第六章：基因工程病毒疫苗

基因工程病毒疫苗蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部貢成良第一節(jié)疫苗概述

一、疫苗的起源與發(fā)展1、起源階段DrEdwardJener（1796）：

用一種奶牛痘感染人類，感染后不再被天花感染。LouisPasteur（19世紀(jì)末）：

研制成功狂犬疫苗。1978年世界衛(wèi)生組織宣布，人類消滅了天花。Salmon&Smith傷寒細(xì)菌滅活疫苗.Chamberlai&Roux霍亂、鼠疫滅活疫苗愛德華首先采用接種牛痘預(yù)防天花一、疫苗的起源與發(fā)展2、發(fā)展階段（1）20世紀(jì)前30年卡介苗（BCG）：結(jié)核菌減毒苗白喉/破傷風(fēng)疫苗：化學(xué)滅活疫苗流感疫苗：禽胚中研制成功（2）二次世界大戰(zhàn)后：多種減毒和滅活病毒疫苗研制成功：脊髓灰質(zhì)炎疫苗、腮腺炎疫苗、麻疹疫苗、風(fēng)疹疫苗以及腦膜炎球菌、肺炎球菌、流感桿菌疫苗一、疫苗的起源與發(fā)展3、20世紀(jì)80年代（分子技術(shù)推動(dòng)的疫苗研制）重組乙肝疫苗細(xì)菌莢膜與載體蛋白偶聯(lián)疫苗細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)減毒或滅活疫苗4、我國的情況北京、上海、蘭州、成都、長春、武漢生物制品研究所實(shí)現(xiàn)計(jì)劃免疫接種二、疫苗與基因工程疫苗1、疫苗（Vaccine)（1）傳統(tǒng)的定義：用人工變異或從自然界篩選獲得的減毒或無毒的活的病原微生物制成的制劑，或者用理化方法將病原微微生物殺死制備的生物制劑，用于人工自動(dòng)免疫，使人或動(dòng)物產(chǎn)生免疫能力。二、疫苗與基因工程疫苗2、現(xiàn)代定義：是致病原的蛋白（多肽或肽）、多糖、或核酸，以單一成份或含有有效成份復(fù)雜顆粒的形式，或通過活的減毒致病原或載體，進(jìn)入機(jī)體后能產(chǎn)生滅活、破壞或抑制病原的特異性免疫應(yīng)答。國際上一般將細(xì)菌性制劑、病毒性制劑以及類毒素統(tǒng)稱為疫苗二、疫苗與基因工程疫苗3、第一代疫苗通過改變培養(yǎng)條件，或在不同寄主動(dòng)物上傳代使病原微生物毒性減弱?；蛲ㄟ^物理化學(xué)的方法將其滅活來完成的。4、第二代疫苗（基因工程疫苗）利用DNA重組技術(shù)克隆并表達(dá)保護(hù)性抗原基因，利用表達(dá)的抗原產(chǎn)物或重組體本身制成的疫苗。（1）獲得大量高純度的抗原（2）安全第二節(jié)病毒疫苗的種類一、傳統(tǒng)病毒疫苗1、滅活疫苗（死疫苗）：誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG和IgM（1）優(yōu)點(diǎn)：工藝簡單免疫原性穩(wěn)定易于制備（2）缺點(diǎn)保證不含有滅活不完全的顆粒；提供的免疫力短、常有不良過敏反應(yīng)；不能誘生局部免疫抗體IgA,野生病毒仍可以到達(dá)侵入門戶。2.減毒疫苗(弱毒疫苗）（1）定義：微生物的自然強(qiáng)毒株通過物理、化學(xué)的和生物學(xué)的方法，連續(xù)傳代，使其對原宿主喪失致病能力，或只引起亞臨床感染，但仍能保持良好的免疫原性、遺傳特性，用這種毒株的疫苗。（2）優(yōu)點(diǎn)：可以誘發(fā)全面的免疫反應(yīng)（體液免疫、細(xì)胞免疫）免疫力持久（3）減毒方法體外減毒：異源宿主中連續(xù)傳代或單一宿主中反復(fù)連續(xù)傳代。冷適應(yīng)篩選：將病毒在低溫下連續(xù)或逐步傳代，誘導(dǎo)病毒基因組多處突變或損傷，獲得毒力減弱和各種標(biāo)志特征的冷適應(yīng)株，以此制備的疫苗。3.亞單位疫苗（1）定義：提取或合成細(xì)菌、病毒外殼的特殊蛋白結(jié)構(gòu)，即抗原決定簇制成的疫苗。（2）優(yōu)點(diǎn)：副作用小、不含核酸、安全性高4.衡量疫苗能否投入使用的標(biāo)準(zhǔn)安全性刪除致病基因，保留抗原性。有效性盡可能調(diào)動(dòng)肌體細(xì)胞免疫和體液免疫。5.免疫反應(yīng)過程抗原抗原顯示細(xì)胞吞噬抗原抗原肽MHC蛋白抗原肽復(fù)合物

T細(xì)胞活化免疫細(xì)胞識別、活化B細(xì)胞活化活化T細(xì)胞→殺傷性T細(xì)胞活化B細(xì)胞

釋放淋巴因子分泌抗體

→殺滅抗原←二、新一代病毒疫苗（遺傳重組疫苗）（一）基因工程疫苗定義：通過基因工程表達(dá)保護(hù)性抗原基因，利用表達(dá)產(chǎn)物或重組體本身制成的疫苗。種類：基因工程亞單位疫苗、載體疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗1：基因工程亞單位疫苗（1）定義：用基因工程表達(dá)的蛋白抗原純化后制作的疫苗。（2）優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)量大純度高免疫原性好安全性高（3）制備亞單位疫苗的前提：鑒別出什么成分引起宿主免疫反應(yīng)。（4）提高免疫效果的方法不同基因組合、使表達(dá)成顆粒性結(jié)構(gòu)；在體外加以聚團(tuán)化，包入脂質(zhì)體或膠囊微球；加入免疫增強(qiáng)劑（佐劑）；2.基因工程載體疫苗（1）定義：將免疫原基因與載體DNA連接的重組載體轉(zhuǎn)入受體獲得增殖培養(yǎng)物供疫苗制備，或直接將活載體接種宿主，直接在體內(nèi)表達(dá)抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。（2）優(yōu)勢：多為活載疫苗，抗原無需純化、載體本身有佐劑的作用；常用的載體有：痘病毒、腺病毒、脊灰病毒、霍亂弧菌、沙門菌、卡介苗；多價(jià)或多聯(lián)疫苗：同時(shí)表達(dá)多種抗原（3）非復(fù)制型載體重組微生物進(jìn)入機(jī)體后，只保留DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，但不產(chǎn)生感染性后代；（4）復(fù)制型載體的制作方法利用在人體中不能繁殖的動(dòng)物病毒；（例桿狀病毒）通過DNA技術(shù)對微生物進(jìn)行改造，使不能在人體中繁殖后代，但表達(dá)源基因的能力仍保留。3.基因缺失活疫苗定義：通過基因操作將病原微生物中與致病性有關(guān)的毒力基因缺失，使之成為無毒株或弱毒株，但仍保持良好的免疫原性4.DNA疫苗（第三代免疫）Wolf（1993）將流感病毒核蛋白P抗原基因直接注射到小鼠骨骼肌引起免疫反應(yīng)，產(chǎn)生多種亞型TK細(xì)胞。目前已經(jīng)進(jìn)行的研究：輪狀病毒、單純皰疹病毒、乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、狂犬病毒、結(jié)核桿菌亞單位疫苗等。（1）二個(gè)特點(diǎn)：DNA（帶有免疫原基因）、可起免疫作用（2）優(yōu)點(diǎn)：無感染性誘發(fā)產(chǎn)生天然抗原表位的抗體誘發(fā)特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)持續(xù)免疫便于構(gòu)建多價(jià)疫苗穩(wěn)定性不受溫度影響純化容易有預(yù)防和免疫治療雙重功能可快速篩選具有免疫保護(hù)效果的基因能定向誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞(TH1、TH2)為主導(dǎo)的免疫反應(yīng)5.蛋白工程疫苗定義：對抗原基因進(jìn)行改造或不同抗原基因進(jìn)行組合，以期達(dá)到增強(qiáng)其產(chǎn)物的免疫原性、擴(kuò)大反應(yīng)譜、去除有害作用或副反應(yīng)的一類疫苗（二）、遺傳重組疫苗利用遺傳重組的方法獲得的重組微生物制成的疫苗。（三）合成肽疫苗又稱表位疫苗：利用化學(xué)合成的方法合成能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)的多肽所制作的疫苗（四）抗獨(dú)特型抗體疫苗（1）獨(dú)特型：抗體分子與抗原結(jié)合的高變區(qū)的獨(dú)特結(jié)構(gòu)（2）抗獨(dú)特型抗體疫苗：使用與特定抗原免疫原性相近的抗抗體（Ab2）作抗原制成的疫苗（內(nèi)影像疫苗）（五）微膠囊疫苗（可控緩釋疫苗）（1）用微膠囊技術(shù)將特定的抗原包裹后制成的疫苗。（2）微膠囊：丙交酯和乙交酯的共聚物制成，可干燥成粉狀顆粒。第三節(jié)基因工程病毒疫苗的設(shè)計(jì)與制備一、設(shè)計(jì)策略1、理想疫苗的特點(diǎn)：有效、安全產(chǎn)生免疫快可大量生產(chǎn)貯存運(yùn)輸方便價(jià)格合理2、亞單位疫苗設(shè)計(jì)策略（1）抗原選擇能模擬誘生有效保護(hù)性抗體應(yīng)答的抗原決定簇具有優(yōu)勢免疫的抗原決定簇對人體安全特異性（2）表達(dá)載體及表達(dá)系統(tǒng)（按需要選擇）3、基因工程載體疫苗的設(shè)計(jì)策略（1）抗原選擇：同上（2）疫苗載體的選擇選擇非致病性細(xì)菌或病毒作疫苗載體。A：理想疫苗載體的條件：感染靶細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)無毒力返祖：在不斷繁殖過程中出現(xiàn)自身修復(fù)（毒力回復(fù)）無大量排毒引起的環(huán)境污染生活史中不能與宿主染色體整合操作方便接種后不會長期在體外存留B常見的疫苗載體痘苗病毒載體流感病毒載體Mengo病毒載體金絲雀痘病毒載體仙苔病毒載體皰疹病毒載體沙門菌卡介苗病毒載體細(xì)菌載體4、基因缺失活疫苗的設(shè)計(jì)關(guān)鍵：選擇要?jiǎng)h除的靶基因，一般為復(fù)制非必需、毒力相關(guān)的基因5、核酸疫苗的設(shè)計(jì)策略基因選擇：主要保護(hù)性抗原基因分子佐劑：增強(qiáng)核酸疫苗激發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)的細(xì)胞因子表達(dá)載體：表達(dá)抗原能力強(qiáng)的載體（啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、polyA信號二、基因工程疫苗制備的技術(shù)路線1、基因工程亞單位疫苗制備的技術(shù)路線抗原基因選擇與分離構(gòu)建重組載體轉(zhuǎn)化宿主（細(xì)胞）表達(dá)、純化2、基因工程載體疫苗制備技術(shù)路線抗原基因選擇與分離插入疫苗載體系統(tǒng)（細(xì)菌或病毒）重組載體體外培養(yǎng)收獲培養(yǎng)物及后處理3、基因缺失活疫苗制備技術(shù)路線選擇靶基因定向缺失靶基因基因缺失毒株的培養(yǎng)收獲病毒及后處理4、核酸疫苗制備技術(shù)路線目的抗原基因的選擇與分離構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增純化重組質(zhì)粒后處理三、