碳納米管辣根過氧化物酶多層膜無試劑h

碳納米管辣根過氧化物酶多層膜無試劑h

在工業(yè)、環(huán)境管理、食品、藥物分析和臨床控制等領(lǐng)域，檢測過氧化氫具有重要意義。檢測b2o2的方法包括光譜法、化學(xué)發(fā)光、滴定和電氣法。在這些方法中，基于酶電極的電磁干燥生物傳感器方法具有高度的靈敏度、線性面積和選擇性。電子介體型的酶電化學(xué)傳感器因具有響應(yīng)速度快、降低操作電位和降低干擾等優(yōu)點而受到眾多研究者的關(guān)注.硫堇和以硫堇為單體電聚合生成的聚硫堇具有很好的電催化活性,聚硫堇相對于單體硫堇而言不易流失且穩(wěn)定性好,近年已在免疫傳感器、NADH和酶傳感器中充當優(yōu)異的電子介體.碳納米管自1991年被發(fā)現(xiàn)以來因其特有的力學(xué)、電學(xué)和化學(xué)性質(zhì),使其在電化學(xué)尤其在電化學(xué)生物傳感器方面迅速成為研究熱點.然而由于CNTs在大多數(shù)溶劑中不溶,構(gòu)筑CNTs酶修飾電極的最大難點是得到穩(wěn)定有序的CNTs膜層.近年來,研究者采用表面活性劑、聚電解質(zhì)、生物分子、pH調(diào)控等方式分散碳納米管,并將分散后的碳納米管與層層組裝方法結(jié)合構(gòu)筑穩(wěn)定有序的CNTs膜層化學(xué)修飾電極和酶電極.如Zhang和Chen等用簡單的pH調(diào)控分散碳納米管和層層組裝方法結(jié)合構(gòu)筑了穩(wěn)定的CNTs膜層修飾電極:層層組裝聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDDA)和堿性緩沖液溶液分散的CNTs制備了催化半胱氨酸和多巴胺的CNTs膜層修飾電極.采用層層組裝法構(gòu)筑辣根過氧化物酶電極對過氧化氫的檢測已有報道,但利用聚硫堇為介體,層層組裝HRP和堿性緩沖液pH調(diào)控分散的CNTs構(gòu)筑HRP多層膜電極的研究未見報道.本文首先在玻碳電極表面電聚合電子介體——聚硫堇,然后利用聚硫堇表面氨基帶的正電荷,層層組裝HRP和堿性緩沖溶液分散的CNTs,最后再用聚硫堇包覆電極,使酶不易流失.該傳感器具有簡單、可調(diào)控等優(yōu)點,為過氧化氫傳感器的制備提供了一種新的途徑.1實驗1.1聚苯乙烯磺酸鈉pss硫堇(TH)(上?；瘜W(xué)試劑公司);多壁碳納米管(純度>90%,直徑10~30nm,來自SunNanotechCoLtd);辣根過氧化酶(250U/mg,等電點7.2)、聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)購自SigmaAldrich.電化學(xué)工作站CHI660C(上海辰華儀器公司);三電極體系(鉑電極對電極,Ag/AgCl參比電極,3mm直徑玻碳電極為工作電極).1.2cnts懸浮液的制備稱取200mgCNTs,加入80mL混酸[V(H2SO4)∶V(HNO3)=3∶1]超聲8h.用蒸餾水洗至濾液pH為中性,在恒溫干燥箱中烘干,研磨至粉末,保存?zhèn)溆?取10mg上述處理過的CNTs溶于10mLpH=10的緩沖溶液中,超聲20min,制成1mg/mL黑色的懸浮液.1.3修飾電極的制備將玻碳電極(GCE)用0.05μm的Al2O3粉拋光,接著依次用無水乙醇和蒸餾水超聲洗滌干凈,再在0.5mol/L的H2SO4溶液中于-0.3~1.5V下掃描活化.首先將活化了的GCE電極置于0.10mmol/LTH(pH=6.81PBS)中在1.5V下預(yù)陽極化5min,然后循環(huán)伏安掃描100圈.接著將其依次浸泡于1mg/mL的CNTs溶液和1mg/mLHRP(pH6.47PBS)中各30min,交替浸泡多次,得到所需層數(shù).最后在0.10mmol/LTH(pH=6.81PBS)中掃描100圈,得到所需修飾電極.未加碳納米管的修飾電極采用PSS和HRP按同樣的方法交替組裝.1.4輔助電極性能測定本實驗的測定均采用三電極體系:酶修飾電極為工作電極,Ag/AgCl(飽和KCl)作為參比電極,鉑絲作為輔助電極.交流阻抗譜(EIS)是在含0.10mol/LKCl的5.0mmol/LK3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](V∶V=1∶1)氧化還原探針溶液中測定得到(振幅:0.005V,頻率范圍:1~100000Hz),并通過ZSimpwin軟件模擬而成.2結(jié)果與討論2.1聚硫重要電極的表征活化了的GC電極于1.5V下預(yù)陽極化5min后,將其置于0.10mmol/LTH中循環(huán)伏安掃描100圈,得到圖1A.由圖可知,在聚合過程中,出現(xiàn)了一對聚硫堇的氧化還原峰.隨著掃描圈數(shù)的增加,氧化峰電流和還原峰電流逐漸增大,并趨于穩(wěn)定,表明聚硫堇在電極表面成膜.圖1A插圖為掃描100圈后聚硫堇的循環(huán)伏安圖,還原峰電位為-0.258V,氧化峰電位為-0.234V.2.2修飾電極的修飾圖1B為不同層數(shù)的HRP修飾電極在pH6.81PBS中的CV圖.隨著層數(shù)的增加,聚硫堇的峰電流值隨之增大.這是由于碳納米管具有促進電子傳遞的作用.當CNTs/HRP酶膜層達到5層時,峰電流值達到最大,繼續(xù)增大膜層,由于膜太厚,反而阻礙了電子傳遞.圖1B插圖為不同層數(shù)的HRP修飾電極對0.60mmol/LH2O2的響應(yīng)情況.從插圖中也可以看到5層時,修飾電極對H2O2的響應(yīng)最大.因此本文采用5層體系進行研究.我們采用電化學(xué)阻抗對PTH/(HRP/CNTs)5/PTH/GC電極組裝過程進行表征.從圖2A中可看到:隨著電極表面的層層修飾,阻抗也隨之發(fā)生變化.在電化學(xué)阻抗譜中,半圓的直徑對應(yīng)于電子傳遞阻抗Rct(見圖2A右上插圖中等效電路圖).裸玻碳電極呈現(xiàn)一個很小的半圓;當表面聚合硫堇后,半圓的直徑略有減小,這說明聚硫堇有利于電子傳遞;當電極上層層組裝CNTs/HRP時,隨著層數(shù)的增加,電子傳遞阻抗呈線性增大(如圖2A右上插圖),表明酶分子在修飾電極上成膜,阻礙了[Fe(CN)6]4-/3-到玻碳電極表面的電子傳輸,同時也說明(CNTs/HRP)5已成功組裝到聚硫堇修飾電極上;最后在電極最外層聚合一層硫堇,由于聚硫堇的促進電子傳遞效應(yīng),使得阻抗變小.我們用循環(huán)伏安法研究了HRP修飾電極對H2O2還原的催化行為,如圖2B所示,修飾電極在未加H2O2時呈現(xiàn)出聚硫堇的一對氧化還原峰,加入過氧化氫后,還原峰電流顯著增大,氧化峰電流減小,表明該酶電極對H2O2有明顯的電催化作用.催化機理如下:2.5酶修飾電極穩(wěn)定性圖5為最優(yōu)條件下該酶電極對連續(xù)滴加H2O2的計時電流響應(yīng)圖.在2.0×10-6~6.29×10-3mol/LH2O2濃度范圍內(nèi),峰電流與濃度成良好線性關(guān)系,線性方程為:Y(A)=-9.723×10-8+0.00151c(mol/L),相關(guān)系數(shù)為0.998(圖5A插圖),檢測限為1.0×10-6mol/L(S/N=3)該電極的靈敏度比文獻報道的硫堇修飾的HRP電極的高.由于多層膜電極的膜層薄,該傳感器的響應(yīng)時間迅速,達95%響應(yīng)電流的時間約3s.在0.20mmol/LH2O2中平行測定10次,相對標準偏差為4.8%.將酶修飾電極置于4℃的冰箱中考察其穩(wěn)定性,一個月以后仍保留響應(yīng)電流的70%左右,表明該電極具有較好的穩(wěn)定性.2.6不同干擾物對過氧化氫測定的影響為了考察該傳感器的抗干擾性,在測定20.0μmol/LH2O2時加入0.10mmol/L葡萄糖、抗壞血酸、甘氨酸、組氨酸和尿素,結(jié)果見表1.電流比是指傳感器測定含有0.10mmol/L干擾物和20.0μmol/LH2O2時的電流響應(yīng)值與測定僅含有20.0μmol/LH2O2時的電流響應(yīng)值之比.從表1可見這些常見的干擾物對該電極測定過氧化氫沒有影響.為了研究該電極測定過氧化氫的實用性,測定了分別加入20.0,40.0和50.0μmol/L過氧化氫標樣的回收率,結(jié)果見表2,得到滿意的回收率.3hrp多層膜電極對過氧化氫酶活性的調(diào)控本文結(jié)合電聚合和層層組裝方法,利用pH調(diào)控分散CNTs構(gòu)筑了電子介體聚硫堇修飾的CNTs/HRP多層膜電極.電化學(xué)阻抗譜表征了CNTs/HRP層層組裝過程,結(jié)果表明HRP與pH調(diào)控分散的CNTs可有效的組裝構(gòu)筑多層酶膜.由于CNTs具有的良好的電學(xué)性質(zhì)CNTs引入到HRP電極中顯著地提高了HRP電極的靈敏度.本文探討了酶組裝層數(shù)、工作電位、pH值對電極響應(yīng)的影響,并研究了HRP多層膜電極對過氧化氫的電化學(xué)性能:線性范圍為2.0×10-6~6.29×10-3mol/L靈敏度為0.00151A·L/mol.在反應(yīng)(1)中,H2O2快速擴散到電極表面,被HRP還原;接著HRP-I被PTHH還原為HRP(PTHH和PTH+分別代表聚硫堇的還原態(tài)和氧化態(tài)),最后氧化態(tài)的PTH+在電極上被還原為PTHH,產(chǎn)生還原電流.2.3pth/pss5/pth/gce電極對h2的表達為了驗證CNTs的引入對HRP電極靈敏度的提高,我們用PSS取代CNTs制備了PTH/(HRP/PSS)5/PTH/GCE和PTH/(HRP/CNTs)5/PTH/GCE電極,兩個電極對H2O2的響應(yīng)如圖3.由于碳納米管良好的電學(xué)性質(zhì)和高比表面積使得HRP傳感器的響應(yīng)值明顯增大.2.4實驗條件的優(yōu)化2.4.1ph值對酶修飾電極對h3的響應(yīng)采用計時電流法考察了HRP傳感器在不同pH值(4.6至8.04)的緩沖液中對1.0mmol/LH2O2的響應(yīng)情況.如圖4A所示,隨著pH值的增大,還原電流先增大后減小.從圖4A中還可看到pH為6.81時,酶修飾電極對H2O2的響應(yīng)最大.因此本實驗選擇底液pH值為6