一株家制乳粉中放射毛霉的分離鑒定

一株家制乳粉中放射毛霉的分離鑒定

腐爛是中國(guó)的一種具有地域特色的發(fā)酵食品，已有1000多年的歷史。它是用豆?jié){的凝乳狀物經(jīng)微生物發(fā)酵制成的一種干酪型產(chǎn)品,營(yíng)養(yǎng)豐富,口感細(xì)膩,風(fēng)味獨(dú)特,含有多種生理活性成分及保健功能,深受海內(nèi)外人民的喜愛(ài),許多歐美地區(qū)的人稱之為中國(guó)干酪(Chinesecheese)。自古以來(lái),腐乳的生產(chǎn)遍布中國(guó)各地,但以浙江的紹興、杭州、江蘇的無(wú)錫、蘇州、廣西的桂林、四川的五通橋最負(fù)盛名。20世紀(jì)50年代中期以來(lái),由于搞清了發(fā)酵菌種的問(wèn)題,腐乳的生產(chǎn)由自然接種逐漸轉(zhuǎn)為人工接種,毛霉是人工接種法生產(chǎn)腐乳的主要菌種。在前期培菌過(guò)程中,將純培養(yǎng)毛霉菌孢子制成的菌懸液或粉狀菌種噴灑在豆腐坯上培養(yǎng)長(zhǎng)毛,給腐乳一個(gè)良好的“體”,并分泌蛋白酶分解豆腐乳中的蛋白質(zhì),使產(chǎn)品具有良好的品味。因此,毛霉菌種的優(yōu)劣直接影響到腐乳的產(chǎn)量和質(zhì)量。作者采用點(diǎn)樣初篩和固體發(fā)酵復(fù)篩相結(jié)合的方法,以家制毛豆腐為菌源,篩選到一株產(chǎn)蛋白酶活力較高的生產(chǎn)菌。根據(jù)形態(tài)學(xué)分析并結(jié)合18SrDNA序列分析,驗(yàn)證了該生產(chǎn)菌為雅致放射毛霉,確定了其在分類學(xué)上的地位,并為進(jìn)一步研究新型腐乳的工藝提供良好的試驗(yàn)菌株。1材料和方法1.1該菌株的來(lái)源由家制腐乳毛坯上分離得到。1.2液加熱溶解法馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)培養(yǎng)基;分離純化培養(yǎng)基:在PSA培養(yǎng)基中加入1g/L脫氧膽酸鈉;酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基:干酪素2g,先用20mL0.1mol/LNaOH溶液加熱溶解后,再加2g瓊脂,用蒸餾水煮沸溶解后定容至100mL后滅菌備用;察氏(Czapek’s)培養(yǎng)基;固體發(fā)酵培養(yǎng)基:豆粕7g,麩皮3g,H2O11mL,裝入250mL三角瓶拌勻,滅菌后及時(shí)振散備用;豆腐塊培養(yǎng)基:將市售豆腐(凝固劑為石膏)切成2cm×2cm×2cm小塊,裝入已滅過(guò)菌的250mL三角瓶中,每瓶一塊;豆汁培養(yǎng)基:取黃豆500g,加水1000mL后煮沸1h,再用雙層紗布過(guò)濾,所得濾液補(bǔ)水至1000mL后滅菌備用。以上培養(yǎng)基均為121℃滅菌20min。1.3細(xì)菌篩選1.3.1單菌落的培養(yǎng)取5g毛坯于三角瓶中,加入100mL無(wú)菌生理鹽水,攪拌搖勻,用稀釋分離法培養(yǎng)單菌落。挑取生長(zhǎng)速度快、菌絲豐滿、純白的單菌落轉(zhuǎn)接入斜面培養(yǎng)基,之后將菌懸液接入純化培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng),待長(zhǎng)出單菌落移接斜面,重復(fù)4次后,轉(zhuǎn)接于PSA斜面保存?zhèn)溆谩?.3.2菌落直徑之比和直徑測(cè)定采用透明圈法。把菌懸液接入干酪素培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)48h,加入幾滴0.25mol/L三氯乙酸(TCA)沉淀未被分解的酪蛋白,于4℃冰箱放置48h后,分別測(cè)定平皿中透明圈和菌落直徑之比,比值較大的菌落接入斜面培養(yǎng)基。1.3.3蛋白酶活力測(cè)定取0.5mL菌懸液(孢子數(shù)為106個(gè)/mL),接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,搖勻,28℃培養(yǎng)48h。取一定量的鮮曲,制備得酸性、中性、堿性蛋白酶粗酶液后,測(cè)定相應(yīng)的蛋白酶活力。其中,測(cè)定酸性、中性、堿性蛋白酶時(shí),所用的緩沖液分別為pH3.0乳酸—乳酸鈉緩沖液、pH7.2磷酸緩沖液、pH10.0硼砂—?dú)溲趸c緩沖液。蛋白酶活力測(cè)定采用Fulin-酚法。40℃下每分鐘水解干酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為1個(gè)酶活力單位(U)。1.3.4發(fā)酵試驗(yàn)將毛霉菌懸液裝在噴霧接種器內(nèi),噴灑在豆腐坯上,要求五面均勻,在28℃條件下培養(yǎng),觀測(cè)其生長(zhǎng)、發(fā)酵情況。1.4識(shí)別菌株1.4.1易學(xué)將分離篩選得到的菌株在PSA培養(yǎng)基上觀察其菌落形態(tài),在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株的菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)。1.4.2ddh2o-rnase法將收集好的菌體烘干,用鑷子搗碎,取0.5g干菌絲于5mL離心管中,分別加入1mLTES液體(1mmol/LTris,0.5mmol/LEDTA,100g/LSDS),劇烈振蕩后,加50μL10μg/mLRNase,65℃放置10min,加入600μL7.5mol/L乙酸銨溶液,冰浴8min,8000r/min離心5min,轉(zhuǎn)移上清液至另一無(wú)菌的5mL離心管中,加入等體積的酚、氯仿,8000r/min離心5min,再轉(zhuǎn)移上清液至另一無(wú)菌的1.5mL離心管中,加入2.5倍無(wú)水乙醇,8000r/min離心2min,棄上清液,每升溶液加入750mL乙醇洗,8000r/min離心2min,棄上清液后,把離心管置于37℃培養(yǎng)箱中,待乙醇揮發(fā)完全,加適量ddH2O溶解沉淀。1.4.3accggagagacaac使用真菌18SrDNA的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。上游:5′—ACCGGAATTCGCCTGAGAAACGGCTACC—3′下游:5′—ACCGGAATTCGGCAGGGACGTAATCAAC—3′1.4.4pcr反應(yīng)總引物及循環(huán)參數(shù)反應(yīng)體系為:取DNA模板2μL,PCR緩沖液5μL,MgCl22μL,dNTP4μL,上下游18S通用引物各1μL,TaqDNA聚合酶1μL,總反應(yīng)體積為50μL。循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性4min,94℃50s,52℃50s,72℃90s,35個(gè)循環(huán),72℃延伸10min。取擴(kuò)增產(chǎn)物10μL用8g/L瓊脂糖凝膠電泳,觀測(cè)結(jié)果。1.4.5膠回收產(chǎn)物濃度測(cè)定用膠回收博大泰克試劑盒純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,電泳驗(yàn)證,上海申速生物公司測(cè)定膠回收產(chǎn)物18SrDNA序列。測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)中進(jìn)行Blast后交送GenBank庫(kù),與數(shù)據(jù)庫(kù)已有序列進(jìn)行比較分析。1.5菌體干重的測(cè)定采用直接干燥法。將振蕩培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)物用預(yù)先測(cè)定干重的定性濾紙濾得菌體后,水洗兩次,然后在連同濾紙一起在105℃條件下烘干至恒重,測(cè)其質(zhì)量,從而算出菌體干重。2結(jié)果與討論2.1透明圈直徑和菌落直徑之比篩選到的單菌落在28℃下于酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h,測(cè)定透明圈直徑和菌落直徑之比。此毛霉菌株的透明圈直徑和菌落直徑分別為6~7cm和3~4cm,透明圈直徑和菌落直徑比值大約1.5~2.0,這說(shuō)明此毛霉菌株產(chǎn)蛋白酶的情況良好。2.2中性和酸性蛋白酶活力比較毛霉菌株的各種蛋白酶活力見(jiàn)圖1。結(jié)果表明,中性和堿性蛋白酶活力較高,達(dá)1100U/g干曲,酸性蛋白酶活力較低,這說(shuō)明毛霉產(chǎn)生以中性和堿性蛋白酶為主的蛋白酶系。由于腐乳后酵過(guò)程的酸度近于中性,所以起作用的蛋白酶是中性蛋白酶。2.3生長(zhǎng)及發(fā)酵情況觀察毛霉在豆腐坯上于28℃培養(yǎng)48h后的生長(zhǎng)及發(fā)酵情況。表1表明,在28℃條件下,此毛霉菌株的生長(zhǎng)、發(fā)酵情況較好,是良好的釀造腐乳的毛霉菌株。2.4松生長(zhǎng)和生長(zhǎng)將毛霉接種于PSA培養(yǎng)基上,于28℃下培養(yǎng)。12h時(shí)出現(xiàn)菌苔;24h時(shí)出現(xiàn)白色絨毛菌絲,菌絲體較疏松,直立并蔓延,高度可達(dá)1cm左右;36h時(shí)菌絲白色,菌叢高度可觸及皿蓋,菌絲體變得緊密整齊;48h時(shí)菌絲直立,旺盛,致密,白色,有較多的深黃色狀孢子囊出現(xiàn);60h時(shí)菌絲變成銀白色,菌叢布滿整個(gè)平皿,形成大量深黃色孢子囊;72h時(shí),生長(zhǎng)減弱,菌絲部分收縮,倒毛,淺黃色;84h時(shí)菌絲全部倒毛,呈銀灰色。2.5毛霉序列及測(cè)序分析菌絲白色,無(wú)橫隔,有匍匐菌絲和不發(fā)達(dá)的假根,色澤同菌絲。營(yíng)養(yǎng)菌絲能滲入瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)1.5~2.0mm,氣生菌絲廣泛蔓延伸展,衰老時(shí)出現(xiàn)不少厚垣孢子,色深,卵形或橢球形,氣生菌絲直徑8~19μm;孢囊梗白色,無(wú)橫隔膜,直徑12~20μm,直接由氣生菌絲生出,單生,直立,孢囊梗在近頂端處常有分枝,呈單軸式,各分枝及主枝頂端均生孢子囊。孢子囊呈球形,直徑約為63~91μm,分枝上的較小,直徑約為20~50μm;較嫩時(shí)色淺、表面光滑,老熟時(shí)色深、表面粗糙有針刺狀突出;最后囊壁碎裂釋放出孢子和囊孢子,露出囊軸。囊軸呈卵形、洋犁形等形狀,表面光滑,個(gè)體大小差異較大,一般為(43~65)μm×(24~46)μm。孢子囊孢子呈球形,直徑大約在7~10μm。利用BLAST軟件將該毛霉序列與NCBI收錄的DNA序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明,該序列與O’DonnellK和魯緋報(bào)道的Actinomucorelegans的18SrDNA序列相似性最高,為99.5%。根據(jù)毛霉的形態(tài)特征和18SrDNA序列對(duì)比分析,鑒定該菌屬于毛霉屬的雅致放射毛霉(Actinomucorelegans),編號(hào)為WL3.006。2.6優(yōu)雅輻射的生長(zhǎng)條件和生理特性2.6.1培養(yǎng)培養(yǎng)絲液中整株樹(shù)木干重測(cè)定在豆汁培養(yǎng)基(40mL/瓶)中,接入毛霉孢子懸液后,于28℃、150r/min下振蕩培養(yǎng)。每隔12h取出3瓶,離心收集菌絲體,測(cè)其干重,求其平均值。以該值為縱軸,以時(shí)間為橫軸繪圖,結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢?jiàn),雅致放射毛霉在豆汁培養(yǎng)基的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大約在12~36h,穩(wěn)定期大約在36~60h,之后就屬于衰退期,而且,生長(zhǎng)量高達(dá)225mg/40mL。2.6.2生長(zhǎng)溫度對(duì)毛霉的影響將毛霉接種于PSA培養(yǎng)基中,置于不同溫度下培養(yǎng),每隔12h觀測(cè)一次,觀測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,雅致放射毛霉的最適生長(zhǎng)溫度為25~28℃,在48~60h時(shí)菌叢較高,而且絨密潔白;20~25℃下生長(zhǎng)良好,不過(guò)20℃時(shí)生長(zhǎng)相對(duì)緩慢,但菌叢一直為純白;35℃時(shí)毛霉菌絲的生長(zhǎng)有所抑制,菌叢較低而稀疏,60h時(shí)菌叢變成淺黃色,84h時(shí)菌叢已經(jīng)明顯干縮;而在40℃時(shí),毛霉未長(zhǎng)。2.6.3淀粉種類對(duì)發(fā)酵碳源培養(yǎng)基菌體干重的影響以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別以葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和淀粉為碳源(質(zhì)量濃度均為30g/L),制成相應(yīng)碳源培養(yǎng)基。重復(fù)3次。接種后于28℃、150r/min下培養(yǎng)48h。取出后過(guò)濾得菌體,并測(cè)其菌體干重,結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢?jiàn),單糖比雙糖對(duì)菌體的生長(zhǎng)更加有利,淀粉介于兩者之間。而且,在單糖中,以果糖為佳,所以在察氏培養(yǎng)基中以果糖為最佳碳源,此時(shí)毛霉生長(zhǎng)較良好。2.6.4有機(jī)氮源對(duì)菌體干重的影響以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ),以果糖為碳源,并分別以硝酸鈉、硫酸銨、硝酸銨、尿素、牛肉浸膏、蛋白胨和酵母浸出汁為氮源(質(zhì)量濃度均為3g/L),制成相應(yīng)的氮源培養(yǎng)基。3次重復(fù),每重復(fù)為40mL培養(yǎng)基。接種后在28℃、150r/min下培養(yǎng)48h。取出后過(guò)濾得菌體,并測(cè)其菌體干重,結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明,有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源有利于菌體的生長(zhǎng),而在有機(jī)氮中以牛肉浸膏較好。因此,確定最佳氮源是牛肉浸膏。2.6.5起始ph對(duì)毛霉生長(zhǎng)的影響以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ),碳源、氮源分別為果糖和牛肉浸膏,再用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)到一定pH值。3次重復(fù),每重復(fù)為40mL培養(yǎng)基。接種后于28℃、150r/min下培養(yǎng)48h。取出后過(guò)濾得菌體,并測(cè)其菌體干重,結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5看出,起始pH大于6時(shí),生長(zhǎng)量較高,毛霉生長(zhǎng)良好,而當(dāng)起始pH值為4~6時(shí),生長(zhǎng)量相對(duì)較低,毛霉生長(zhǎng)受到抑制,在pH≤4時(shí),毛霉幾乎不能生長(zhǎng)。所以,雅致放射毛霉的最適生長(zhǎng)起始pH值為6~7。而普通的豆腐白坯的pH值一般均在6左右,因此,豆腐白坯的pH值均適合此雅致放射毛霉菌株的生長(zhǎng)。2.6.6nacl對(duì)所致放射性毛霉的生長(zhǎng)抑制作用以豆汁培養(yǎng)基為對(duì)照,并以它為基質(zhì),分別調(diào)整NaCl質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50、60、80、100g/L。3次重復(fù),每重復(fù)為40mL培養(yǎng)基。接種后在28℃、150r/min下培養(yǎng)48h。取出后過(guò)濾得菌體,并測(cè)其菌體干重,結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知,NaCl質(zhì)量濃度在20g/L以下能促進(jìn)雅致放射毛霉的生長(zhǎng);NaCl質(zhì)量濃度在40~60g/L的對(duì)雅致放射毛霉的生長(zhǎng)有了明顯的抑制;NaCl質(zhì)量濃度在80g/L以上使雅致放射毛霉幾乎不能生長(zhǎng)。因此,我國(guó)傳統(tǒng)的腐乳生產(chǎn)腌制毛坯時(shí)所用的食鹽質(zhì)量濃度一般控制在100g/L左右,足以防止毛霉菌的存活和生長(zhǎng),保證了腐乳產(chǎn)品的風(fēng)味和質(zhì)量。2.6.7生長(zhǎng)機(jī)理測(cè)定及其對(duì)所致放射性毛霉菌株生長(zhǎng)的影響以豆汁培養(yǎng)基為對(duì)照,并分別添加CaSO4·2H2O和MgSO4·7H2O,調(diào)整培養(yǎng)基中Ca2+和Mg2+質(zhì)量濃度分別為0,0.1,0.5,1,2,5g/L。3次重復(fù),每重復(fù)為40mL培養(yǎng)基。接種后于28℃、150r/min下培養(yǎng)48h。取出后過(guò)濾得菌體,并測(cè)其菌體干重,結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知,在試驗(yàn)范圍內(nèi),0.1~5g/LCa2+能促進(jìn)雅致放射毛霉菌株生長(zhǎng),其最大生長(zhǎng)量在5g/LCa2+處;而0.1~5g/LMg2+也能促進(jìn)雅致放射毛霉菌體的生長(zhǎng),其最大生長(zhǎng)量在2g/LMg2+處。所以,適量的Ca2+和Mg2+對(duì)雅致放射毛霉菌株的生長(zhǎng)是