兩棲類離體標本的制作

實驗二、兩棲類立體標本的制作121140052王哲迪一、 實驗?zāi)康?、 急性實驗，離體標本制備2、 細胞內(nèi)/試管內(nèi)，在體/離體區(qū)別3、 內(nèi)環(huán)境、任氏液4、 手術(shù)器械的正確使用二、 實驗原理1、 急性動物實驗與慢性動物實驗急性動物實驗可分為離體和在體實驗兩種方法。離體實驗：是從活著的或剛處死的動物身上取出所需要的器官、組織、細胞或細胞中的某些成分。置于一個能保持其正常功能活動的人工環(huán)境中，觀察某些人為的干預(yù)因素對其功能活動的影響。例如，對離體蛙心或動物血管條進行灌流，可用于研究某些生物活性物質(zhì)或藥物對心肌或血管平滑肌收縮力的影響；應(yīng)用膜片鉗技術(shù)可研究細胞小片膜上單個離子通道的電流特性。在體實驗：是在動物麻醉條件下，手術(shù)暴露某些所需研究的部位，觀察和記錄某些生理功能在人為干預(yù)條件下的變化。例如，以動脈插管記錄動物血壓，可用于觀察某些神經(jīng)或體液因素對血壓的影響；將玻璃微電極插入腦內(nèi)某些部位進行細胞外或細胞內(nèi)記錄，觀察神經(jīng)元在接受某些刺激時放電活動的變化，以了解這些神經(jīng)元的生理功能。急性動物實驗的優(yōu)點是實驗條件比較簡單，條件較易控制，便于進行直接的觀察和細致的分析；離體實驗則更能深入到細胞和分子水平，有助于揭示生命現(xiàn)象中最為本質(zhì)的基本規(guī)律。慢性動物實驗：慢性動物實驗以完整、清醒的動物為研究對象，且盡可能保持外界環(huán)境接近于自然，以便能在較長時間內(nèi)觀察和記錄某些生理功能的改變。實驗前一般需對動物作某些預(yù)處理，待動物康復(fù)后再進行觀察。慢性動物實驗適用于觀察某一器官或組織在正常情況下的功能以及在整體中的作用地位，但不宜用來分析某一器官或組織細胞生理功能的詳細機制。與急性動物實驗相比，慢性動物實驗的干擾因素較多，實驗條件較難控制。2、 蟾蜍作為生理學(xué)實驗?zāi)Ｊ缴锏膬?yōu)點兩棲類動物生存環(huán)境較簡單，離體組織或器官所要求的條件也較簡單。坐骨神經(jīng)和腓腸肌屬于可興奮組織，把它們置于人工配制的任氏液中，其興奮性在幾個小時內(nèi)保持不變。若給坐骨神經(jīng)一個適宜的刺激，可在神經(jīng)和肌肉上產(chǎn)生一個可傳導(dǎo)的動作電位，肉眼可以看到一次肌肉的收縮和舒張，表明神經(jīng)和肌肉興奮了一次。三、 動物與器材1、 實驗動物：蟾蜍4只/組2、 實驗用具：毀髓針、鋅銅弓、解剖盤、玻璃分針、培養(yǎng)皿、燒杯、蛙板、蛙釘?shù)取?、 實驗試劑：任氏液四、 方法與步驟1、 雙毀髓左手握蟾蜍，背部向上。用食指按壓其頭部前端，拇指壓住軀干的背部，使頭向前俯；右手持毀髓針，由兩眼之間中線向后方劃觸，觸及兩耳后腺之間的凹陷處即是枕骨大孔的位置。將毀髓針由凹陷處垂直刺入枕骨大孔，然后針尖向前刺入顱腔，在顱腔內(nèi)攪動，以毀腦組織。再將毀髓針退全枕骨大孔，針尖轉(zhuǎn)向后方，與脊柱平行刺入椎管，以搗毀脊髓。脊髓徹底搗毀時，可看到蟾蜍后肢突然蹬直，然后癱軟，此時的動物為雙毀髓動物。2、 剪除軀干上部及內(nèi)臟用骨剪剪斷脊柱，然后往后肢方向撕剝皮膚。左手握住蟾蜍下肢，大拇指抵住脊柱尾骨，右手用粗剪刀沿脊柱兩側(cè)剪開腹壁。此時軀干上部及內(nèi)臟即全部下垂。剪除全部軀干上部及內(nèi)臟組織，棄于燒杯內(nèi)。3、 剝皮左手持鑷子夾住脊柱，右手捏住皮膚邊緣，向下牽拉剝離皮膚。拉至大腿時，如阻力較大，用力剝。將全部皮膚剝除后，用任氏液洗凈標本。然后洗凈雙手和用過的全部手術(shù)器械，再進行下列步驟。4、 分離坐骨神經(jīng)將一側(cè)后肢的脊柱端腹面向上，用大頭針將標本背位固定于蛙板上。用玻璃分針沿脊神經(jīng)向后分離坐骨神經(jīng)。股部沿腓腸肌正前方的股二頭肌和半膜肌之間的裂縫，縱向分離暴露坐骨神經(jīng)的大腿部分，直至分離全胭窩脛神經(jīng)分叉處。完全暴露坐骨神經(jīng)。5、游離腓腸肌5、游離腓腸肌在腓腸肌跟腱下穿線并結(jié)扎，提起結(jié)扎線，剪斷肌腱與脛腓骨的聯(lián)系，游離腓腸肌。6、 檢查標本將制備好的標本浸泡到任氏液中5-10min，待其功能穩(wěn)定后，用任氏液沾濕的鋅銅弓的兩極接觸神經(jīng)，如腓腸肌迅速發(fā)生收縮，則標本機能正常。五、結(jié)果與分析

上面這張圖里并沒有顯示出大腿上的坐骨神經(jīng)，因為坐骨神經(jīng)在肱二頭肌和半膜肌的夾縫里，要用玻璃分針挑起來才能看到，這張圖沒有挑起來，完全看不到坐骨神經(jīng)，只能看到腓腸肌和被剪斷的肌腱，這一點很失敗。但是經(jīng)鋅銅弓檢驗，標本的機能正常。用任氏液濕潤鋅銅弓后，鋅銅弓接觸坐骨神經(jīng)時腓腸肌迅速收縮。需要注意的是，用鋅銅弓檢驗神經(jīng)標本機能時，要用玻璃分針挑著坐骨神經(jīng)，不能用金屬的鑷子夾著神經(jīng)，金屬器械碰壓神經(jīng)與腓腸肌，會引起肌肉收縮，如果碰的較重，損傷部位及近端的神經(jīng)就死亡了，以后刺激只能從損傷處向肌肉處之間的部分.另外容易使標本疲勞，失去活性。分離下來的坐骨神經(jīng)干失去了大量水分，而且神經(jīng)上還纏繞有少量血管，分離的不干凈，這一點不成功。但是神經(jīng)十一直分離到了腳趾都沒有斷，這一點比較成功。3、 鋅銅弓工作原理鋅銅弓：在生理學(xué)實驗中，鋅銅弓是檢驗標本機能活性最常用而簡易的刺激器。由銅片和鋅片兩種金屬制成。鋅銅弓具有刺激作用，是因為金屬與溶液之間產(chǎn)生電位差，即電極電位。通常將金屬浸入電解質(zhì)溶液中，如Zn便溶解而成Zn離子。而在Zn的里面則形成負離子。Cu在溶液中則相反，金屬與溶液之間便產(chǎn)生了電位差一一電極電位。如果將Zn和Cu一端接觸，則在接觸部位電流由Cu向Zn方向流動；而在溶液中則相反，由Zn向Cu流動。當鋅銅弓接觸組織時（注意：表面必須濕潤）電流便沿Znf可興奮組織fCu方向流動，而產(chǎn)生流動作用。這樣，鋅銅弓好像一個電池，Zn如同其陽極，Cu好像陰極而發(fā)揮作用。神經(jīng)或肌肉的電刺激閾值非常小，所以僅用鋅銅弓接觸，即可構(gòu)成刺激，以便檢驗組織的機能活性。鋅銅弓測試法：做好的標本用鋅銅弓的兩極輕輕接觸坐骨神經(jīng)，腓腸肌立即收縮，表示標本的興奮性良好。金屬器械接觸神經(jīng)引起肌肉收縮與鋅銅弓的差異：神經(jīng)細胞的靜息膜電位為外正內(nèi)負，如果刺激使膜電位差值減?。ㄈO化），細胞則興奮。金屬器械是導(dǎo)體，而且人也是導(dǎo)體，當手拿著金屬器械去接觸神經(jīng)時，神經(jīng)細胞外表面的正電荷會沿著導(dǎo)體導(dǎo)入大地，使得細胞去極化，所以產(chǎn)生興奮。4、 電生理對現(xiàn)代生理學(xué)的影響電生理學(xué)是生理學(xué)的一部分，它主要研究活組織的生物電現(xiàn)象和電流對活組織所產(chǎn)生的生理影響。電生理學(xué)對現(xiàn)代生理學(xué)發(fā)展起著重要的作用。膜片鉗技術(shù)（patchclamprecordingtechniquss）是1976年由Neher和Sakamann共同創(chuàng)立的〔1〕，它是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜上單一的（或多個的）離子通道分子活動的技術(shù)。該技術(shù)能分辨通過細胞膜單個通道的電流,從而可以對通道的電導(dǎo)及其動力學(xué)特性、藥理學(xué)特性、以及通道的調(diào)節(jié)機制開展深入的研究，并為通道的分型提供可靠的新的標準，進而發(fā)現(xiàn)并區(qū)分出了許多新的通道類型。另外，膜片鉗技術(shù)可準確監(jiān)測出微小的與細胞分泌有相關(guān)性的膜電容的變化〔2〕，因而它還是一種研究細胞分泌機制的電生理新方法。因而此技術(shù)被認為與基因克隆技術(shù)并駕齊驅(qū)，給生命科學(xué)研究帶來了巨大的前進動力。Neher和Sakamann因此榮獲1991年度的諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。膜片鉗技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合運用可以研究解釋生命活動的許多現(xiàn)象。例如，almer和Neher用膜片鉗技術(shù)與Fura-2顯微熒光測鈣技術(shù)的結(jié)合觀測熒光強度〔3〕進而分析研究細胞內(nèi)鈣化離子濃度與細胞分泌之間的關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化（生理范圍）在嗜銘細胞或神經(jīng)細胞的分泌中起重要調(diào)節(jié)作用，而在肥大細胞中的分泌卻無明顯作用。總之，隨著膜片鉗技術(shù)的進一步完善及與其它技術(shù)有機結(jié)合的發(fā)展，它們在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用必將越來越顯示其威力。5、 規(guī)范使用手術(shù)器械的意義只有按照規(guī)范使用手術(shù)器械完成實驗才能提高技術(shù)操作水平。規(guī)范使用手術(shù)器械可以降低器械的損耗程度。正確使用手術(shù)器械才能得到正確的實驗結(jié)果。正確使用手術(shù)器械還可以避免對人造成傷害。六、 參考文獻1、徐濤等 細胞膜離子通道電流及胞內(nèi)鈣離子濃度同時定量檢測 武漢大學(xué)學(xué)報，1995,2:24—282、 JaffeL,HagiwaraS,KadoR.Thetimecourseofcorticalvesiclefusioninseaurchineggsobservedasmembra