飛躍中的基因技術(shù)

湖南中醫(yī)藥大學(xué)

生物技術(shù)論文學(xué)生姓名： 劉婷學(xué)號：200904090135學(xué)院： 藥學(xué)院專業(yè)年級： 09食品科學(xué)與工程 題目：飛躍中的基因技術(shù)乳酸發(fā)酵評閱教師：曾老師2011年5月飛躍中的基因技術(shù)一乳酸發(fā)酵

摘要：乳酸菌是一種存在于人類體內(nèi)的益生菌。乳酸菌能夠?qū)⑻妓衔锇l(fā)酵成乳酸，因而得名。常添加在酸奶之內(nèi)。采用了基因工程研究方法，建立乳酸菌基因表達系統(tǒng)，從基因水平改進產(chǎn)品質(zhì)地，對天然的乳酸菌進行改良，將對人類健康密切相關(guān)的基因（如轉(zhuǎn)鐵蛋白，乳鐵蛋白，GST等基因）在乳酸菌中分泌表達，制備對人類健康具有明確醫(yī)療保健作用的乳酸菌飲料。關(guān)鍵詞：基因技術(shù)發(fā)酵劑食品級酶異源蛋白質(zhì)基因突變關(guān)鍵步驟1緒論1.1發(fā)展歷史20世紀(jì)80年代以來基因工程技術(shù)已經(jīng)開始在乳酸發(fā)酵劑領(lǐng)域進行研究了，利用基因工程技術(shù)改造傳統(tǒng)的發(fā)酵食品用微生物是當(dāng)前食品生物技術(shù)領(lǐng)域的一個新的研究熱點。近10年來，基因工程技術(shù)主要應(yīng)用于乳酸發(fā)酵工業(yè)以下幾個方面:噬菌體抗性菌株的分子育種；質(zhì)粒相關(guān)的穩(wěn)定作用；增強干酪的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)，加速干酪的成熟；細(xì)菌素和其它天然抗生素的產(chǎn)生；生物膠的產(chǎn)生；風(fēng)味缺陷的控制；益生素的產(chǎn)生；食品級酶和異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生；降低莫茲瑞拉干酪的棕色化；發(fā)展適用于低脂防乳制品的發(fā)酵劑；發(fā)展冷敏感型發(fā)酵劑。大多數(shù)發(fā)酵食品中含有未滅活的發(fā)酵微生物，并隨食品進入人體，因此利用基因重組技術(shù)改造食品用微生物時，首先應(yīng)保證具有足

夠的安全性。有了食品級基因修飾菌的明確定義，美國、荷蘭、丹麥等國的研究人員作了大量有關(guān)用基因工程技術(shù)改良乳制品發(fā)酵劑的研究，而這個領(lǐng)域的研究在國內(nèi)仍屬于空白。本文的目的就在于將當(dāng)前國際上利用基因工程修飾、改變傳統(tǒng)乳制品發(fā)酵劑的研究現(xiàn)狀進行總結(jié)，以促進國內(nèi)食品生物技術(shù)的發(fā)展。1.2現(xiàn)狀生物技術(shù)應(yīng)用于食品有著悠久的歷史，隨著生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展，對于促進食品的發(fā)展有著巨大的貢獻。近年來基因工程技術(shù)的發(fā)展為食品提供了新的發(fā)展契機。為世界所面臨的糧食短缺以及品質(zhì)要求找到了新的解決途徑。也為食品工業(yè)提供營養(yǎng)豐富的動植物原材料、性能優(yōu)良的微生物菌種以及高活而價格適宜的酶制劑，而且還可以賦予食品多種功能、優(yōu)化生產(chǎn)工藝和開發(fā)新型功能性食品。所以，基因工程正在使食品業(yè)發(fā)生著深刻的變革。而基因工程技術(shù)改造傳統(tǒng)的發(fā)酵食品用微生物是當(dāng)前食品生物技術(shù)領(lǐng)域的一個新的研究熱點，倍受大家的關(guān)注。2基因技術(shù)在乳酸菌中的應(yīng)用原理。2.1乳酸菌的基因工程育種。我們大家都知道：乳酸菌是一類能代謝產(chǎn)生乳酸，降低發(fā)酵產(chǎn)品pH值的一類微生物。乳酸菌基因表達系統(tǒng)分為組成型表達和受控表達2種類型，其中受控表達系統(tǒng)包括糖誘導(dǎo)系統(tǒng)到安全、豐富、營養(yǎng)的食品到安全、豐富、營養(yǎng)的食品誘導(dǎo)系統(tǒng)、pH誘導(dǎo)系統(tǒng)和噬菌體衍生系統(tǒng)。相對于乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌而言，德氏乳桿菌的基因研究比較缺乏，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pN42和PJBL2用于構(gòu)建德氏乳桿菌的克隆載體。乳酸菌基因突變有2種方法：第一種方法涉及（同源或異源的）可獨立復(fù)制的轉(zhuǎn)座子，第二種方法是依賴于克隆的基因組DNA片斷和染色體上的同源部位的重組整合而獲得的。完整的基因組序列的破譯并沒有改變這些基本方法，然而這已經(jīng)極大地提高了選擇用于研究基因位點的速度，而且現(xiàn)有的基因組序列大大提高了隨機整合體的定位能力和預(yù)測遺傳前景的能力。食品級基因修飾菌是指被導(dǎo)入源于同種或公認(rèn)的安全的食品級微生物的基因，并因此而具有某種優(yōu)良性狀的用于發(fā)酵食品生產(chǎn)的微生物。其基因修飾過程應(yīng)滿足下列要求：1、功能性基因必須源于同種菌或公認(rèn)的安全的食品級微生物；2、載體必須是食品級的，不得含有非食品級的功能性DNA片段；3、選擇性標(biāo)記不得選用各種抗生素抗性標(biāo)記，防止抗生素抗性基因隨菌體進入人體。應(yīng)選用食品級的標(biāo)記基因，如糖類利用標(biāo)記、營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記等；4、宿主菌的遺傳特性清楚且穩(wěn)定，具有足夠的安全性，應(yīng)選用適當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)方法如DNA序列分析、雜交等確定宿主菌的遺傳組成。3影響乳酸菌發(fā)酵劑性能的因素乳制品發(fā)酵劑依產(chǎn)品主要可分為奶酪發(fā)酵劑、酸奶發(fā)酵劑、奶油發(fā)酵劑三大類。無論是哪種發(fā)酵劑，人們最關(guān)注的性能有以下幾個方面:產(chǎn)生雙乙酰的能力；蛋白水解能力；產(chǎn)生胞外多糖的能力；抗病原菌、雜菌污染能力；抗噬菌體侵染能力。下文將從這幾個方面闡述用基因技術(shù)改良乳制品發(fā)酵劑的思路及研究成果。3.1產(chǎn)雙乙酰能力乳制品發(fā)酵風(fēng)味（如黃油，酸奶等）的核心成分是雙乙酰。對大多數(shù)乳酸菌而言，乳糖分解成為葡萄糖和半乳糖，其經(jīng)過糖酵解途徑轉(zhuǎn)化成丙酮酸，再在乳酸脫氫酶的催化作用下還原，轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗帷Ｉ倭康谋嵩赼-乙酰乳酸合成酶的作用下形成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物a-乙酰乳酸，極易受a-乙酰乳酸脫羧酶作用形成3-羥基-2-丁酮，并最終被緩慢氧化成2,3-丁二醇。一些乳酸菌突變菌株具有很強的雙乙酰產(chǎn)生能力，研究證實這些菌株體內(nèi)沒有a-乙酰乳酸脫羧酶。據(jù)此可以認(rèn)為，在沒有a-乙酰乳酸脫羧酶存在時，a-乙酰乳酸會積累，在有氧氣存在時經(jīng)化學(xué)氧化過程轉(zhuǎn)變成為雙乙酰。這也是雙乙酰產(chǎn)生的機理。根據(jù)此原理，假若使菌株喪失合成a-乙酰乳酸脫羧酶的能力，a-乙酰乳酸會積累，菌株產(chǎn)生雙乙酰的能力就會提高。目前工業(yè)上廣泛應(yīng)用的產(chǎn)雙乙酰能力強的菌株就是a-乙酰乳酸脫羧酶缺陷型菌株，但是它對噬菌體較敏感，一旦噬菌體浸染發(fā)生，沒有菌株可以替換它。這才促使人們利用基因工程技術(shù)去獲得ALD缺陷型菌株。1996年Coupil報道了用基因工程技術(shù)篩選ALD缺陷型菌株的方法[7]。該方法的理論基礎(chǔ)是a-乙酰乳酸是3-羥基-2-丁酮的前體，也是亮氨酸纈氨酸合成的前體物質(zhì)；當(dāng)培養(yǎng)基中存在亮氨酸時，會產(chǎn)生抑制效應(yīng)，即ALD被激活使a-乙酰乳酸發(fā)生脫羧反應(yīng)，生成3-羥基-2-丁酮；反之，不存在亮氨酸時，ALD沒有活性，a-乙酰乳酸不能發(fā)生脫羧反應(yīng)而轉(zhuǎn)向亮氨酸纈氨酸的生物合成。因此當(dāng)培養(yǎng)基中有亮氨酸而無纈氨酸時，菌體細(xì)胞會因纈氨酸缺乏而無法生長。但是ALD缺陷型菌株在有亮氨酸而無纈氨酸基質(zhì)中培養(yǎng)時，a-乙酰乳酸不會轉(zhuǎn)變成3-羥基-2-丁酮，菌體將正常進行亮氨酸纈氨酸的生物合成，進行各種生命活動。應(yīng)用此原理篩選ALD缺陷型菌株需有一前提，即菌株要有合成纈氨酸的能力。但是，自然存在的乳酸菌菌株絕大多數(shù)已經(jīng)喪失了這種能力。為此，Curic將攜帶有纈氨酸合成酶基因的質(zhì)粒載體PMC004電穿孔法轉(zhuǎn)化到宿主雙乙酰乳酸乳球菌中，使其獲得合成纈氨酸的能力。Curic的篩選過程為：出發(fā)菌株DB0410+質(zhì)粒PMC004-轉(zhuǎn)化一含亮氨酸的化學(xué)合成培養(yǎng)基篩選一能夠合成纈氨酸的陽性轉(zhuǎn)化子(DB0410/PMC004,Val+)一ALD缺陷型篩選一DB0410/PMC004,ValALD-一去除質(zhì)粒PMC004-MC010。最后獲得的菌株MC010不含有任何外源DNA，Southern雜交和DNA印記反應(yīng)證明其基因圖譜同野生的L.lactisdiacetylactisDB0410是一樣的，因此具有足夠的安全性，是一食品級基因修飾菌。用該菌進行強化檸檬酸的M17培養(yǎng)基發(fā)酵實驗，產(chǎn)酸速度和產(chǎn)酸總量和對照組沒有明顯差異，而a-乙酰乳酸的產(chǎn)量MC010試制發(fā)酵奶油，產(chǎn)品在儲藏1d后，雙乙酰的濃度高達0.22mol/L,而對照組僅為0.01mol/L，儲藏1周后，雙乙酰的濃度降為0.04mol/L，對照組仍為0.01mol/L。3.2蛋白水解能力蛋白水解能力是衡量干酪發(fā)酵劑的重要指標(biāo)。發(fā)酵劑在干酪的成熟過程中，水解乳蛋白，產(chǎn)生小分子肽和氨基酸，是成熟干酪的重要風(fēng)味成分。乳酸菌的蛋白水解系統(tǒng)包括結(jié)合在細(xì)胞壁上的蛋白酶PrtP，其功能是將細(xì)胞外的蛋白質(zhì)水解成寡聚多肽；細(xì)胞膜上的寡聚肽轉(zhuǎn)運子OPP，其功能是將寡聚多肽由細(xì)胞外轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)，該步驟是乳酸乳球菌在牛乳中生長的關(guān)鍵步驟，OPP缺陷型的突變株不能在以酪蛋白為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長。細(xì)胞內(nèi)蛋白酶，如氨基肽酶pepN，二肽酶pepV，內(nèi)肽酶pepO，胱氨酸肽酶pepC等，將寡聚多肽最終水解為氨基酸。依據(jù)上述理論，國外科學(xué)工作者作了一些改良發(fā)酵劑蛋白水解能力的嘗試。HENRIKSEN等人將pepN，pepV，pepC，pepO蛋白酶基因分別克隆到pFG1質(zhì)粒中，并分別在L.LactisMG1363中表達，制作成單一菌株的發(fā)酵劑，進行50g奶酪的生產(chǎn)實驗。結(jié)果表明，經(jīng)4?6個月的成熟期后，轉(zhuǎn)pepN和pepC基因的發(fā)酵劑作成的奶酪；同對照組相比，苦味明顯降低，嗜好性味增加；而轉(zhuǎn)pepO和pepV基因的發(fā)酵劑同對照組沒有明顯差異。由于乳酸菌的多數(shù)蛋白酶屬于胞內(nèi)酶，因而有人認(rèn)為在奶酪發(fā)酵成熟的過程中，菌體可能會發(fā)生裂解，釋放胞內(nèi)酶，進而水解介質(zhì)中的蛋白質(zhì)。將噬菌體溶菌酶基因①VML3克隆到PFG1質(zhì)粒中，并在MG1363中表達，制作成相應(yīng)的發(fā)酵劑和奶酪，結(jié)果乳酸菌在奶酪成熟后期的自溶能力顯著增強，苦味顯著降低，嗜好性味顯著增強。3.3胞外多糖的形成在酸奶及其他一些發(fā)酵乳制品發(fā)酵過程中，乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖可使產(chǎn)品增稠、穩(wěn)定，質(zhì)地細(xì)膩均勻，口感潤滑。乳酸菌分泌胞外多糖的能力很不穩(wěn)定，即便是在最佳的培養(yǎng)條件下，多次的移接操作或培養(yǎng)時間延長都可能造成菌株分泌胞外多糖能力的喪失。乳酸菌遺傳學(xué)表明，乳脂乳球菌和乳酸乳球菌合成胞外多糖的關(guān)鍵基因在質(zhì)粒上，乳酸菌容易喪失分泌胞外多糖的能力是由于質(zhì)粒的不穩(wěn)定性造成的。目前遺傳特性研究的最為清楚的是源于L.LactisN120b40的質(zhì)粒pNZ4000，它是一含有多個功能性基因的復(fù)合質(zhì)粒（40kb），其中與胞外多糖合成有關(guān)的14個基因構(gòu)成一個12kb的操縱子。由于胞外多糖對產(chǎn)品黏度與質(zhì)地的影響是與其分子大小密切相關(guān)的，因此從基因水平改進產(chǎn)品質(zhì)地的另一個思路是提高胞外多糖的分子量。通過控制胞外多糖分子延長基因的表達水平可以實現(xiàn)控制胞外多糖分子大小的目的。研究表明，在胞外多糖的絕對產(chǎn)量不增加的情況下，僅將胞外多糖的分子量提高一倍，就可以使產(chǎn)品的黏度與質(zhì)地發(fā)生顯著變化。3.4抗雜菌、病原菌污染特性許多乳酸菌在發(fā)酵過程中除產(chǎn)生乳酸、乙酸和雙乙酰外，還可產(chǎn)生一些具有抑菌和殺菌作用的細(xì)菌素，在食品的防腐保鮮中起重要作用。如目前研究得最徹底、應(yīng)用最廣的有乳酸乳球菌產(chǎn)生的乳鏈球菌素（Nisin）、乳酸片球菌產(chǎn)生pediocinPA-1、乳酸乳桿菌產(chǎn)生的lactacinF。這些細(xì)菌素都是經(jīng)核糖體合成機制產(chǎn)生的多肽類物質(zhì)（在這一點上同普通抗生素有本質(zhì)的區(qū)別），產(chǎn)生菌對其細(xì)菌素有自身免疫性。分子遺傳學(xué)研究表明，乳酸乳球菌的Nisin結(jié)構(gòu)基因位于染色體的可結(jié)合轉(zhuǎn)座子（70kb）上，其中在10kb的片段上分布著NisA.B.T.Z.P.K基因，構(gòu)成一個8.5kb的多順反操縱子，5'端有一核糖體結(jié)合位點，3'端有一個終止密碼子和依賴P因子的轉(zhuǎn)錄終止子。Nisin的前體肽有57個氨基酸組成，其中N端23個殘基為信號肽，它在細(xì)胞表面會被信號肽酶水解去除，最終釋放出成熟的有活性的Nisin?；谏鲜龅难芯砍晒?，國外研究者嘗試用基因工程技術(shù)增強奶酪發(fā)酵劑產(chǎn)生Nisin的能力，但結(jié)果卻不盡人意。產(chǎn)生Nisin的能力提高的同時，乳糖代謝的速度下降，發(fā)酵劑的蛋白質(zhì)水解能力及耐熱性也都下降。分析原因，認(rèn)為奶酪的發(fā)酵劑是混合型的，含有多種乳酸菌，產(chǎn)Nisin的菌株對不產(chǎn)Nisin的菌株的生命活動有拮抗作用。Nisin嘗試將片球菌素pdiococin基因克隆并在乳酸球菌中表達的試驗。Pdiococin-PA-1由乳酸片球菌Pediococcusacidlactici產(chǎn)生，該菌乳糖發(fā)酵能力弱，它主要是作為生物防腐劑控制食品中的雜菌和病源菌。Pdiococin-PA-1的相關(guān)基因在質(zhì)粒上，是一個含4個基因的操縱子。將該操縱子克隆并構(gòu)建成食品級表達載體pMC117質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌MM214中，得工程菌MM217。以此菌制作成發(fā)酵劑，并進行奶酪得生產(chǎn)試驗。結(jié)果表明，試驗組奶酪在發(fā)酵1d時含64000Pediocin，6個月后降到2000，而對照組沒有檢測到Pediocin活性。試驗組奶酪的Lister菌數(shù)比對照組低1000倍以上。說明該菌產(chǎn)Pediocin能力高，且能有效殺死、抑制Lister菌。同時該發(fā)酵劑的糖代謝速度、產(chǎn)酸速度、產(chǎn)品的PH值、水分含量等發(fā)酵指標(biāo)和產(chǎn)品指標(biāo)同對照組相比都沒有明顯差異。提高發(fā)酵劑抗雜菌污染能力的另一個思路就是將噬菌體編碼的細(xì)菌細(xì)胞壁裂解酶基因?qū)氚l(fā)酵劑乳酸菌，提高其抗菌能力。將Listeria菌的噬菌體胞壁裂解酶（可專一性水解Lister菌細(xì)胞壁肽聚糖的肽鍵）的操縱子克隆到PTRKH2質(zhì)粒上，構(gòu)建成表達載體，導(dǎo)入乳酸乳球菌可實現(xiàn)胞壁裂解酶的成功分泌，使培養(yǎng)基中的Lister菌迅速裂解。4實際應(yīng)用其中，復(fù)旦大學(xué)采用了基因工程研究方法，建立乳酸菌基因表達系統(tǒng)，對天然的乳酸菌進行改良，將對人類健康密切相關(guān)的基因（如轉(zhuǎn)鐵蛋白，乳鐵蛋白，GST等基因）在乳酸菌中分泌表達，制備對人類健康具有明確醫(yī)療保健作用的乳酸菌飲料。［預(yù)期成果和市場前景分析］:建立乳酸菌基因轉(zhuǎn)移表達系統(tǒng)；制備具有特定明確醫(yī)療和保健功能的基因工程乳酸菌。被譽為第三代乳酸菌的基因工程乳酸菌具有特定的明確的醫(yī)療保健功能，市場前景廣闊。例如轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白則能夠明確促進食物中鐵的