帕羅西汀對(duì)心理應(yīng)激大鼠下丘腦cfos表達(dá)的影響

帕羅西汀對(duì)心理應(yīng)激大鼠下丘腦cfos表達(dá)的影響

心理休克是許多精神疾病（如焦慮和抑郁）的重要原因。調(diào)查資料顯示:焦慮或抑郁癥的發(fā)生通常是反復(fù)心理應(yīng)激的結(jié)果。帕羅西汀(paroxetine,商品名賽樂(lè)特,Seroxat)是治療廣泛焦慮癥的選擇性5-HT再攝取抑制劑(SSRI),雖然臨床上帕羅西汀廣泛用于各種應(yīng)激相關(guān)障礙的治療,但是它的作用機(jī)制的研究還只停留在神經(jīng)遞質(zhì)與受體的水平,基因水平的藥理機(jī)制尚不是十分清楚。本文采用免疫組織化學(xué)方法觀察帕羅西汀對(duì)心理應(yīng)激誘導(dǎo)的c-fos蛋白在大鼠下丘腦視旁核表達(dá)的影響,旨在探討帕羅西汀減輕心理應(yīng)激所致焦慮癥狀的中樞藥理作用機(jī)制,為其合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1試劑及其配制c-fos檢測(cè)免疫組化試劑盒:購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司;皮質(zhì)醇放射免疫試劑盒:購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司。鹽酸帕羅西汀:白色粉末狀可溶于水,批號(hào):9901136,由上海葛蘭素史克公司提供,溶于蒸餾水配制成所需濃度,ip體積為1ml·kg-1。大鼠行為測(cè)定儀:自制。1.2動(dòng)物合格號(hào)SD清潔級(jí)大鼠,雌性,7～8周齡,180～200g,由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào):浙醫(yī)字第22003002),將大鼠置于室溫21～23℃、相對(duì)濕度45%、12h晝夜周期的動(dòng)物室內(nèi)?；\養(yǎng),每籠4只,自由進(jìn)食、飲水。32只大鼠隨機(jī)分為4組,每組8只:正常對(duì)照組,束縛應(yīng)激組,單次給藥束縛應(yīng)激組,連續(xù)6d給藥束縛應(yīng)激組。1.3大鼠在限制期間表型實(shí)驗(yàn)前,動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室條件下適應(yīng)至少1周。每天上午8ue5fe00將造模大鼠置于特制的限制器內(nèi),每日1次,每次2h,造模大鼠在限制期間禁食,禁水,連續(xù)6d后處死。正常對(duì)照組在同一時(shí)間也禁食,禁水。每天上午8ue5fe00～9ue5fe00,正常對(duì)照組和束縛應(yīng)激組大鼠腹腔注射等量的蒸餾水,連續(xù)6d,單次給藥束縛應(yīng)激組大鼠連續(xù)腹腔注射等量的蒸餾水5d后,d6腹腔注射鹽酸帕羅西汀1ml·kg-1,連續(xù)6d給藥束縛組大鼠腹腔注射鹽酸帕羅西汀1ml·kg-1,連續(xù)6d。1.4放射免疫法測(cè)定血漿皮質(zhì)醇腹主動(dòng)脈取血,抗凝離心制備血漿,-20℃凍存,操作按照放射免疫試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行。1.5腦膠質(zhì)片內(nèi)固定術(shù)在10%水合氯醛(3ml·kg-1)麻醉下,經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈插管,先快灌流0.9%氯化鈉溶液100～150ml,再慢灌注含4℃的4%多聚甲醛(0.1mol·L-1)磷酸緩沖液100ml。立即取腦固定于4%多聚甲醛中24h,再移至20%蔗糖磷酸緩沖液中過(guò)夜(4℃)至腦組織塊沉底,次日連續(xù)冠狀冰凍切片,切片厚30μm。取含下丘腦最大斷面的切片(參照?qǐng)D譜theFourthEditionoftheRatBraininStereotaxicCoordinates),收集于0.01mol·L-1的PBS緩沖液中。1.6抗兔igg抗體-hrp的顯色觀察采用SP二步法:用多聚賴氨酸處理過(guò)的玻片撈片,置60℃烤箱烤30min,以使切片緊密粘附,依次以下步驟操作:3%過(guò)氧化氫孵育5min,以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶;滴加兔來(lái)源的c-fos1ue5fe100,30～50μl,室溫孵育90min;滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體,50μl,室溫孵育20min;應(yīng)用DAB溶液顯色(雙蒸水1ml,A:50μl,B:50μl,避光保存,30min用完),在顯微鏡下觀察;蒸餾水沖洗;蘇木素復(fù)染;蒸餾水沖洗;脫水:70%酒精1次,75%酒精1次,95%酒精2次,無(wú)水酒精2次,2-甲苯2次,各3min;中性樹(shù)膠封片。上述每步驟間均采用PBS充分洗滌。對(duì)照實(shí)驗(yàn):取部分切片用0.01mol·L-1PBS液代替兔來(lái)源的一抗進(jìn)行孵育,其余步驟相同。1.7免疫陽(yáng)性神經(jīng)元記數(shù)用HPLAS1000高分辨彩色病理圖文分析系統(tǒng)行Fos樣免疫陽(yáng)性神經(jīng)元記數(shù)。所有切片均在同一光強(qiáng)度和同一放大倍數(shù)(×400)下分析。觀察每只鼠含有室旁核神經(jīng)元的所有切片,以最高密度切片為代表,測(cè)定每個(gè)視野內(nèi)fos樣免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。1.8c-fos陽(yáng)性細(xì)胞密度的檢測(cè)應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件完成,用c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占該切片觀察細(xì)胞總數(shù)的百分率表示c-fos陽(yáng)性細(xì)胞密度,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,進(jìn)行方差分析,P<0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1單次給藥對(duì)束縛應(yīng)激大鼠血漿皮質(zhì)醇含量的影響各應(yīng)激組大鼠血漿皮質(zhì)醇含量明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05),帕羅西汀單次、連續(xù)6d給藥可減少束縛應(yīng)激大鼠血漿皮質(zhì)醇含量,和束縛應(yīng)激組比較有明顯下降(P<0.05)。帕羅西汀連續(xù)6d給藥比單次給藥對(duì)束縛應(yīng)激大鼠血漿皮質(zhì)醇下降作用更明顯(P<0.05,表1)。2.2pahs對(duì)大鼠腦室旁核c-fos表達(dá)的影響光鏡下觀察,DAB顯色的免疫反應(yīng)終產(chǎn)物fos呈棕黃色顆粒狀,位于神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)。正常對(duì)照組大鼠下丘腦內(nèi)無(wú)c-fos表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞,其余各組下丘腦內(nèi)均有不同程度c-fos的表達(dá)(圖1),以室旁核最為密集,說(shuō)明應(yīng)激可以誘導(dǎo)下丘腦室旁核c-fos的表達(dá)。帕羅西汀單次、連續(xù)6d給藥可減少束縛應(yīng)激大鼠下丘腦室旁核c-fos表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞神經(jīng)元的數(shù)目,和束縛應(yīng)激組比較明顯下降(P<0.05),說(shuō)明帕羅西汀對(duì)束縛應(yīng)激引起的下丘腦c-fos表達(dá)有下調(diào)作用。帕羅西汀連續(xù)6d給藥比單次給藥對(duì)束縛應(yīng)激大鼠下丘腦c-fos表達(dá)下調(diào)作用更明顯(P<0.05,表1)。3心理應(yīng)激大鼠hpa軸功能的變化心理應(yīng)激發(fā)生時(shí),首先作用于大腦改變腦的內(nèi)分泌機(jī)能,其中最重要的途徑是下丘腦垂體腎上腺軸(HPA軸)被激活。下丘腦為間腦前臂,可以接受末端信息,又能調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌功能,室旁核(PVN)是下丘腦重要的核團(tuán)之一,有纖維投射到垂體后葉控制促皮質(zhì)激素(CRH)釋放激素等神經(jīng)肽分泌,進(jìn)而控制皮質(zhì)激素釋放激素(ACTH)的分泌,不僅啟動(dòng)HPA軸,而且影響與應(yīng)激有關(guān)的行為、神經(jīng)內(nèi)分泌免疫活動(dòng),并與藍(lán)斑去甲腎上腺素以及其他神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制構(gòu)成應(yīng)激系統(tǒng)。糖皮質(zhì)激素是HPA軸的終末產(chǎn)物,因此常作為研究應(yīng)激的最經(jīng)典、最重要的指標(biāo)之一。本研究結(jié)果表明,心理應(yīng)激大鼠HPA軸功能亢進(jìn),而帕羅西汀可降低其血漿皮質(zhì)醇含量,從而抑制心理應(yīng)激大鼠HPA軸的興奮性。大多數(shù)細(xì)胞中均含有c-fos基因,正常情況下可微弱表達(dá),基礎(chǔ)值很低,神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)c-fos基因被各種生理、心理和病理等外源性或內(nèi)源性的刺激所誘導(dǎo),發(fā)生迅速、短暫高水平的表達(dá),這樣就將外界信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榛虮磉_(dá),引起長(zhǎng)時(shí)程的反應(yīng),因其具有信號(hào)傳遞特征,即表達(dá)后的蛋白因子核內(nèi)磷酸化蛋白(fos)生物活性有類似的第二信使的作用,所以又被稱為第三信使。許多研究表明,存在空泡性損害的神經(jīng)元中檢測(cè)到c-fos蛋白的合成,c-fos蛋白表達(dá)的區(qū)域表明該部位存在不同程度的神經(jīng)元損害。c-fos可作為神經(jīng)損害、情感和行為改變的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)心理應(yīng)激大鼠下丘腦室旁核c-fos表達(dá)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多,說(shuō)明此部位是神經(jīng)損害的相關(guān)區(qū)域,很可能與心理應(yīng)激引起的焦慮癥狀相關(guān)。本研究在單次和連續(xù)給藥過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)帕羅西汀能減少心理應(yīng)激大鼠下丘腦室旁核c-fos表達(dá),神經(jīng)元損害亦明顯減輕,而且連續(xù)給藥對(duì)c-f