雷公藤模型小鼠生殖內(nèi)分泌改變的實(shí)驗(yàn)研究

雷公藤模型小鼠生殖內(nèi)分泌改變的實(shí)驗(yàn)研究

雷公藤是衛(wèi)矛科植物。它具有驅(qū)風(fēng)、除濕、活血通絡(luò)等功效。根提取物雷公藤多酚（f.，gtw）廣泛用于心血管疾病的治療。上世紀(jì)80年代有學(xué)者報(bào)道其抗生育活性,之后雷公藤動(dòng)物模型成為研究生殖減退的有效模型。本研究以雷公藤生殖減退模型小鼠為研究對象,從其生殖功能改變和內(nèi)分泌激素變化,探討中醫(yī)腎主生殖理論的內(nèi)涵,并用中藥補(bǔ)益腎陽藥物、補(bǔ)益腎陰藥物及補(bǔ)益腎陽藥物與補(bǔ)益腎陰藥物聯(lián)合應(yīng)用,進(jìn)行干預(yù)反證。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1美國普通四方社學(xué)動(dòng)物開發(fā)使用成年BALB/C雄性小鼠104只,體重25g左右。由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號:SYXK(滬)2004-0005;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號0058668。分籠飼養(yǎng)于12h光照,45%左右相對濕度的飼養(yǎng)籠中,自由飲食。1.1.2h測定試劑盒17羥皮質(zhì)醇、HCG、E2、T、FSH測定試劑盒:北京北方生物技術(shù)研究所;雷公藤:上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司,批號091003,規(guī)格10mg×100片。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1大鼠精子畸形模型實(shí)驗(yàn)室條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機(jī)分為正常組22只,造模組70只,肉蓯蓉預(yù)處理組12只(同時(shí)給予雷公藤多苷30mg·kg-1·d-1和肉蓯蓉煎液按照相當(dāng)于生藥10g·kg-1·d-1的劑量0.25mL灌胃)。造模組給予雷公藤多苷30mg·kg-1·d-1灌胃(按照成人1.5mg·kg-1·d-1的20倍計(jì)算),正常組給予生理鹽水灌胃。3周后造模組和正常組各隨機(jī)抽取10只雄鼠觀察精子狀況,與雌鼠合籠1周,觀察雌鼠懷孕率,以與正常組比較出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)為模型成功。將造模組隨機(jī)分為模型組、雷公藤組和肉蓯蓉組、熟地組和熟地蓯蓉組各12只。模型組:給予生理鹽水0.25mL,每日1次灌胃。雷公藤組:雷公藤多苷0.03g·kg-1·d-1;0.25mL,每日1次灌胃。肉蓯蓉組:肉蓯蓉煎液相當(dāng)于生藥10g·kg-1·d-1(按照成人0.5g·kg-1·d-1的20倍計(jì)算);0.25mL,每日1次灌胃。熟地組:熟地煎液相當(dāng)于生藥10g·kg-1·d-1(按照成人0.5g·kg-1·d-1的20倍計(jì)算);0.25mL,每日1次灌胃。熟地蓯蓉組:肉蓯蓉、熟地等比例的煎液相當(dāng)于生藥20g·kg-1·d-1(按照成人1g·kg-1·d-1的20倍計(jì)算);0.25mL,每日1次灌胃。然后按照上面方法繼續(xù)灌胃3周,合籠后,雄鼠留取24h尿液,眼球取血分離血清。1.2.2小鼠精子畸形試驗(yàn)(1)一般狀態(tài)觀察及尿液、血清檢測。一般狀態(tài)的觀察:飲食、活動(dòng)、毛色和尿量等。尿液檢測:放免法檢測絨毛膜促性腺激素(HCG)、17-羥皮質(zhì)類醇(17-OHCS)。血清檢測:放免法雌二醇(E2)、睪酮(T)、促卵泡生成激素(FSH)。(2)雄鼠精子形態(tài)觀察。頸椎脫臼法處死小鼠,分離附睪,分別置于盛有1mL0.9%生理鹽水的培養(yǎng)皿中,將附睪尾剪成小塊,用吸管將懸浮液輕輕吹打5~6次,靜置3~5min,在懸液中加入1%伊紅溶液80μL混勻染色15~20min后,取1滴置于清潔的玻片上,均勻推片,鏡檢。每只動(dòng)物觀察300個(gè)精子細(xì)胞。精子畸變類型包括無鉤、香蕉形、無定形、胖頭、雙頭、雙尾、尾折疊等。(3)雌鼠懷孕率觀察。雌鼠與雄鼠合籠后,雌鼠繼續(xù)正常飼養(yǎng)2周,觀察幼鼠及胎鼠,計(jì)算懷孕率。(4)臟器指數(shù)。睪丸和腎臟臟器指數(shù),臟器指數(shù)(%)=器官重(g)/體重(g)×100%。1.2.3方差分析方法計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,實(shí)驗(yàn)各組之間的比較采用單因素方差分析(onewayANOVA),任意兩組之間的比較采用LSD檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均由SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件完成,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1灌服雷公藤3周和6周前后精子畸形率的比較雷公藤模型小鼠附睪中精子密度和活動(dòng)力大大減少,畸形精子增多,主要表現(xiàn)為頭尾分離和頂體彎曲?；兙颖憩F(xiàn)為無鉤、香蕉形、無定形、胖頭、雙頭、頭頸斷裂、頸部斷端高度卷曲、尾部膨大、雙尾和尾折疊等。小鼠灌服雷公藤3周和6周后精子畸形率見表1。小鼠灌服雷公藤3周組與正常對照1組比較,精子畸形率顯著上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.05;灌服雷公藤6周組與正常對照2組比較,精子畸形率進(jìn)一步上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.01;說明雷公藤的生殖毒性有時(shí)間依賴性。2.2各組交配成蟲和模型大鼠分娩情況比較前期研究發(fā)現(xiàn),通過給雄鼠不同劑量的雷公藤多苷,觀察不同時(shí)間點(diǎn)與各組雄鼠交配的雌鼠的懷孕率,發(fā)現(xiàn)雌鼠懷孕率隨雄鼠服用雷公藤多苷時(shí)間延長和劑量增加呈下降趨勢。本次實(shí)驗(yàn)雷公藤灌服3周模型組與正常組交配雌鼠懷孕率比較有顯著差異,P<0.01;雷公藤持續(xù)灌服6周雄鼠,交配雌鼠懷孕率為0;肉蓯蓉預(yù)防組交配雌鼠懷孕率亦為0;肉蓯蓉組、熟地組和熟地蓯蓉組與模型組比較無明顯差異,P>0.05,見表2。經(jīng)卡方檢驗(yàn),模型組與正常組有顯著差異,P<0.01;肉蓯蓉組、熟地組、熟地蓯蓉組與模型組相比無顯著差異。2.3對雷公藤、肉嫩、結(jié)構(gòu)施的影響睪丸臟器指數(shù)在各組間有顯著差異,模型組較正常組降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.01;雷公藤組較正常組降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01,較模型組進(jìn)一步降低,P<0.01;肉蓯蓉組、熟地組和熟地蓯蓉組與模型組比較無明顯差異,P>0.05;肉蓯蓉預(yù)防組與雷公藤組比較無明顯差異,P>0.05,見表3。2.4肉桃預(yù)防組和模型組尿17羥皮質(zhì)醇含量比較模型組尿17羥皮質(zhì)醇值與正常組比較有顯著差異(P<0.05);肉蓯蓉組、熟地組、熟地蓯蓉組和肉蓯蓉預(yù)防組與模型組比較有顯著差異(P<0.05),見表4。模型組尿17羥皮質(zhì)醇含量較正常組明顯降低,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;肉蓯蓉組、熟地組、熟地蓯蓉組和肉蓯蓉預(yù)防組相對于模型組均有改善,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,肉蓯蓉組、熟地組、熟地蓯蓉組和肉蓯蓉預(yù)防組之間則無差異。2.5肉莎、濕地施、肉纖維模型各組t值、e/t值的比較模型組T值與正常組相比有顯著差異(P<0.05),E2/T值與正常組相比有顯著差異(P<0.05),熟地蓯蓉組T值與模型組相比有顯著差異(P<0.05),見表5。模型組T值下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.05;肉蓯蓉組對T值有上調(diào)作用,但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05;熟地蓯蓉組對T值的上調(diào)作用達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.05;模型組E2呈上升趨勢,熟地蓯蓉組有下調(diào)E2的趨勢,肉蓯蓉有預(yù)防E2上升的趨勢,但均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05;E2/T值,模型組有升高趨勢,肉蓯蓉組和肉蓯蓉預(yù)防組有下降趨勢,但均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05;在這組數(shù)據(jù)中,肉蓯蓉組和熟地組未顯示出有意義的干預(yù)作用。2.6各組尿hcg值比較雷公藤陽虛模型各組FSH值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P>0.05);模型組尿HCG值較正常組有顯著差異(P<0.01),肉蓯蓉組、熟地組、熟地蓯蓉組和肉蓯蓉預(yù)防組尿HCG值較模型組有顯著差異(P<0.01),見表6。模型組尿HCG值升高,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01;肉蓯蓉組、熟地組、熟地蓯蓉組3個(gè)干預(yù)組和肉蓯蓉預(yù)防組對尿HCG值均有下調(diào)作用,且顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01;各組FSH值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05。3肉纖維—討論腎是人體內(nèi)重要臟腑之一,腎藏先天之精,主生殖,為人體生命之本原,素有“先天之本”之稱。腎精,是人體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。腎的精氣盛衰,關(guān)系到生殖和生長發(fā)育的能力。人從幼年開始,腎的精氣逐漸充盛,就有齒更發(fā)長等變化;發(fā)育到青春時(shí)期,腎的精氣充盛,產(chǎn)生了一種“天癸”的物質(zhì),于是男子就產(chǎn)生精子,女子就開始按期來月經(jīng),性機(jī)能逐漸成熟,而有生殖的能力;待到老年,腎的精氣漸衰,性機(jī)能和生殖能力隨之減退至消失,形體也就逐漸衰老,這就是腎的精氣在主持人體生長,發(fā)育和生殖功能方面的重要作用。人的生殖功能的發(fā)育、成熟、衰退都與下丘腦─垂體─性腺軸的功能有密切關(guān)系,它類似于中醫(yī)“腎”主生殖的全部內(nèi)容,其中“天癸”應(yīng)包括了這條軸上各器官所分泌的各種激素及它們相互之間的互為依存,互相抑制的關(guān)系。睪丸由曲細(xì)精管內(nèi)的生殖細(xì)胞發(fā)育成精子,支持細(xì)胞合成雌激素,在局部影響精子的生成。睪丸的間質(zhì)細(xì)胞能合成和分泌雄激素,如睪酮、雄烯二酮、去氫異雄酮。睪酮的生物活性最強(qiáng),能夠刺激精細(xì)管發(fā)育,啟動(dòng)和維持精子發(fā)生。FSH促進(jìn)生精上皮發(fā)育和精子產(chǎn)生。HCG促進(jìn)睪丸發(fā)育,并合成與分泌睪酮和雄激素。對于雷公藤引起的生殖內(nèi)分泌激素的改變有不同的報(bào)道。本研究制作雷公藤模型灌胃3周后,出現(xiàn)不同程度的體重下降、弓背蜷縮、行動(dòng)遲緩、嗜睡、倦怠懶動(dòng)、反應(yīng)遲鈍、喜扎堆、體毛枯萎等一系列類似中醫(yī)的腎陽虛癥狀,正常組小鼠沒有上述表現(xiàn),且模型組尿17羥皮質(zhì)醇含量較正常組明顯降低,提示雷公藤生殖減退模型也是腎陽虛模型。通過補(bǔ)益腎陽藥物、補(bǔ)益腎陰藥物及聯(lián)合應(yīng)用補(bǔ)益腎陽藥物和補(bǔ)益腎陰藥物進(jìn)行干預(yù),觀察模型小鼠精子形態(tài)改變,配對雌鼠懷孕率,睪丸與腎臟的臟器指數(shù),睪酮(T)、雌激素(E2)、促卵泡生成激素(FSH)、尿絨毛膜促性腺激素(HCG)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷公藤模型小鼠精子畸形率較正常組明顯增加,配對小鼠懷孕率明顯降低,睪丸臟器指數(shù)明顯降低;T下降,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;E2升高,但尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;E2/T上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;FSH變化不明顯;尿HCG明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)肉蓯蓉、熟地干預(yù),各項(xiàng)指標(biāo)均有不同程度改善,以肉蓯蓉熟地聯(lián)合用藥作用較