大劑量糖皮質(zhì)激素對下丘腦室旁核神經(jīng)元crh蛋白表達及crhmrna轉(zhuǎn)錄的影響

大劑量糖皮質(zhì)激素對下丘腦室旁核神經(jīng)元crh蛋白表達及crhmrna轉(zhuǎn)錄的影響

促進腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（crh）是緩解過程中最重要的初始因素之一。傳統(tǒng)理論認為,糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)對CRH的合成分泌具有非常強烈的抑制作用。然而,Deuster等證實,大劑量GC似乎并未完全抑制CRH的增加,但尚無相關(guān)文獻明確提示大劑量GC對CRH表達的影響。筆者擬通過免疫組織化學方法,首先探討大劑量GC對下丘腦室旁核(hypothalamusparaventricularnuleus,PVN)神經(jīng)元CRH蛋白表達的影響,而后采用原位雜交技術(shù)觀察大劑量GC對CRHmRNA轉(zhuǎn)錄的作用,并以此分析大劑量GC的作用與GC受體(glucocorticoidreceptor,GR)之間的關(guān)系。1材料和方法1.1實驗動物和試劑水溶性地塞米松、CRH兔抗大鼠單克隆抗體、RU486均購自美國Sigma公司,FITC羊抗兔IgG購自北京中杉公司,大鼠CRHmRNA原位雜交試劑盒購自武漢博士德公司,速眠新購自長春實驗動物研究所。1.2大鼠養(yǎng)殖pvn神經(jīng)元crh蛋白表達水平健康雄性Wistar大白鼠,60只,體重(230±10)g,由第三軍醫(yī)大學附屬大坪醫(yī)院實驗動物中心提供。隨機分為5組:空白對照組,等滲鹽水陰性對照組、10-9mol/L地塞米松(dexamethasone,DEX)組,10-6mol/LDEX組,預(yù)先予以10-4mol/LRU486,再予以10-6mol/LDEX組。大鼠用1.0ml/kg速眠新肌肉注射麻醉后,暴露股靜脈,給予相應(yīng)處理(表1),15,30,60和90min后處死;正常空白對照組在相應(yīng)時相點活殺觀察PVN神經(jīng)元CRH蛋白的表達情況。檢測CRHmRNA的時相點取決于CRH蛋白表達結(jié)果,選擇相應(yīng)時相點的前后作為觀察點。1.3crh單克隆抗體t常規(guī)冰凍切片,于視交叉后收取切片,厚10～20μm。HE染色判斷所選切片是否包含PVN。免疫組織化學方法檢測PVN神經(jīng)元CRH表達情況,主要步驟如下:體積分數(shù)為0.1%Triton-100,30min;抗原修復液,30min;正常山羊血清封閉液,30min,不洗;1∶100兔抗大鼠CRH單克隆抗體,陰性對照用0.01mol/LPBS,4℃過夜;37℃復溫1h;1∶100滴加FITC羊抗兔IgG/0.01mol/L磷酸鹽緩沖劑(PBS),37℃孵育至顯色。其間以0.01mol/LPBS洗3次×5min。將切片置于熒光顯微鏡(德國Leica公司)下觀察顯色結(jié)果,再利用激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)掃描成像(包括激光掃描,透射光掃描)。陽性判斷標準為綠色熒光顆粒的出現(xiàn)。1.4小鼠血清pvn1、ws1的檢測所有相關(guān)玻璃器皿200℃烘烤8h,所有試劑均用體積分數(shù)為0.1%DEPC水配制。冰凍切片同1.3。模版序列:726TTATCGGGAAATGAAATGTTGCGCTTGGC,合成探針序列:5’GCCAAGCGCAACATTTCATTTCCCGATAA。主要步驟如下:將染色確定具有PVN核團的切片各取2張,1張用于陰性對照;1∶100甲醇過氧化氫液30min;滴加30g/L檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶以暴露mRNA片段;10g/L多聚甲醛/0.1mol/LPBS,10min;預(yù)雜交:按每張切片加20μl預(yù)雜交液,置于預(yù)先加入體積分數(shù)20%甘油的預(yù)雜交濕盒中,38℃3h;雜交:每張切片加20μl雜交液,38℃過夜;陰性對照加入0.01mol/LPBS;37℃2×SSC,5min×2次;37℃0.5×SSC,15min×1次;37℃0.2×SSC,15min×1次;滴加封閉液,37℃30min,甩去多余液體,不洗;滴加生物素化鼠抗地高辛,37℃60min;滴加SABC,37℃20min;滴加生物素過氧化物酶,37℃20min;DAB顯色;中性樹脂封片、觀察、圖像采集;陽性判斷標準:細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒物質(zhì)。2結(jié)果2.1pvn核團的評估HE染色后,可見第三腦室頂端側(cè)壁旁分布楔形神經(jīng)元核團,為PVN所在。見圖1。2.2crh陽性綠色熒光顆粒10-6mol/LDEX(血濃度)作用后30min,第三腦室頂端兩側(cè)三角形PVN出現(xiàn)CRH陽性綠色熒光顆粒;進一步放大后可見細胞為圓形或橢圓形(圖2);其余時相點均無陽性結(jié)果。10-9mol/LDEX與等滲鹽水作用15,30,60和90min后未見PVN神經(jīng)元出現(xiàn)CRH陽性熒光顆粒,空白對照組各時相點未見陽性結(jié)果。2.3pvn細胞群根據(jù)結(jié)果2.2,選擇15,20,30和40min為觀察點,10-6mol/LDEX作用約20min,PVN神經(jīng)元胞漿內(nèi)出現(xiàn)CRHmRNA陽性棕黃色顆粒,但未存在于視野下所有細胞胞漿內(nèi);復染后可見第三腦室壁旁的PVN細胞群(圖3);其余時相點內(nèi)未見陽性結(jié)果。10-9mol/LDEX、9g/L等滲鹽水以及空白對照組在各時相點均未出現(xiàn)陽性結(jié)果。預(yù)先從股靜脈予以10-4mol/L(終濃度)的RU486約60min后,再給予10-6mol/LDEX,20min后,PVN未出現(xiàn)CRHmRNA陽性結(jié)果;30min后,PVN未出現(xiàn)CRH蛋白陽性綠色熒光顆粒。3gc對pvn神經(jīng)元crh表達的影響CRH是含有41個氨基酸的無半胱氨酸的小分子肽類激素,相對分子質(zhì)量為4871。CRH的合成部位主要位于PVN部位的小細胞群中,兩側(cè)僅共有約2000個CRH神經(jīng)元。雖然外周某些組織器官(胃腸、胰腺、腎上腺、胎盤、皮膚等部位)也可表達CRH,但其濃度大大低于PVN水平。因此,本實驗中采用免疫組織化學技術(shù)和原位雜交方法檢測CRH的表達情況。CRH作為下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸系統(tǒng)中最上級的激素,啟動了HPA軸對應(yīng)激原的應(yīng)答;此外,CRH還參與了交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)的活化。此兩系統(tǒng)為應(yīng)激狀態(tài)下機體產(chǎn)生的重要病理生理過程。因此,一般認為CRH是應(yīng)激過程中重要的始動因子之一,CRH分泌增加可作為反映機體應(yīng)激狀態(tài)的客觀指標。GC通常被認為是CRH基因轉(zhuǎn)錄最重要的負調(diào)控因素,因為CRH啟動子區(qū)域-278～-249bp為GC負反應(yīng)元件(negativeglucocorticoidresponsiveelement,nGRE),GC與經(jīng)典的細胞內(nèi)受體(intracellularglucocorticoidreceptor,iGR)結(jié)合后對其具有較高的結(jié)合能力,起到抑制CRH基因表達的作用。此外,GC·iGR復合物還能干擾CRE與其結(jié)合蛋白(cAMPrespondingelementbindingprotein,CREB)的結(jié)合,能通過GRDNA結(jié)合域中的鋅指狀結(jié)構(gòu)與Fos形成蛋白-蛋白(protein-to-protein)結(jié)合,降低活化蛋白(AP)-1與DNA的結(jié)合總量,從而間接使得CRH基因表達下降。但文獻資料與臨床病例均提示,在大劑量GC存在的條件下,CRH仍可維持較高水平。目前,但國內(nèi)外尚無具體調(diào)節(jié)方式的相關(guān)報道。本實驗結(jié)果表明,大劑量GC具有上調(diào)PVN神經(jīng)元CRH表達的作用,該作用明顯不同于經(jīng)典的GC作用。同時,實驗結(jié)果也提示,大劑量GC對CRH的上調(diào)作用可能與新近認識到的GC膜受體(membraneglucocorticoidreceptor,mGR)密切相關(guān),因為:(1)越來越多的證據(jù)顯示,神經(jīng)元細胞膜上存有mGR。(2)RU486為GR特異性拮抗劑,能結(jié)合iGR和mGR,且親和力分別高于所有GC,筆者利用10-4mol/LRU486拮抗GR后,大劑量GC的作用被逆轉(zhuǎn),提示大劑量GC的作用是由GR介導的。(3)根據(jù)受體-配體結(jié)合特性,飽和iGR需10-9mol/LGC,飽和mGR卻需10-6mol/LGC。因此大劑量的GC與飽和mGR所需的量具有很好的一致性,但大于飽和iGR所需的量近1000倍。由于10-9mol/LDEX并不能導致PVN神經(jīng)元表達CRHmRNA及其蛋白,而大劑量GC卻具有非常明顯的上調(diào)作用,表明大劑量GC的作用可能與傳統(tǒng)的iGR無關(guān)。(4)大劑量GC起效時間僅為幾十分鐘,與GC非基因組機制所需時間相吻合,但低于傳統(tǒng)的GC基因組機制發(fā)揮效應(yīng)所需的幾小時,甚至幾十小時。目前普遍認為,GC非基因組機制主要依賴于mGR,而后者主要與iGR相關(guān)。