基因工程-6-重組DNA構(gòu)建與篩選

第二節(jié)重組DNA分子構(gòu)建

一、粘末端DNA片段的連接（一）具有相同粘末端的連接EcoRIHindIIIEcoRI載體酶切HindIIIEcoRI對基因酶切（二）具有不同粘性末端的連接用兩種不同的限制性內(nèi)切酶對載體和外源DNA進行切割后，在它們兩端會產(chǎn)生非互補的突出端，經(jīng)DNA連接酶連接后即產(chǎn)生定向重組體。

HindIII二、平末端DNA片段的連接（一）直接用T4連接酶連接（二）同聚物加尾法優(yōu)點：接“尾”后的載體不能自身環(huán)化，提高了轉(zhuǎn)化效率。

缺點：①可能改變目的基因或載體的閱讀框，影響外源DNA表達

②外源DNA無法收回

（三）銜接物連接法銜接物是指用化學方法合成的一段由10～12個核苷酸組成，具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。（四）

DNA接頭連接法

接頭的一端是齊平的，而另一端是某種內(nèi)切酶的粘性末端（五）

PCR引入酶切位點（六）

cDNA與載體的連接1.防止載體自身環(huán)化的措施

1、堿性磷酸酶脫磷酸基法

2、雙酶切法

3、過量法：基因片段：載體（5:1or10:1)

2.影響連接的因素

1、基因片段大小小>大

2、基因與載體比例5:1-10:1

3、連接酶用量1u/ug載體DNA

4、連接溫度16℃12小時

5、ATP用量

1mM（終濃度）三、重組DNA連接注意事項第三節(jié)基因轉(zhuǎn)移一、重組DNA導入大腸桿菌

（一）轉(zhuǎn)化

將外源DNA分子導入某一宿主細菌細胞的過程都叫轉(zhuǎn)化。

為了有效地使細菌吸收外源的DNA分子，我們通常要對它們進行一些物理或化學的處理，處理后的細胞吸收外源DNA的能力大大提高，被稱為感受態(tài)細胞。1、轉(zhuǎn)化過程

E.coli：感受態(tài)細胞＋重組DNA分子加入LB擴增

涂布選擇性平板

2、DNA分子轉(zhuǎn)化受體細胞過程①吸收：DNA分子吸附于受體菌表面②轉(zhuǎn)入：雙鏈DNA分子解鏈，單鏈DNA進入，另一條鏈降解③自穩(wěn)：進入細胞內(nèi)的單鏈又復制成雙鏈環(huán)狀DNA④表達：目的基因隨載體同時被復制，轉(zhuǎn)錄，翻譯3、質(zhì)粒DNA的大小及構(gòu)型對轉(zhuǎn)化效率的影響（1）大?。?0Kb，轉(zhuǎn)化效率很低（2）構(gòu)型超螺旋＞環(huán)形＞線狀4、感受態(tài)細胞能接受外來DNA分子的本質(zhì)：

4.1局部原生質(zhì)體化假說細胞表面的細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即局部失去細胞壁或局部溶解細胞壁，使DNA分子能通過質(zhì)膜進細胞。證據(jù)有：

（1）發(fā)芽的芽孢桿菌容易轉(zhuǎn)化；

（2）大腸桿菌的原生質(zhì)體不能被噬菌體感染，卻能受噬菌體DNA轉(zhuǎn)化；

（3）適量的溶菌酶能提高轉(zhuǎn)化率。

4.2酶受體假說感受態(tài)細胞的表面形成一種能接受DNA的酶位點，使DNA分子能進入細胞。證據(jù)是：（1）蛋白質(zhì)合成的抑制劑如氯霉素，可以抑制轉(zhuǎn)化作用；

（2）細胞分裂過程中，一直有局部原生質(zhì)化，但感受態(tài)只在生長對數(shù)期的中早期出現(xiàn)；

（3）分離到感受態(tài)因子，能使非感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺芗毎?。（二）轉(zhuǎn)染（2）λ噬菌體的體外包裝轉(zhuǎn)染(transfection)：是指感受態(tài)的受體細胞捕獲和表達以噬菌體為載體的重組DNA分子的過程。（1）轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)染的區(qū)別轉(zhuǎn)導(transduction)：通過λ噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNA轉(zhuǎn)移到受體細胞的過程。轉(zhuǎn)染：λ噬菌體DNA分子直接導入受體細胞的過程。

（三）電激法(electroperation)

電激法是利用高壓電脈沖的作用對原生質(zhì)體或細胞擊出微孔而使基因轉(zhuǎn)移的一種新方法?？赡鎿舸簱舸┬】卓稍谝欢〞r間內(nèi)復原。不可逆擊穿：擊穿小孔不可修復，處理細胞成活率低。1.電轉(zhuǎn)化流程（1）電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備（2）電轉(zhuǎn)化操作程序電擊復蘇涂布（3）電擊杯清洗二、重組DNA導入植物細胞的方法

（一）載體介導的轉(zhuǎn)化方法

1、共培養(yǎng)法(cocultivation)

（1）原生質(zhì)體共培養(yǎng)法

取含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌同剛剛長出細胞壁的原生質(zhì)體作短暫的共培養(yǎng)，促使農(nóng)桿菌和植物細胞之間發(fā)生遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。（2）葉盤共培養(yǎng)法

優(yōu)點：適用性廣，對于那些能被農(nóng)桿菌感染的、并能從葉子再生植株的各種植物均適用。2、活體接種(inoculationinvivo)

（二）病毒介導的基因轉(zhuǎn)移

（1）雙鏈DNA病毒轉(zhuǎn)化載體

花椰菜花葉病毒（簡稱CaMV,CaullinusMozicVirus）。

（2）單鏈DNA病毒轉(zhuǎn)化載體

雙聯(lián)體病毒或?qū)\生病毒感染范圍較廣，包括單子葉和雙子葉植物，它們的傳播媒介是昆蟲。

（4）激光微束法(lasermicrobeam)

（5）超聲波法

（6）離子束法（3）電激法(electroperation)（2）微注射法（micro-injection）（三）DNA直接導入法

（1）基因槍法1、物理方法

（1）基因槍法

80年代末期，由康奈爾大學的Sanford最先提出，主要是為了克服以往各種基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的局限。該方法是利用一種物理儀器裝置，將鎢、金等金屬微粒加速沖擊細胞，把細胞擊孔，使目的基因進入受體。

基因槍所用材料：（1）鎢粉使用起來經(jīng)濟實惠，也可以得到較好的轉(zhuǎn)化效果；但容易被氧化，顆粒易聚集，并且對植物細胞的毒害也比金粉大。（2）將DNA包被到微載體上所用的試劑有亞精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等，但多用前兩種。（3）所用動力系統(tǒng)：火藥爆炸力電弧放電高壓氣體基因槍法的特點：（1）轉(zhuǎn)化效率高。（2）受體廣泛。（3）操作簡單。（2）微注射法（micro-injection）

微量注射：用注射針或微針在受體細胞或組織穿刺成孔，DNA隨穿刺孔進入細胞或隨穿刺針頭—道進入。

顯微注射：利用顯微注射儀，通過機械方法把外源DNA直接注入細胞質(zhì)或細胞核的基因轉(zhuǎn)化方法。常用的細胞固定方法有3種：一、瓊脂糖包埋法二、多聚賴氨酸粘連法三、吸管支持法（3）花粉管道法（2）脂質(zhì)體法（三）DNA直接導入法

（1）PEG法1、化學方法

（3）花粉管通道法（pollen-tubepathway）

在顯花植物中利用花粉在柱頭上萌發(fā)進入胚囊所留下的通道，將外源基因滲入到胚囊中的基因直接轉(zhuǎn)移方法。（2）DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染技術(shù)

（3）電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)

（4）脂質(zhì)體載體法（5）細胞核的顯微注射法

三、重組DNA導入動物細胞的方法

（1）磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)

（6）活體電穿孔技術(shù)

活體電穿孔法(invivoelectroporation)是將外源基因通過電場作用，導入動物目標組織或器官?；铙w電穿孔法的特點：靶器官的選擇面廣對導入的外源基因片段的大小沒有限制,從幾KB或十幾KB的表達載體,到100～200KB的YAC、BAC基因組,都有成功導入并獲得表達的報道?；铙w電穿孔法操作簡單快速,電穿孔的時間只有幾秒鐘,而且DNA片段不需要特殊的純化操作。研究實例一殺蚊毒素在大腸桿菌中的異源表達Thetoxiniscomposedoftwoproteins,BinAandBinB,withapproximatemolecularweightsof42and51kDa,respectively.Thetwoproteinsrequireeachotherforfullactivity,andmaximumactivityisobtainedwhenbothcomponentsarepresentinequimolarratio.1.背景介紹2.外源基因的獲得PCR引物：BinABS51F;5’-CGA

AGC

TTGTGCGATTCAAAAGACAAT-3’BS51R;5’-CCT

CGA

GAATGAATATTTGAATTTAAAGAG-3’BinBBS42F;5’-GAA

GCT

TGAGAAATTTGGATTTTATTGATT-3’BS42R;5’-GGCGGT

CGA

CTTAGTTTTGATCATCTGTAATA-3’Therestrictionsitesaddedatthe5’endoftheseprimers(HindIIIinBS42FandBS51F,SalIinBS42R,andXhoIinBS51R)areunderlined.GenesencodingBinAandBinBwereamplifiedfromplasmidpET-42fandpET-51fFigSchematicdiagramofpGEX-BinAandpGEX-BinB.Polymerasechainreaction(PCR)productsofbinAandbinBgenesweredigestedwithHindIIIatthe5’endandmadebluntendedusingKlenowpolymerase.The3’endofbinAwasdigestedwithSalI,whereasXhoIwasusedforbinB.ThedigestedfragmentsthenwereligatedtopGEX-4T-2betweenSmaIandXhoIsites.2.重組DNA構(gòu)建3.重組子篩選與表達EscherichiacoliJM109containingpGEX-BinAorpGEXBinBwasgrowninLuria-Bertani(LB)brothcontaining100lgofampicillin/mluntilOD600reached0.4.Toinduceproductionofthetoxin,1mmol/lisopropyl-b-D-thiogalactopyranoside(IPTG)wasadded,andtheculturewasfurthergrownfor5h.Theinducedculturethenwascollectedandanalyzedbysodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis(SDS).4.表達產(chǎn)物活性測試第四節(jié)重組DNA分子的篩選外源基因與載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌可能的三種情況：（1）（2）（3）轉(zhuǎn)化E.coli一、重組體的篩選遺傳檢測方法抗藥性標記插入失活β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)插入序列表型特征免疫化學方法

免疫沉淀法放射性抗體檢測核酸雜交方法轉(zhuǎn)譯篩選法（一）遺傳檢測方法

原理：

根據(jù)載體DNA分子上的篩選標記賦予受體細胞在篩選平板

上表型的變化。如抗藥性引起生長與不長；顏色變化等。

方法：

①插入失活抗生素平板篩選法（pBR322系統(tǒng)）

由于外源DNA的插入引起抗藥性失活——插入失活插入失活-環(huán)絲氨酸篩選法四環(huán)素+環(huán)絲氨酸氨芐青霉素②插入不分泌奶粉平板篩選法（B.SpNC3系統(tǒng)）

由于外源基因的插入而影響蛋白酶的分泌無外源DNA插入當插入外源DNA時當DNA不插入時NprE表達分泌溶解酪蛋白產(chǎn)生透明圈當DNA插入時NprE不表達不分泌不溶解酪蛋白不產(chǎn)生透明圈

③顯色平板篩選法（pUC系統(tǒng))

④插入序列表型特征(二)免疫化學篩選法

原理

以目的基因在受體細胞中的表達產(chǎn)物作抗原，

以動物制備抗體，通過抗原抗體反應(yīng)而將帶有目

的基因的克隆篩選出來。

方法

①免疫沉淀法

適應(yīng)于：高表達；外分泌克隆篩選

克隆沉淀線含抗體平板②放射免疫篩選法

1.放射免疫篩選過程

A、制備抗原：培養(yǎng)菌落

（噬菌斑）

B、制備抗體：免疫動物

C、抗原抗體反應(yīng)

D、檢測：放射自顯影

E、選出重組體2.放射免疫篩選法優(yōu)點：

①可以選出無表型特征的克隆

②可以選出表達融合蛋白的基因克隆

3.放射免疫篩選法缺點：

①必須是表達載體

②需要放射性物質(zhì)——同位素：污染昂貴

(三)核酸雜交方法探針（probe）：用來探知被測物存在的小分子DNA