基因工程與敲除鼠

基因工程與基因敲除

(geneticrecombination

andgeneticengineering)基因重組是指在體外用酶學(xué)方法將不同來源的DNA進(jìn)行切割、連接，組成一個(gè)新的DNA分子的過程，又稱DNA重組?；蚩寺?/p>

將重組DNA分子導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其擴(kuò)增和繁殖，以獲得大量的同一DNA分子，稱此為基因克隆、DNA克隆或分子克隆?；蚬こ棠康模孩俜蛛x獲得某一目的基因或DNA②獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程實(shí)現(xiàn)基因重組和基因克隆所采用的方法和相關(guān)工作，統(tǒng)稱為重組DNA技術(shù)或基因工程。重組DNA技術(shù)的基本流程目的基因的獲??；克隆載體的選擇和處理外源基因與載體的連接重組DNA導(dǎo)入受體菌重組體的篩選

本節(jié)主要內(nèi)容

一、重要的工具酶二、基因克隆常用的載體

三、重組DNA基本原理四、重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中的應(yīng)用

五、基因工程制備敲除鼠文獻(xiàn)解析一、重要的工具酶工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、修飾、反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)。工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶

DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶（一）限制性核酸內(nèi)切酶(RE)

是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的能專一識(shí)別雙鏈DNA中的特定堿基序列、并水解該點(diǎn)磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶，簡(jiǎn)稱限制酶或切割酶。

根據(jù)限制酶的作用特性，一般分為三類：

——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。

限制酶（Ⅱ型）識(shí)別及切割位點(diǎn)特異識(shí)別及切割48個(gè)bp長(zhǎng)度且具有回文序列的DNA片斷，主要產(chǎn)生3種缺口：5ˊ－粘性末端

3ˊ－粘性末端平端或鈍端

回文序列是指該部位的核苷酸序列呈180O旋轉(zhuǎn)對(duì)稱;

粘性末端是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的5ˊ－末端突出或3ˊ－末端突出的堿基序列相互具有互補(bǔ)性。⑴產(chǎn)生5'-粘性末端

⑵產(chǎn)生3'-粘性末端⑶產(chǎn)生平頭末端/鈍端其它特殊性質(zhì)的Ⅱ型限制酶同裂酶（異源同工酶）同尾酶可變酶同裂酶

又稱異源同工酶。指來源不同，但具有相同的識(shí)別序列。在切割DNA時(shí)，其切割點(diǎn)可以是相同的，產(chǎn)生平頭末端，稱為同識(shí)同切；切割點(diǎn)也可以是不同的，產(chǎn)生3ˊ或5ˊ粘性末端，稱為同識(shí)異切。同裂酶——同識(shí)同切同裂酶——同識(shí)異切同尾酶

同尾酶

識(shí)別DNA分子中不同核苷酸序列，作用后產(chǎn)生相同的粘性末端?？勺兠缚勺兠?/p>

識(shí)別順序中的一個(gè)或幾個(gè)堿基是可變的，并且識(shí)別順序往往超過6個(gè)堿基對(duì)。如，BstpⅠ，其識(shí)別順序?yàn)镚GTNACC。（二）DNA聚合酶（DNApolymerase)

（最常用的DNA聚合酶有以下4種）

1.DNA聚合酶Ⅰ2.DNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段

3.TaqDNA聚合酶

4.T4噬菌體DNA聚合酶1.DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeraseⅠ）

E.Coli

DNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）是一個(gè)具有3種酶活性的多功能性酶。包括：

5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性

5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性

3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性E.coliDNApol.Ⅰ催化切口平移DNApolⅠ應(yīng)用⑴催化DNA缺口平移反應(yīng)，制備高比活性DNA探針；⑵第二條cDNA鏈的合成；⑶對(duì)DNA3’突出末端進(jìn)行標(biāo)記；⑷DNA序列分析。2.Klenow片段（DNApol.大片斷）Klenow片段用途⑴補(bǔ)齊雙鏈DNA的

3ˊ末端；⑵用標(biāo)記堿基補(bǔ)齊3ˊ末端；

⑶在cDNA克隆中，用于第二股鏈的合成；⑷

DNA序列分析。3.TaqDNApol（耐熱DNA聚合酶）

作用特點(diǎn)1）TaqDNApol催化DNA合成的最適溫度范圍

70

75℃，2）95℃以上高溫，半小時(shí)不失活，3）最適合用于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。（三）逆轉(zhuǎn)錄酶⑴以單鏈RNA為模板，催化合成cDNA單鏈⑵水解RNA：DNA雜交鏈中的RNA⑶以DNA為模板，催化合成cDNA雙鏈。

特點(diǎn)一個(gè)多功能性酶，至少具有以下3種酶活性：

逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用：⑴將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)；⑵補(bǔ)平和標(biāo)記5ˊ-末端突出的DNA片段；⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析；⑷制備雜交探針等。（四）DNA連接酶(DNAligase)

DNA連接酶可以催化帶有粘性末端或平頭末端的雙鏈DNA中一條鏈的3ˊ－OH與另一條鏈的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯鍵而相連，從而構(gòu)成一條完整的DNA長(zhǎng)鏈。

DNA連接酶的用途（1）兩個(gè)雙鏈DNA片段連接起來5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊT4DNA連接酶

5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ（2）修補(bǔ)帶有缺口的雙鏈DNA分子T4DNA連接酶（五）堿性磷酸酶

堿性磷酸酶(BAP)能夠催化水解去除DNA或RNA5'-端的磷酸基團(tuán)。用途⒈制備載體時(shí)，去除載體分子5ˊ－端磷酸基后，可防止載體自身環(huán)化連接，提高重組效率。⒉用32P標(biāo)記5'-端前，去除5'-P，再通過激酶作用把放射性核苷酸加到5'-端進(jìn)行標(biāo)記。（六）末端（脫氧核苷酸）轉(zhuǎn)移酶(TdT)

作用將dNTP加到DNA的3’-OH末端；也可催化載體分子或待克隆的DNA片斷上加上互補(bǔ)的同聚尾，便于進(jìn)一步連接。應(yīng)用①探針標(biāo)記

P32-α.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32

②在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進(jìn)行連接重要的工具酶工具酶

活性限制性核酸內(nèi)切酶

識(shí)別特異序列，切割DNADNA聚合酶

以DNA為模板合成DNA逆轉(zhuǎn)錄酶

以RNA為模板合成DNAT4DNA連接酶

催化DNA5ˊ-磷酸與3ˊ-羥基形成磷酸二酯鍵堿性磷酸酶

切除末端磷酸末端轉(zhuǎn)移酶

催化3'-端合成同聚體尾二、基因克隆常用的載體載體(vector)

是將外源DNA(目的DNA)片斷引入宿主細(xì)胞的運(yùn)載工具，其化學(xué)本質(zhì)為DNA。

主要內(nèi)容載體必須具備的基本條件載體的種類常用的載體（一）載體必須具備的基本條件⒈有自身的復(fù)制子，能獨(dú)立復(fù)制⒉具備多個(gè)限制酶的識(shí)別位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn))⒊具有遺傳表型或篩選標(biāo)記⒋有足夠的容量以容納外源DNA片段。⒌表達(dá)型載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子等調(diào)控元件。（二）載體的種類1.克隆載體

用來克隆和擴(kuò)增DNA片段的載體，具有3點(diǎn)共性：⑴能夠在受體細(xì)胞復(fù)制；⑵帶有藥物抗性基因，便于篩選；⑶可導(dǎo)入受體細(xì)胞。2.表達(dá)載體除具有克隆載體所具有的性質(zhì)外，還帶有表達(dá)構(gòu)件——轉(zhuǎn)錄和翻譯所必須的DNA順序。（三）常用的載體

1.質(zhì)粒(plasmid)：

是存在于細(xì)菌染色體外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子。

作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點(diǎn)：

①

分子量相對(duì)較小，能穩(wěn)定存在于細(xì)菌體內(nèi)

②

具有1個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于篩選

③

具有多克隆位點(diǎn)

常用的質(zhì)粒：pBR322質(zhì)粒、pUC系列等

pBR322質(zhì)粒①4363bp②含一個(gè)復(fù)制點(diǎn)(ori)含一個(gè)抗氨卞青霉素標(biāo)記(ampR)④一個(gè)抗四環(huán)素標(biāo)記(tetR)⑤ampR和tetR基因內(nèi)各有一些限制酶的酶切位點(diǎn)，供外源基因插入

pUC系列質(zhì)粒

由pBR322和M13噬菌體構(gòu)建而成的雙鏈質(zhì)粒載體；（1）2674bp；（2）有ampr和與M13噬菌體相同的多克隆位點(diǎn)（MCS）（3）有一個(gè)來自大腸桿菌的LacZ操縱子的DNA片斷,編碼半乳糖苷酶2.λ噬菌體

組成特點(diǎn)：雙鏈線狀DNA分子，全長(zhǎng)50kb，含65個(gè)基因，在其分子兩端各含有12個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈，是天然的粘性末端，被稱為COS位點(diǎn)。

λ噬菌體感染細(xì)菌后的溶菌性生長(zhǎng)和溶源性生長(zhǎng)

溶菌性生長(zhǎng)噬菌體感染細(xì)菌后，2個(gè)COS位點(diǎn)互補(bǔ)成環(huán)，在宿主菌體內(nèi)連續(xù)復(fù)制，合成大量基因產(chǎn)物，進(jìn)而裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌，釋放出來的噬菌體又可感染其他細(xì)菌。

溶源性生長(zhǎng)

噬菌體感染細(xì)菌后，可將自身DNA整合到細(xì)菌的染色體中去，與之一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不被裂解。

λ噬菌體兩種生長(zhǎng)途徑（示意圖）

三、重組DNA基本原理

（DNA重組基本程序包括下列過程）

分—獲取目的基因和載體接—目的基因與載體的連接轉(zhuǎn)—重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞篩—重組DNA的篩選與鑒定(一)目的基因的獲?。ǚ郑┠康幕蚴侵杆芯炕驊?yīng)用的基因，也是需要克隆或表達(dá)的基因。

目的基因來源

1.制備基因組DNA2.制備cDNA3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

4.人工合成基因1.基因組DNA(基因文庫(kù))限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝2.制備cDNA

分離目的基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA單鏈水解去除mRNA，合成cDNA雙鏈水解回折處單鏈得到平端雙鏈cDNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆,構(gòu)建cDNA文庫(kù)3.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等條件下，體外經(jīng)94℃變性、54℃退火及72℃延伸3個(gè)步驟的反復(fù)多次循環(huán)（2530次），擴(kuò)增目的基因。

4.化學(xué)合成法較短的基因（60-80bp）用途：PCR引物測(cè)序引物定點(diǎn)突變核酸雜交探針(二)目的基因與載體的連接（接）

（主要有以下4種連接方式）

1.粘性末端連接

2.平頭末端連接

3.人工接頭法

4.同源多聚尾連接法

1.粘性末端連接

將目的基因和載體用同一種限制酶酶切，產(chǎn)生相同粘性末端，再通過DNA連接酶作用將兩者連接起來，構(gòu)成重組DNA分子。2.

平頭末端連接

在T4DNA連接酶的作用下將平頭末端的目的基因與載體DNA連接起來。3.人工接頭法合成連接子→與DNA平頭末端連接→限制酶切割，產(chǎn)生粘性末端→連接，構(gòu)建重組DNA。4同源多聚尾連接法

轉(zhuǎn)化

以質(zhì)粒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程；轉(zhuǎn)染

以病毒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程；轉(zhuǎn)導(dǎo)

以噬菌體作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。

感受態(tài)細(xì)胞

用特殊方法處理后，受體細(xì)胞才具備接受外源DNA的能力，這種細(xì)胞稱感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩大類。(三)重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞（轉(zhuǎn)）

（四）重組DNA的篩選與鑒定（篩）（篩選含重組體的陽(yáng)性菌落，一般有下列幾種方法）

1）平板篩選

2）限制酶切圖譜篩選

3）PCR篩選重組體