中藥抗鼻咽癌致病因子ebv有效藥物的研究

中藥抗鼻咽癌致病因子ebv有效藥物的研究

隨著腫瘤學(xué)的發(fā)展，病毒引起的腫瘤機(jī)制逐漸被認(rèn)識(shí)到。腫瘤病毒對(duì)人有感染性,有些病毒對(duì)某些組織細(xì)胞具有特異親嗜作用,引發(fā)疾病,并誘發(fā)腫瘤,已發(fā)現(xiàn)有150種以上的病毒可以引起動(dòng)物腫瘤。EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)是人類皰疹病毒,我國(guó)90%以上的人受到過(guò)該病毒的感染。由于EBV對(duì)人類的普遍易感性,而且與多種人類疾病尤其是惡性腫瘤密切相關(guān),EBV感染越來(lái)越受到人們的關(guān)注。一旦感染,EBV將長(zhǎng)期潛伏在人體B淋巴細(xì)胞中,受感染者將成為終生帶毒者,而且在一定的條件下(如某些誘導(dǎo)因子的作用),潛伏感染細(xì)胞中的EBV基因組被激活而表達(dá),轉(zhuǎn)化為增殖性感染。EBV感染可以引起的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和多種疾病,與病毒的“感染-潛伏-激活”有密切關(guān)系。到目前為止,無(wú)論在蛋白質(zhì)水平還是在基因水平均已表明在外界環(huán)境和基因作用下,EBV可引起鼻咽癌等多種惡性腫瘤。因此筆者以中藥抗鼻咽癌致病因子EB病毒有效藥物的研究作為切入點(diǎn),構(gòu)建一種從病因?qū)W角度研究中藥防治腫瘤的技術(shù)平臺(tái)。材料和方法1.材料表面1.1植物酚類、皂苷等皂苷的合成ZYB1至ZYB5是補(bǔ)益類中藥有效部位(均為補(bǔ)益類藥,前4種是多糖,后1種是皂苷),購(gòu)買于浙江大山合藥業(yè)有限公司及廣東惠州東方植物保健科技有限公司,并經(jīng)我院化學(xué)合成實(shí)驗(yàn)室鑒定。ZYC1、ZYC2是補(bǔ)益類中藥有效成分(皂苷類),購(gòu)買于中國(guó)生物制品藥品檢定所以及中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥所惠贈(zèng)。1.2細(xì)胞植物人淋巴瘤細(xì)胞Raji、鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-3細(xì)胞株均由中國(guó)CDC病毒病預(yù)防控制研究所曾毅院士實(shí)驗(yàn)室提供。1.3實(shí)驗(yàn)用試劑與材料胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司;RPMI1640培養(yǎng)液、佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)、丁酸購(gòu)于Sigma公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgA抗體購(gòu)于BD公司;胰蛋白酶購(gòu)自GIBCO公司;3,3′-二氨基聯(lián)苯胺購(gòu)于北京市化學(xué)試劑公司;活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cellcountingkit-8,CCK-8Kit),購(gòu)自北京恒大百盛生物科技有限公司;EB病毒呈陽(yáng)性的鼻咽癌病人血清和EBV早期蛋白(earlyantigen,EA)由中國(guó)CDC病毒病預(yù)防控制研究所曾毅院士實(shí)驗(yàn)室提供;乙肝表面抗原蛋白(hepatitisBsurfaceantigen,HBsAg)由北工大生命學(xué)院環(huán)境與病毒腫瘤學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。N-羥基丁二酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽[(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride,EDC)]和乙醇胺購(gòu)自GE公司。NHS和EDC在去離子水中完全溶解后過(guò)濾,分裝后儲(chǔ)存于-20℃,乙醇胺儲(chǔ)存于4℃。2.方法2.1細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)CNE-1、CNE-3細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),Raji細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)。3種細(xì)胞皆適用于RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng),添加20%小牛血清,1%的雙抗(青霉素、鏈霉素)和1%的谷氨酰胺,常規(guī)培養(yǎng)。2.2外藥效應(yīng)研究結(jié)果1.中藥有效成分對(duì)血管瘤細(xì)胞株的抑制2.中藥有效成分促進(jìn)了早期阻斷病毒對(duì)抗基因的形成3.zyc2與靶蛋白的的相互作用筆者觀察了5種有效部位和2種有效成分在一定濃度條件下,與不同靶蛋白(EBV-EA、HBsAg)的結(jié)合情況,結(jié)果表明,5種有效部位與病毒靶蛋白的結(jié)合狀態(tài)均不理想,而2種有效成分與靶蛋白的結(jié)合較好,且結(jié)合量呈劑量依賴關(guān)系,但ZYC2與靶蛋白結(jié)合的效果明顯低于ZYC1。因此提示ZYC1具有抑制HBV早期蛋白、HBsAg的作用,且其作用靶點(diǎn)之一可能為EBVEA以及HBsAg,見圖1-圖2。中藥有效部位/成分對(duì)嘴唇干部原激素的抑制作用1.中藥抗致病因子EB病毒也是防治鼻咽癌等惡性腫瘤的有效途徑Raji細(xì)胞是攜帶Epstein-Barr(EB)病毒基因的人淋巴瘤細(xì)胞系,在體外培養(yǎng)過(guò)程中,處于惡性轉(zhuǎn)化狀態(tài),并能持續(xù)增殖。正常情況下EB病毒在Raji細(xì)胞中處于潛伏狀態(tài),不能自發(fā)地產(chǎn)生EB病毒早期抗原,當(dāng)被激活物激活時(shí),EB病毒的早期抗原被激活,其表達(dá)會(huì)增加。因此筆者將此系統(tǒng)作為篩選抗病毒、抗腫瘤中藥的有效方法之一。筆者應(yīng)用曾毅院士建立的誘導(dǎo)E-B病毒早期抗原(EBV-EA)表達(dá)的方法,在原有研究的基礎(chǔ)上,根據(jù)曾毅院士提出的“在鼻咽癌的發(fā)生上,遺傳因素是基礎(chǔ),EB病毒起重要作用,環(huán)境中的促癌物、致癌物起協(xié)同作用”的理論和觀點(diǎn),研究中藥的抗腫瘤作用機(jī)制,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)用中藥不僅是一種天然的免疫調(diào)節(jié)劑,且在一定程度內(nèi)均可以抑制EB病毒早期抗原EA的表達(dá),其抑制率均在90%以上,并具有明顯的量效關(guān)系,其中ZYB2、ZYB4、ZYB5、ZYC1的抑制率較高,在高劑量組達(dá)到了98.15%?？梢酝茰y(cè),抑制EB病毒EBV-EA基因表達(dá)是中藥抗腫瘤的重要途徑之一,從中醫(yī)藥的角度,阻斷促癌因素也是防治腫瘤的重要手段和策略,把從中藥中尋找鼻咽癌致病因子EB病毒有效藥物作為切入點(diǎn),構(gòu)建一種從病因?qū)W角度研究中藥防治腫瘤的技術(shù)平臺(tái)。2.中藥對(duì)鼻咽癌等惡性腫瘤的預(yù)防和治療具有雙重作用鼻咽癌是我國(guó)高發(fā)的頭頸部腫瘤。顯著的地域性分布差異是鼻咽癌流行病學(xué)的突出特征,中國(guó)是世界上鼻咽癌發(fā)病率和病死率最高的國(guó)家。盡管國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)工作者經(jīng)過(guò)幾十年的探索實(shí)踐,在防治方面取得很大的成績(jī),但以手術(shù)、化療、放療為主的綜合治療手段仍不盡如人意,預(yù)后仍較差,雖然早期術(shù)后5年生存率可高達(dá)80%-95%,但中晚期病人僅為10%左右。隨著中藥藥理學(xué)、細(xì)胞分子生物學(xué)等多學(xué)科研究方法和技術(shù)手段的發(fā)展,中藥及其有效成分的抗鼻咽癌等腫瘤作用研究已成為世界性的研究熱點(diǎn)。筆者首先將現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)和中醫(yī)藥學(xué)理論相結(jié)合,利用腫瘤病毒抗原激活實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),在基因水平上探索研究阻斷和降低鼻咽癌致病因子EB病毒的有效途徑和方法,從病因?qū)W的角度研究中藥的腫瘤防治;其次,將細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)和體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)有機(jī)結(jié)合在一起,進(jìn)行中藥抗腫瘤的藥效學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,部分中藥的有效部位/成分,既可以抑制EB病毒EBV-EA基因表達(dá)、確定藥物的作用靶點(diǎn);同時(shí)也具有對(duì)不同分化狀態(tài)鼻咽癌細(xì)胞株的直接抑制/殺傷作用,但其廣泛的分子生物學(xué)作用機(jī)制,及其在臨床中對(duì)有關(guān)疾病的防治意義,有待進(jìn)一步深入研究和探討。中藥的廣譜抗腫瘤作用不僅涵蓋了預(yù)防和治療的雙重作用,同時(shí)也說(shuō)明中藥的抗腫瘤作用是多種有效成分綜合作用的結(jié)果,并與最新的研究進(jìn)展相吻合。2.2.1中藥有效部位/成分對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株的直接抑制/殺傷作用采用:細(xì)胞病變觀察法(cytopathogeniceffect,CPE)與CCK-8法相結(jié)合,進(jìn)行藥效學(xué)檢測(cè),通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和公式計(jì)算:細(xì)胞抑制率(%)=(對(duì)照組OD-藥物組OD)/對(duì)照組OD×100%,獲取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.2.2中藥有效部位/成分抑制EBV-EA表達(dá)的研究:根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選用丁酸+TPA組合(終濃度400ng/mL丁酸+終濃度20ng/mLTPA),作為激活劑。采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),先通過(guò)常規(guī)的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法,確定藥物的最大無(wú)毒劑量。實(shí)驗(yàn)分組按參考文獻(xiàn)進(jìn)行:分為陽(yáng)性對(duì)照組(細(xì)胞+激活劑)、陰性對(duì)照組(細(xì)胞)和藥物組(細(xì)胞+激活劑+藥物)。藥物組劑量從最大無(wú)毒劑量開始,依次按4倍比稀釋,按照文獻(xiàn)的方法檢測(cè)藥物對(duì)EBV-EA表達(dá)的抑制作用。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為:倒置顯微鏡觀察,細(xì)胞大小形態(tài)正常,陰性細(xì)胞呈無(wú)色狀態(tài),陽(yáng)性細(xì)胞呈棕色,每孔計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目,取2孔的平均值,根據(jù)公式計(jì)算抑制率:抑制率(%)=(陽(yáng)性對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)-藥物組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù))/陽(yáng)性對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×100%。2.2.3生物分子相互作用分析技術(shù)(BIA)快速檢測(cè)目的中藥有效部位/成分的藥物靶點(diǎn):病毒蛋白(EBV-EA、HBsAg)與CM5芯片的偶聯(lián):將病毒蛋白用pH值約5.0的醋酸鈉緩沖液配制成濃度為20μg/mL的溶液。按照Biacore系統(tǒng)的操作規(guī)程,先用NHS/EDC活化CM5芯片的葡聚糖表面,再與病毒蛋白偶聯(lián),最后用鹽酸乙醇胺將表面殘留的活化基團(tuán)封閉。即可用于檢測(cè)藥物與病毒蛋白的結(jié)合情況。表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:陰性對(duì)照組無(wú)基因表達(dá),陽(yáng)性對(duì)照組的基因表達(dá)率為10.8%(54/500);中藥的有效部位/成分在一定的劑量范圍內(nèi),對(duì)腫瘤病毒早期抗原的表達(dá)均有明顯的抑制作用,其中ZYB1的最高抑制率為92.59%,ZYC2的最高抑制率為90.74%,其它實(shí)驗(yàn)用藥的最高抑制率均在95%以上。藥效學(xué)方法——CPE與CCK-8法:通過(guò)CPE與CCK-8法相結(jié)合的途徑,檢測(cè)了5種不同藥物的有效部位ZYB1、ZYB2、ZYB3、ZYB4、ZYB5和2個(gè)有效成分ZYC1、ZYC2對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1、CNE-3的抑制/殺傷作用,實(shí)驗(yàn)用藥盡管有很大差異,但在一定范圍內(nèi)均對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)有不同的抑制/殺傷作用,不僅細(xì)