曼地亞紅豆杉葉片低溫半致死溫度與膜保護系統(tǒng)適應性研究

曼地亞紅豆杉葉片低溫半致死溫度與膜保護系統(tǒng)適應性研究

子松醇是一種具有特殊抗癌活性的二氧化合物，通常是從蘑菇的樹皮中分離出的。作為一種新型的抗癌藥物，它對癌癥、乳腺癌、肺癌和其他癌癥有了很好的治療作用。分布在北美的加拿大馬地亞諾發(fā)現(xiàn)生長迅速、易于種植。此外，紅杉的枝葉中還含有大量的紫杉醇。種植后35年后，它可以收獲樹枝和葉子。因此，在中國科學研究了物種轉變后對生物學和生態(tài)的反應。因此，盡管沒有關于曼地亞紅杉在中國新環(huán)境下的適應性和抗寒性的變化，以及適應低溫逆變的機制，但沒有關于曼地亞紅杉在中國的大量引進、栽培和繁殖的理論依據(jù)。它不僅具有重要的理論意義，而且對曼地亞紅杉在新生態(tài)環(huán)境下的適應性具有重要的實踐意義。植物的抗性因種類和生境條件而異,通過同一植物在不同生境的抗寒性鑒定,可以測定植物對不同生境的低溫適應能力.鑒定植物的抗寒性,既需要合適的研究方法,又需要相應的量化指標.利用電導法測定相對電導率,判斷電解質外滲與低溫傷害程度的關系是最常用的方法.朱月林等用排除本身的電導后其電解質外滲率達到50%的低溫點作為植物的半致死溫度,它在相對電導率-溫度的S型曲線上表現(xiàn)為曲線的拐點所對應的溫度,它能較直觀且準確地反映植物的抗寒力和所能忍耐的低溫極限.在抗性生理學領域,通過細胞學研究證實細胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性是植物抗寒性和適應性的關鍵.當前,一般認為環(huán)境因子變化引起自由基的積累與膜傷害有密切關系.生物在進化過程中細胞形成了清除自由基和活性氧的膜保護系統(tǒng),如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POX)等抗氧化保護酶類和谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸(Vc)、維生素E(VE)等非酶類的內源抗氧化物質,它們在植物體內協(xié)同發(fā)揮作用,清除體內過多的自由基,使生物自由基保持一個較低的水平,從而防止自由基毒害,以保護膜系統(tǒng)不受到傷害.將自然降溫過程中膜保護系統(tǒng)的變化與抗寒性指標——低溫半致死溫度的變化聯(lián)系起來有助于分析和評價低溫半致死溫度這一抗寒指標的生理基礎和可靠性.筆者研究了在自然降溫過程中曼地亞紅豆杉葉片膜保護系統(tǒng)的變化與低溫半致死溫度的關系,以探討曼地亞紅豆杉的抗寒適應機理.1材料和方法1.1低溫半致死溫度測定以原產(chǎn)于北美加拿大經(jīng)人工引種盆栽于西南師范大學生科院植物園的4年生曼地亞紅豆杉(TaxusmediaDarkGreenSpreader)為材料,從2000年11月到翌年1月,每月15日和30日分別采集其功能葉片(第3-7位葉)為供試樣本,部分葉片立即測定低溫半致死溫度,其余葉片置于-40℃低溫冰箱保存,用于集中測試其它生理指標.1.2低溫半致死溫測定用上海醫(yī)用儀表廠生產(chǎn)的最高最低溫度計記錄樣地每日的最高、最低氣溫.按梁莉等的方法測定低溫半致死溫度;溫度設置為0℃到-18℃,以2℃為間隔的10個溫度梯度;每個溫度梯度的測定材料為1cm等長的節(jié)段,質量為1g.1.3抗氧化酶活性pox活性測定SOD活性測定用NBT光還原法;檢測系統(tǒng)中核黃素改為75μmol/L,NBT改為300μmol/L,反應系統(tǒng)最終體積為3mL,在25℃,4000lx光照下反應15min.POX活性測定用愈創(chuàng)木酚氧化比色法.Vc含量的測定用2,6-二氯酚靛酚法,提取液加活性炭脫色.O2.-(超氧化物陰離子自由基)含量參照王愛國等的羥胺氧化法測定.MDA(丙二醛)含量用TBA比色法測定.2結果與分析2.12年度最低溫度西南師范大學生科院植物園栽培曼地亞紅豆杉樣地2000年11月至2001年1月平均最高最低溫度如圖1,全年最低溫度出現(xiàn)在1月8-13日,日最低溫度為1.5℃.從2000年11月上旬至翌年1月上旬,旬平均最低溫度呈下降趨勢,并在1月中旬達到最低值,之后又稍有上升.2.2葉片相對電導率與處理溫度的擬合度對2000年11月至翌年1月每次測定低溫半致死溫度的結果進行非線性回歸分析,用Logistic方程擬合,分別得到6組方程(表1),R2均較高,表明方程的擬合度較好.根據(jù)所得方程可求出每次測定的葉片相對電導率(k)與處理溫度(tt)的S型曲線拐點處的對應溫度(圖2,以11月30日為例),分別為-8.48℃,-9.04℃,-9.84℃,-12.80℃,-13.05℃,-13.11℃;以低溫半致死溫度對采樣期(15d)平均最低溫度進行相關分析,可以看出兩者具有極好的線性關系(Y=-17.0975+0.7643X,r=0.9920).2.3o2含量的變化從表2可以看出,在自然降溫過程中,曼地亞紅豆杉O2.-含量隨著氣溫降低而逐漸下降.2.4sod活性的變化SOD能催化O2.-發(fā)生歧化反應,是植物細胞中最重要的消除O2.-的酶之一.由表2知,在自然降溫過程中,SOD活性逐漸增強.SOD的活性變化與O2.-的含量變化呈負相關性(Y=12.3238-0.3881X,r=-0.9929),說明在抗寒適應中SOD活性的增加清除了體內的O2.-,從而減少了O2.-的積累.2.5pox的變化POX具有分解H2O2的作用.不同時間的曼地亞紅豆杉葉片中的POX活性隨氣溫下降而漸次增強,1月中旬達到最強.說明POX在該植物低溫逆境中對代謝產(chǎn)生的H2O2清除具有重要作用.2.6溫度和vc含量Vc是非酶促保護系統(tǒng)中最重要的還原物質.生長在不同月份的曼地亞紅豆杉葉片中Vc含量隨氣溫下降而陡然增加.Vc含量變化與O2.-的含量變化呈負相關(Y=132.7907-8.1820X,r=-0.9534),說明Vc在抗寒適應中也是該植物重要的膜保護物質.2.7pox活性和vc含量的相關性表1在自然降溫過程中,曼地亞紅豆杉膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量逐漸減少.其與O2.-含量變化呈正相關(Y=3.5004+0.4924X,r=0.9445),與SOD,POX活性和Vc含量變化呈負相關(Y=14.3846-0.7108X,r=-0.9480;Y=15.3289-0.8366X,r=-0.9432;Y=186.3926-16.1111X,r=-0.9784),說明由于O2.-等活性氧自由基的清除,體內積累減少,其誘導的膜脂過氧化作用減弱,故MDA的積累減少.3討論和結論3.1曼地亞美國紅豆抗寒性的年代學檢測結果關于半致死溫度反映植物抗寒性的原理,Rajashekar等證明低于曲線拐點溫度時植物組織中液態(tài)水迅速減少,并推論這是由于組織內冰晶擴散屏障的消失,即質膜結構上的變化所致.在自然越冬過程中,曼地亞紅豆杉的低溫半致死溫度隨冬季的來臨而降低,與氣溫的變化密切相關,說明其能很好地適應引種栽培地的氣溫條件,經(jīng)受低溫而不至于受到嚴重的傷害.筆者的實驗結果可以認為低溫半致死溫度的變化準確、直觀地反映了曼地亞紅豆杉抗寒性的變化情況,其抗寒性的變化可根據(jù)低溫半致死溫度的變化情況大致分為以下3個時期:弱抗寒性時期12月中旬以前的時期.對抗寒能力本身較強的曼地亞紅豆杉而言,該階段氣溫相對較高(日最低溫度均高于5℃),低溫半致死溫度一直保持較高值(-8.48℃至-9.84℃),抗寒性相對較弱.抗寒性增強期12月中旬至月底.此期間低溫半致死溫度由-9.84℃降至-12.80℃,變幅為2.96℃.該階段氣溫降低較快,曼地亞紅豆杉的抗寒性迅速加強,經(jīng)歷的時間較短,僅為15d左右.強抗寒性時期次年1月.這一階段曼地亞紅豆杉的低溫半致死溫度維持在較低水平(13.05℃至13.11℃),抗寒性最強,此期間正是樣地最冷的嚴冬時期.3.2曼地亞紅豆對低溫半致死溫度的調控植物體內的活性氧如超氧化物陰離子自由基(O2.-)、羥自由基(OH·)、單線態(tài)氧(1O2)都能引發(fā)膜脂過氧作用.植物在長期進化過程中形成的清除活性氧的保護系統(tǒng)中,SOD是關鍵因素.不少資料認為SOD活性可作為判斷抗逆性大小的指標,其活性加強增加了其清除O2.-的能力.在自然降溫過程中POX活性也增強,其對發(fā)展抗寒性的作用可能有兩個方面的作用:一是參與分解IAA(吲哚乙酸),在越冬期間降低生長活動是發(fā)展抗寒力的前提條件;二是參與清除代謝產(chǎn)生的H2O2,防止H2O2與O2.-進一步反應形成OH·和1O2,防御膜脂過氧化作用,維持膜結構的完整性.Vc是一種低分子量的抗氧化劑,普遍存在于植物體內.研究表明,Vc能清除多種活性氧.相關分析表明,在自然降溫過程中,曼地亞紅豆杉葉片的低溫半致死溫度變化與膜保護系統(tǒng)中的SOD,POX,Vc等的變化呈負相關(r=-0.9272;-0.9774;-0.9642),與O2.-和MDA的含量變化呈正相關(r=0.9097;0.9819),說明在自然降溫過程中,曼地亞紅豆杉通過增加酶促保護系統(tǒng)中SOD,POX等酶的活性和提高非酶促的抗氧化保護物質(Vc)含量來協(xié)同發(fā)揮其保護作用,抑制低溫引起的O2.-含量增加,使O2.-含量不能達到閾值,O2.-在體內積累減少,膜脂中不飽和脂肪酸過氧化作用的發(fā)生減緩,減少MDA在曼地亞紅豆杉體內積累,從而阻礙了膜脂和膜蛋白進一步過氧化作用,維持膜結構的穩(wěn)定性.膜保護系統(tǒng)的適應性變化導致低溫半致死溫度的下降,從而提高曼地亞紅豆杉的抗寒適應能力.綜上所述,得出如下結論:曼地亞紅豆杉的抗寒適應性隨移栽地的氣溫下降而逐漸增強,并在寒冬到來前達到最強,能很好地適應移栽地的低溫條件;其低溫半致死溫度