旁核微量注射催產(chǎn)素對(duì)大鼠gir后胃黏膜細(xì)胞胃泌素表達(dá)的影響

旁核微量注射催產(chǎn)素對(duì)大鼠gir后胃黏膜細(xì)胞胃泌素表達(dá)的影響

胃素是一種具有廣泛生理和病理作用的胃腸激素。它從胃突的g細(xì)胞釋放，刺激壁細(xì)胞分泌胃酸，刺激腸惡意軟件（ecl）釋放大量各組，增加組織炎癥和血管透射性。胃透射素還能抑制幽門括約肌的張力，導(dǎo)致功能障礙，膽囊回流，導(dǎo)致胃粘膜炎癥和潰瘍等損害。但胃泌素有時(shí)也具有生長(zhǎng)因子的作用,促進(jìn)胃黏膜的生長(zhǎng)。大鼠胃缺血/再灌注(gastricischemia/reperfusion,GI/R)是目前常用的一種研究胃損傷的模型,其發(fā)生與多種因素有關(guān),如胃黏膜內(nèi)氧自由基生成過多、內(nèi)皮素水平升高、胃微循環(huán)障礙、白細(xì)胞浸潤(rùn)、一氧化氮釋放、胃酸分泌增多、前列腺素合成減少等,而有關(guān)胃泌素在其中作用的研究較少。此外,下丘腦室旁核(paraventricularnucleus,PVN)對(duì)胃酸分泌、胃運(yùn)動(dòng)、胃電活動(dòng)均有廣泛的調(diào)節(jié)作用。PVN內(nèi)包含多種神經(jīng)元,可分泌多種神經(jīng)遞質(zhì),其中包括催產(chǎn)素(oxytocin,OT)能神經(jīng)元及其受體。PVN以及OT能神經(jīng)元及其受體參與對(duì)胃黏膜損傷的調(diào)節(jié),刺激PVN及PVN內(nèi)微量注射OT能夠減少胃酸分泌,減輕胃潰瘍;我們以前的研究發(fā)現(xiàn)電刺激PVN可減輕GI/R損傷。那么,PVN內(nèi)微量注射OT對(duì)GI/R損傷是否有影響呢?這種影響是否通過胃黏膜局部胃泌素所介導(dǎo)呢?因此,本研究通過建立GI/R模型,應(yīng)用核團(tuán)微量注射、免疫組化等方法,探討了PVN內(nèi)微量注射OT對(duì)GI/R損傷的影響及胃泌素在其中的作用機(jī)制。1材料和方法1.1試驗(yàn)試劑和儀器OT購(gòu)自上海第一生化藥業(yè)有限公司;atosiban購(gòu)自深圳翰宇生物工程有限公司;胃泌素兔多克隆抗體、PowerVision二步法免疫組化檢測(cè)系統(tǒng)、DAB顯色試劑盒、枸櫞酸鹽緩沖液、多聚賴氨酸溶液購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為市售化學(xué)純。1.2sd大鼠分組健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(220～240g),雌雄不拘,由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(使用許可號(hào):SYXK[su]2002-0038)。實(shí)驗(yàn)前禁食24h,自由飲水。將SD大鼠隨機(jī)分為5組,每組6只:①單純GI/R組(GI/R組);②PVN內(nèi)微量注射生理鹽水0.3μl后進(jìn)行GI/R組(vehicle組);③PVN內(nèi)微量注射OT600ng/0.3μl后進(jìn)行GI/R組(OT組);④側(cè)腦室內(nèi)微量注射atosiban1.2μg/5μl后再進(jìn)行PVN內(nèi)微量注射OT600ng/0.3μl,然后制備GI/R組(OT+atosiban組);⑤側(cè)腦室內(nèi)微量注射atosiban1.2μg/5μl后進(jìn)行GI/R組(atosiban組)。1.3pvn和atosiban的注射動(dòng)物在麻醉下(10%水合氯醛400mg/kg腹腔注射)固定于腦立體定位儀上,按照Paxinos和Watson腦圖譜及我們以前的方法定位PVN(坐標(biāo):AP1.5mm,R0.4mm,H7.7～7.8mm,門齒瓣低于耳間連線3.3mm)和側(cè)腦室(坐標(biāo):AP1.0mm,L1.5mm,H4.5mm),在2min內(nèi)將OT600ng/0.3μl微量注射到PVN或?qū)tosiban1.2μg/5μl注射到側(cè)腦室。vehicle組注射等體積的生理鹽水。1.4分離治療動(dòng)脈夾按Wada等方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)大鼠水合氯醛麻醉后,仔細(xì)分離腹腔動(dòng)脈與周圍組織,用小動(dòng)脈夾夾閉腹腔動(dòng)脈30min后去除動(dòng)脈夾恢復(fù)血流再灌注60min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取胃計(jì)數(shù)胃黏膜損傷指數(shù)。1.5損傷大小及分?jǐn)?shù)參照Guth等方法加以改進(jìn)。以腺胃區(qū)局限于胃上皮的點(diǎn)狀糜爛、潰瘍、出血灶的長(zhǎng)度累積計(jì)分:正常為0分;損傷小于1mm計(jì)1分;1～2mm計(jì)2分;～3mm計(jì)3分;余類推。損傷寬度超過1mm時(shí),分?jǐn)?shù)加倍。每組大鼠損傷分?jǐn)?shù)的平均值為胃黏膜損傷指數(shù)。測(cè)量完胃黏膜損傷指數(shù)后將胃組織在10%中性甲醛溶液內(nèi)固定,石蠟包埋切片后用于免疫組化染色。1.6形態(tài)分析指標(biāo)胃泌素染色步驟按照北京中杉生物技術(shù)有限公司提供的PowerVision二步法免疫組化檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行。DAB顯色,蘇木精復(fù)染,梯度乙醇脫水,中性樹膠封片。光鏡下觀察到胞質(zhì)或胞核內(nèi)有棕色顆粒者即為陽性細(xì)胞。用Image-ProPlus圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行半定量分析。以高倍視野下陽性細(xì)胞面積(area)、平均光密度(meanopticaldensity,MOD)、累積光密度(integratedopticaldensity,IOD)作為分析指標(biāo)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)以PBS緩沖液代替一抗。每例3張間斷切片,每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野,取平均值。1.7統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析法(ANOVA)。P<0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1pvn微量注射對(duì)di/r損傷的保護(hù)效應(yīng)1h后胃黏膜損傷的影響首先我們觀察到GI/R1h可引起胃黏膜明顯損傷,其胃黏膜損傷指數(shù)為143.6±40.0(GI/R組);PVN微量注射溶劑(生理鹽水)后,GI/R1h仍可引起明顯的胃黏膜損傷,其損傷指數(shù)為139.6±35(vehicle組),與GI/R組差異無顯著性(P>0.05);PVN微量注射OT600ng后,可顯著減輕GI/R1h后的胃黏膜損傷,胃黏膜損傷指數(shù)為29.67±13.37(P<0.01,vs.vehicle組)。然后觀察了PVN微量注射OT對(duì)GI/R損傷的保護(hù)效應(yīng)是否由中樞內(nèi)的OT受體介導(dǎo)。在PVN微量注射OT和GI/R之前,側(cè)腦室注射OT受體拮抗劑atosiban。結(jié)果表明,atosiban1.2μg可完全阻斷OT(600ng)對(duì)GI/R損傷的保護(hù)效應(yīng),胃黏膜損傷指數(shù)為136.4±31.1(P<0.01vs.OT組)。而側(cè)腦室單獨(dú)注射OT受體拮抗劑atosiban并不影響GI/R損傷,胃黏膜損傷指數(shù)為147±51.2(P>0.05vs.GI/R組)。2.2對(duì)胃泌素蛋白表達(dá)的影響為了闡明胃泌素是否介導(dǎo)OT的保護(hù)效應(yīng),我們采用了免疫組化方法觀察了各組胃黏膜胃泌素蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),PVN微量注射OT(600ng)可明顯減少GI/R1h后胃泌素蛋白的表達(dá)水平(P<0.01),經(jīng)Image-ProPlus系統(tǒng)分析OT組胃泌素表達(dá)陽性細(xì)胞面積、MOD、IOD分別是vehicle組的29.06%、53.64%、26.47%,而atosiban可取消OT的這種效應(yīng),胃泌素蛋白的表達(dá)水平升高,與vehicle組差異無顯著性(P>0.05,圖1、2)。3胃泌素對(duì)di/r損傷的保護(hù)作用胃泌素既是一種胃腸激素,又是中樞和外周神經(jīng)遞質(zhì)。它主要由胃竇部G細(xì)胞分泌,此外,在胃底、十二指腸、空腸、人胰島的D細(xì)胞、頰黏膜、舌、食管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)也含有胃泌素。胃泌素可促進(jìn)胃酸分泌和黏膜的生長(zhǎng),促進(jìn)胃腸道的運(yùn)動(dòng),松弛幽門括約肌、膽道口括約肌和回盲部括約肌,促進(jìn)胃及上部腸道黏膜細(xì)胞的分裂增殖,使胃黏膜增厚。胃泌素促進(jìn)多種參與黏膜細(xì)胞增殖、分化和遷移的基因表達(dá)上調(diào),從而參與黏膜上皮細(xì)胞維護(hù)和重構(gòu)。由于胃泌素促進(jìn)胃酸分泌和組胺的釋放,因此認(rèn)為胃泌素參與胃黏膜損傷的過程,是一個(gè)重要的致?lián)p傷因素;但也有文獻(xiàn)報(bào)道外源性或內(nèi)源性胃泌素在100%乙醇灌胃引起的胃損傷中起保護(hù)作用?？梢?胃泌素對(duì)胃黏膜損傷以及修復(fù)過程均有調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)顯示,GI/R后伴隨著胃黏膜損傷的產(chǎn)生,胃黏膜細(xì)胞有大量的胃泌素表達(dá),PVN內(nèi)給予OT在明顯減輕GI/R損傷的同時(shí),胃黏膜細(xì)胞胃泌素的表達(dá)也明顯減少,而OT受體拮抗劑可以阻斷OT對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用,并使胃黏膜細(xì)胞胃泌素的表達(dá)增多。因此,我們認(rèn)為,胃泌素參與了GI/R損傷過程以及PVN內(nèi)給予OT后對(duì)GI/R損傷的保護(hù)作用。在GI/R損傷的發(fā)生發(fā)展過程中,胃酸具有重要作用。如將0.1mol/L鹽酸灌入無缺血胃內(nèi),未見明顯的黏膜損傷;用同樣濃度的鹽酸灌入缺血/再灌注胃內(nèi),則產(chǎn)生明顯的胃黏膜損傷。如果改用低濃度(0.05mol/L)的鹽酸灌入缺血/再灌注胃內(nèi),其損傷程度遠(yuǎn)低于高濃度組。文獻(xiàn)報(bào)道PVN內(nèi)微量注射OT能夠減少胃酸分泌,減輕胃潰瘍。我們以前的研究也發(fā)現(xiàn)電刺激PVN能明顯減輕GI/R后胃酸分泌,外周給予OT也能使