納米羥基磷灰石細(xì)菌纖維素復(fù)合材料的細(xì)胞相容性

納米羥基磷灰石細(xì)菌纖維素復(fù)合材料的細(xì)胞相容性

0生物材料的特性納米羥基磷灰石（nhap）是天然骨骼中礦化基質(zhì)的主要成分，具有良好的生物性能，但具有低強(qiáng)度、低耐候性，限制了特定部位骨缺損修復(fù)的應(yīng)用。細(xì)菌纖維（bc）是一種天然生物材料。它具有良好的生物活性、生物可分解性和生物適應(yīng)性，并具有獨(dú)特的物理、化學(xué)和機(jī)械機(jī)械。例如，高結(jié)晶、高透水、多孔納米纖維網(wǎng)絡(luò)、高耐張力、彈性模型等。Wan等結(jié)合這兩種材料的特性,制備了nHAP/BC復(fù)合物。該材料的結(jié)構(gòu)特征類(lèi)似于骨骼中的生物磷灰石,不僅具有足夠的強(qiáng)度,還具有骨傳導(dǎo)功能,以滿(mǎn)足骨細(xì)胞在支架上的黏附和繁殖,成為一種很有前途的骨組織工程納米支架材料。生物相容性是指生物材料和人體組織接觸后,在材料-組織界面發(fā)生一系列相互作用后最終被人體組織所接受的性能,生物材料對(duì)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)影響,一直是評(píng)價(jià)生物材料生物相容性的關(guān)鍵性指標(biāo)之一。本文使用生物學(xué)評(píng)價(jià)中首選的體外篩選實(shí)驗(yàn)——細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),并采用流式細(xì)胞儀從DNA合成周期角度評(píng)價(jià)nHAP/BC復(fù)合材料及其降解產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞的相容性。1細(xì)胞毒性檢測(cè)設(shè)計(jì):體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。時(shí)間及地點(diǎn):于2009-03/05在中國(guó)藥品生物制品檢定所醫(yī)療器械中心及細(xì)胞室完成。材料:材料的降解:天津大學(xué)萬(wàn)怡灶等將nHAP沉積在BC納米纖維絲上制成復(fù)合支架nHAP/BC。陳艷梅對(duì)nHAP/BC復(fù)合材料在纖維素酶中的降解過(guò)程及降解后產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)研究。將nHAP/BC材料制成大小為1cm×1.5cm的小塊。每塊材料放入裝有45mL纖維素酶的容器中,將容器放入50℃恒溫箱中分別降解1,3,10h。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4個(gè)復(fù)樣。然后倒掉原液,用SDS清洗兩遍,再用雙蒸水清洗數(shù)遍后用PBS浸泡過(guò)夜。將原材料nHAP/BC及降解1,3,10h后的材料分別制成2mm×2mm及1cm×1.5cm的小塊數(shù)個(gè),高壓滅菌。細(xì)胞毒性的檢測(cè):(1)將第4代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的成骨細(xì)胞用胰酶消化離心后吹打成細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為5×107L-1,均勻接種到2個(gè)96孔板內(nèi),每孔100μL。(2)將孔板放入(37±2)℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(3)2d后,每孔都換新鮮的培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清),并將nHAP/BC及其降解后的材料(2mm×2mm)輕輕的放置于每個(gè)孔中央部位的細(xì)胞層上,每種材料4個(gè)復(fù)孔。(4)同法制備陰性對(duì)照(高密度聚乙烯),陽(yáng)性對(duì)照(5%二甲基亞砜),并以100%培養(yǎng)液做空白對(duì)照組。(5)在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng),且每日在倒置相差顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)及增殖情況。(6)分別于第2,4天各取96孔板1塊,按20μL/孔,加入5g/L的MTT溶液并放培養(yǎng)箱繼續(xù)孕育4h后,吸出原液,用PBS清洗1遍,吸棄孔內(nèi)液后,每孔加150μL二甲基亞砜,用微量振蕩儀輕輕振蕩10min使其充分溶解后,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm,參比波長(zhǎng)為630nm條件下測(cè)定各孔吸光度值(A值),計(jì)算每組平均A值。(7)根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR),細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考ISO-10993-5細(xì)胞毒性試驗(yàn)。RGR(%)=(實(shí)驗(yàn)組平均A值/空白對(duì)照組平均A值)×100%。細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞周期的測(cè)定:(1)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的成骨細(xì)胞用胰酶消化離心后吹打成細(xì)胞懸液,均勻接種到1cm×25cm的小培養(yǎng)瓶中,每組4個(gè)復(fù)樣。(2)將培養(yǎng)瓶放入(37±2)℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(3)1d后,每個(gè)培養(yǎng)瓶都換新鮮的培養(yǎng)液,并將nHAP/BC及其降解后的材料(1.0cm×1.5cm)輕輕的放置于每個(gè)培養(yǎng)瓶中央部位的細(xì)胞層上,留一組未加材料的做空白對(duì)照組。(4)在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng),并觀(guān)察細(xì)胞狀況。(5)1d后取出材料將細(xì)胞消化離心后制成細(xì)胞懸液。(6)將細(xì)胞懸液裝入17mm×100mm的管中,300r/min離心5min。(7)吸去上清液,加入1mL緩沖液重懸細(xì)胞,300r/min離心5min。(8)再重復(fù)步驟(7)。(9)吸去上清,加入1mL緩沖液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度到1.0×109L-1。(10)用PI染色?！稷先?00μL細(xì)胞懸液到流式管中,加入試劑A250μL,室溫反應(yīng)10min。○⑿加入試劑B200μL,室溫反應(yīng)10min。○⒀每管加入試劑C200μL,4℃避光放置10min后進(jìn)行流式周期分析。設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估者:設(shè)計(jì)為第一、二、三作者,實(shí)施為全部作者,通過(guò)第二、三作者審核、確認(rèn)和評(píng)估。參與本實(shí)驗(yàn)的作者均經(jīng)過(guò)正規(guī)培訓(xùn)。2結(jié)果2.1加樣密度對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響96孔板在倒置相差顯微鏡下放大100倍觀(guān)察,細(xì)胞接種24h;各孔細(xì)胞密度均勻,貼壁伸展,形態(tài)正常,胞體多觸角。加樣24h后,可見(jiàn)各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組無(wú)明顯差異,細(xì)胞形態(tài)良好,長(zhǎng)滿(mǎn)2/3孔底,并可見(jiàn)分裂細(xì)胞,表明細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,細(xì)胞折光性強(qiáng);陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞多變圓,核固縮或溶解,可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞崩解產(chǎn)物和死亡細(xì)胞團(tuán)聚物。各培養(yǎng)瓶的細(xì)胞在鏡下可見(jiàn)其形態(tài)良好,加材料后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1,有分裂現(xiàn)象,表明細(xì)胞在增殖生長(zhǎng)。2.2陳靈活拉克氏體的生長(zhǎng)曲線(xiàn)原材料及其降解物分別與細(xì)胞接觸2d和4d后其毒性均為1級(jí),4d時(shí)的細(xì)胞相對(duì)增殖率相對(duì)2d時(shí)稍低,原因可能為:根據(jù)陳艷梅對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)的研究,4d時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,空白對(duì)照組中的細(xì)胞增長(zhǎng)較快,而材料組中的細(xì)胞受材料壓迫的影響,增長(zhǎng)比空白對(duì)照組慢些,所以4d時(shí)細(xì)胞相對(duì)增殖率值比2d時(shí)有所降低。細(xì)胞形態(tài)良好,細(xì)胞數(shù)量和活性與陰性對(duì)照組相比無(wú)明顯差異,符合正常標(biāo)準(zhǔn),材料對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用,屬于合格無(wú)毒性。2.3材料的致癌性由圖2和表2可見(jiàn),和空白對(duì)照組相比,各材料組G0/G1期比例有所下降,S期和G2/M期比例有所增加,但大部分都是處于G0/G1期,表明細(xì)胞與材料作用后仍是正常的二倍體,未出現(xiàn)異倍體,證明材料無(wú)致瘤致癌性。而S期和G2/M期比例增加表明材料能增加成骨細(xì)胞DNA的合成,促進(jìn)成骨細(xì)胞分裂增殖,有利于成骨細(xì)胞生長(zhǎng)和組織修復(fù)。3mtt法的生物學(xué)特性可降解nHAP/BC復(fù)合支架材料具有良好的生物力學(xué)性能和生物相容性,但隨著B(niǎo)C的酶解,復(fù)合狀態(tài)存在的nHAP在使用過(guò)程中離解出來(lái),并具有相對(duì)穩(wěn)定的晶體結(jié)構(gòu)。從基體材料上脫落的納米顆粒不僅可以在植入位置附近產(chǎn)生作用,導(dǎo)致炎癥反應(yīng);而且可以通過(guò)血液或體液循環(huán)分布到肝、腎、脾、骨髓等器官中。因此,有必要對(duì)納米纖維支架材料降解后的產(chǎn)物進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)研究。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)是醫(yī)療器械生物學(xué)安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)ISO10993中的規(guī)定項(xiàng)目,是生物材料進(jìn)入臨床前的必要評(píng)價(jià),但是隨著生物材料發(fā)展的越來(lái)越復(fù)雜性,毒性試驗(yàn)方法和準(zhǔn)則需要進(jìn)行不斷的改進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中較嚴(yán)格的評(píng)價(jià)方法——直接接觸法,采取MTT比色法對(duì)細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià),1983年Mosmann首先報(bào)道了這種新的快速評(píng)定細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的比色法,目前該試驗(yàn)方法在國(guó)際上已廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué),腫瘤學(xué)和醫(yī)用生物材料的生物相容性評(píng)價(jià)。MTT法是細(xì)胞毒性檢測(cè)中的一種常用方法,能夠較快捷準(zhǔn)確的反映出材料的細(xì)胞毒性。MTT是一種淡黃色的唑氮鹽,能接受氫離子的染料,可以作用于活細(xì)胞線(xiàn)粒體中的呼吸鏈,被線(xiàn)粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原生成藍(lán)色的甲瓚結(jié)晶,而在毒性環(huán)境中,細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶活性降低(死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失)。MTT法的優(yōu)越性就在于其生物學(xué)終點(diǎn)為重要的細(xì)胞器——線(xiàn)粒體。線(xiàn)粒體在細(xì)胞的生命活動(dòng)中是一個(gè)能量供應(yīng)站,其數(shù)目在細(xì)胞活動(dòng)旺盛時(shí)增多,衰退時(shí)減少。線(xiàn)粒體病變是細(xì)胞受損傷最靈敏的指標(biāo),結(jié)晶形成的數(shù)目多寡與活細(xì)胞數(shù)目和功能狀態(tài)成正相關(guān)。同時(shí),本試驗(yàn)中采用成骨細(xì)胞用于細(xì)胞毒性試驗(yàn),也使檢測(cè)材料的毒性更加敏感。材料浸提液或材料與其特定植入部位的靶細(xì)胞(成骨細(xì)胞)相互作用,不僅能反映材料的細(xì)胞毒性,還能反映出材料對(duì)細(xì)胞毒性增殖、分化等功能的影響。因此,結(jié)果可以比較靈敏地反映細(xì)胞的毒性損害程度。結(jié)果表明nHAP/BC原材料及其降解產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞的形態(tài)無(wú)明顯影響,對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用,該材料無(wú)細(xì)胞毒性,具有良好的細(xì)胞親和性流式細(xì)胞儀從原理上來(lái)說(shuō)是一種在計(jì)算機(jī)技術(shù)支持下的高度自動(dòng)化的細(xì)胞顯微脈沖分光光度儀,它能在保持細(xì)胞、細(xì)胞器或其他微粒結(jié)構(gòu)完整性的狀態(tài)下從分子水平上進(jìn)行高靈敏度、高信息量、高速度和高精度地定量分析和分選。近年來(lái)流式細(xì)胞儀已廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域,但在材料生物相容性研究領(lǐng)域的應(yīng)用尚屬少見(jiàn)。生物材料對(duì)細(xì)胞新陳代謝過(guò)程中的細(xì)胞毒性作用必然會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)DNA合成等分子水平的改變。Chou對(duì)此提出材料的分子相容性概念。采用流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)材料的生物相容性,比較客觀(guān)、精確、快速、可靠,是一種很好的評(píng)價(jià)方法。本文在傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性MTT比色法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步使用流式細(xì)胞儀嘗試分析材料作用于細(xì)胞后對(duì)其增殖周期各時(shí)相的影響,從而在分子水平上評(píng)價(jià)材料對(duì)細(xì)胞的毒性作用。流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期的分析主要是對(duì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)DNA含量的分析,通過(guò)標(biāo)記物發(fā)出紅色熒光的強(qiáng)弱可推算出G0、G1期(二倍體)、S期(超二倍體)、G2、M期(四倍體)的比例,其結(jié)果以DNA分布的直方圖形式顯示,進(jìn)而可計(jì)算出G0/G1期,S期,G2/M期的比例來(lái)了解細(xì)胞的增殖能力,并可了解細(xì)胞的增殖狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)采用PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,再用流式細(xì)胞儀對(duì)成骨細(xì)胞的DNA進(jìn)行分析,從分子水平上進(jìn)一步表明原材料及其降解物無(wú)致瘤致癌性,并且能增加成骨細(xì)胞DNA的合成,促進(jìn)成骨細(xì)胞分裂增殖,有利于成骨細(xì)胞的生