gè)已知葡萄汁勾兌國(guó)產(chǎn)某品牌葡萄酒為超市購(gòu)買。實(shí)驗(yàn)室勾兌葡萄酒樣本:模仿市場(chǎng)上銷售的摻假葡萄酒,以酒精度為13%vol的真法國(guó)紅葡萄酒為對(duì)照,分3種方式勾兌。第1種,摻水稀釋葡萄酒樣品:選取真葡萄酒按照不同的稀釋倍數(shù),用去離子水和無水乙醇進(jìn)行稀釋,得到酒精度為13%vol的摻水稀釋葡萄酒樣品;第2種,葡萄汁勾兌葡萄酒樣品:用濃縮葡萄汁、去離子水和無水乙醇進(jìn)行人工勾兌,再加入白砂糖和檸檬酸增加甜酸度,得到葡萄汁勾兌葡萄酒樣品;第3種,人工色素勾兌假葡萄酒樣品:用去離子水稀釋工業(yè)酒精至酒精度13%vol,再加入葡萄酒香精、莧菜紅、誘惑紅、白砂糖、檸檬酸,模擬市場(chǎng)上銷售的“三精一水”的假冒葡萄酒樣品。氣相色譜儀:帶FID檢測(cè)器,Agilent7890A,美國(guó)Agilent公司;渦旋振蕩器,德國(guó)IKA公司;去離子水由Milli-Q凈化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)制得;無水乙醇(純度≥99.5,分析純);檸檬酸(分析純);工業(yè)酒精、葡萄香精、莧菜紅、誘惑紅、濃縮葡萄汁和白砂糖均為市售。1.2設(shè)備工作模式色譜柱,CP-WAX57CB毛細(xì)管柱,50m×0.25mm(i.d.)×0.2μm,進(jìn)樣口溫度:220℃;檢測(cè)器溫度250℃;載氣流速:氮?dú)?純度99.999%),流量3mL/min;進(jìn)樣模式:不分流進(jìn)樣;升溫程序:初始溫度40℃,保持3min,先以5℃/min升到50℃,保持5min,再以15℃/min升到190℃,保持5min,后以20℃/min升到215℃,保持12.5min;進(jìn)樣量1.0μL。1.3處理數(shù)據(jù)AgilentChemstation工作站和中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)。2結(jié)果與討論2.1pcr分析gc指紋圖譜本研究隨機(jī)抽取10個(gè)常見葡萄酒生產(chǎn)國(guó)的真紅葡萄酒85個(gè),瓶裝葡萄酒樣品搖勻后開塞直接取約1.0mL裝瓶上機(jī),按照1.2中GC條件進(jìn)行分析,采集氣相色譜圖。紅葡萄酒的GC指紋圖譜一般有25~32個(gè)色譜峰,色譜峰出現(xiàn)的時(shí)間段為8~35min之間。圖1為其中1個(gè)樣品的氣相色譜圖,8min之前,主要是甲醇和乙醇的峰,在此研究中不作為特征峰進(jìn)行分析,35min以后,沒有色譜峰出現(xiàn)。2.2分析和數(shù)據(jù)管理的氣相色譜圖隨機(jī)抽取85個(gè)樣品中的1個(gè)樣品,按1.2中GC條件連續(xù)進(jìn)樣6次,采集氣相色譜圖。用中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)分析采集的6次氣相色譜圖。結(jié)果表明,該樣品的氣相色譜圖中共有28個(gè)色譜峰,其相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于0.3%;相對(duì)峰面積的RSD除了第5、第27個(gè)峰大于3%且小于5%外,其余均小于3%,表明本試驗(yàn)所使用儀器在對(duì)紅葡萄酒進(jìn)行鑒別時(shí)具有較好的精密度。2.3中藥色譜圖分析隨機(jī)抽取85個(gè)樣品中的1個(gè)樣品,分裝于6個(gè)GC進(jìn)樣瓶中按1.2中GC條件連續(xù)分別進(jìn)樣,采集的GC色譜圖用中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)分析。該樣品共有29個(gè)色譜峰,其相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.3%,相對(duì)峰面積除了第6、第28個(gè)峰大于3%小于5%外,其余均小于3%,說明本試驗(yàn)方法具有較好的重復(fù)性。2.4個(gè)國(guó)家葡萄酒gc指紋圖譜共有峰疊加按1.2中GC條件采集85個(gè)紅葡萄酒樣品的氣相色譜圖,用中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)分析,從10個(gè)國(guó)家葡萄酒樣品中選取相似度大于0.99圖譜作為該國(guó)的特征性指紋圖譜,每個(gè)國(guó)家選取一份圖譜用于中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)分析,生成紅葡萄酒GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜;10個(gè)國(guó)家紅葡萄酒GC指紋圖譜共有峰疊加見圖2;相似度分析發(fā)現(xiàn),峰面積相關(guān)系數(shù)法、峰面積夾角余弦法、全圖譜相關(guān)系數(shù)法和全圖譜夾角余弦法的相似度均大于0.9700,見表1。10個(gè)國(guó)家85種紅葡萄酒一共檢出12個(gè)共有峰,保留時(shí)間分別為9.06min、10.76min、14.08min、20.25min、21.55min、24.04min、25.23min、27.60min、28.56min、29.57min、30.00min和30.74min,以此12個(gè)共有峰作為紅葡萄酒的特征色譜峰,紅葡萄酒GC指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間見表2。根據(jù)10個(gè)國(guó)家85個(gè)葡萄酒樣品相似度分析,確定紅葡萄酒GC指紋圖譜相似度閾值為峰面積相關(guān)系數(shù)法、峰面積夾角余弦法、全圖譜相關(guān)系數(shù)法和全圖譜夾角余弦法的相似度值均大于0.9700。2.53樣品的制備2.5.1強(qiáng)化葡萄酒的前相分析按1.1方法在實(shí)驗(yàn)室制備摻水稀釋葡萄酒樣品,任意選取85個(gè)紅葡萄酒樣品中的2個(gè)樣品T11和T12,用去離子水及無水乙醇稀釋1倍、2倍和3倍(T12),保證酒精度為13%vol。在1.2相同儀器條件下采集氣相色譜圖,用中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)進(jìn)行相似度分析,結(jié)果見表3。圖3結(jié)果表明,不管用峰面積相關(guān)系數(shù)法,還是夾角余弦法對(duì)紅葡萄酒進(jìn)行分析,紅葡萄酒相對(duì)峰面積的相似度值均在0.9800以上,而全圖譜相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法相似度值均在0.9900以上;經(jīng)過稀釋處理的紅葡萄酒相對(duì)峰面積的相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法相似度都在0.1700以下,明顯低于未經(jīng)稀釋的紅葡萄酒;稀釋處理的紅葡萄酒全圖譜相似度值略小于未經(jīng)處理的紅葡萄酒。因此,對(duì)摻水稀釋葡萄酒可以用GC指紋圖譜峰面積相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法進(jìn)行鑒別,若其相似度閾值為0.9700以上,則可判定為真紅葡萄酒。2.5.2全圖譜相似度分析按1.1方法在實(shí)驗(yàn)室制備葡萄汁勾兌葡萄酒,任意選取85個(gè)紅葡萄酒樣品中的10個(gè)樣品(T13~T22),在1.2相同儀器條件下采集氣相色譜圖,用中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)進(jìn)行相似度分析。結(jié)果表明,真紅葡萄酒峰面積相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法與全圖譜相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法的相似度值均在0.9800以上;而用葡萄汁勾兌紅葡萄酒的樣品峰面積相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法相似度值在0.6128以下,明顯低于真的紅葡萄酒;葡萄汁勾兌葡萄酒樣品的全圖譜相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法相似度值在0.7708~0.9063之間,小于真紅葡萄酒的相似度值0.9931~0.9999,結(jié)果見表4。判別葡萄汁假冒葡萄酒既可用峰面積相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法,也可用全圖譜相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法,判定其為真紅葡萄酒的相似度閾值為0.9700。2.5.3假葡萄酒的鑒別任意選取85份紅葡萄酒樣品中的10個(gè)樣品(T23~T32)與按1.1方法在實(shí)驗(yàn)室制備人工勾兌假葡萄酒,并在超市購(gòu)買2種可疑假葡萄酒,在1.2相同儀器條件下采集氣相色譜圖,用中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)進(jìn)行相似度分析,結(jié)果見表5。表5結(jié)果表明,人工勾兌假葡萄酒樣品峰面積相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法的相似度值在0.1001以下,明顯低于真紅葡萄酒;人工勾兌假冒葡萄酒樣品的全圖譜相似度值在0.1666~0.2620之間,也明顯小于真紅葡萄酒;2種可疑假葡萄酒峰面積相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法的相似度值在0.1500以下,全圖譜相似度值在0.4365以下。不管是用峰面積相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法,還是全圖譜相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法,低于真紅葡萄酒的相似度閾值0.9700的均可判定為假葡萄酒,由此可以鑒別出真紅葡萄酒和人工勾兌假葡萄酒。為驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性,特意購(gòu)買了2種疑似假紅葡萄酒,通過GC化學(xué)指紋圖譜比對(duì)及相似度分析,表明此2種可疑假葡萄酒為酒精、人工色素等勾兌而成的,其GC化學(xué)指紋圖譜疊加見圖3。3葡萄酒氣相色譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的確定本研究通過對(duì)10個(gè)常見葡萄酒產(chǎn)地85份真紅葡萄酒樣品采集氣相色譜指紋圖譜,利用中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)軟件進(jìn)行識(shí)別分析。結(jié)果表明,氣相色譜儀器的精密度和方法的重現(xiàn)性很好。本研究建立了紅葡萄酒的氣相色譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜,該標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜包括12個(gè)特征色譜峰。3種方式勾兌假葡萄