豬圓環(huán)病毒的診斷與控制

豬圓環(huán)病毒的診斷與控制

豬環(huán)病毒（pcv）屬于環(huán)病科和環(huán)病科，是單帶負(fù)鏈環(huán)形dna病毒。該病毒粒子直徑為14nm~25nm,為二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu),無囊膜,是獸醫(yī)學(xué)上已知?jiǎng)游锊《局凶钚〉牟《局?。根?jù)PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列,將其分為PCV-1和PCV-2兩型。有關(guān)PCV引起疾病的最早報(bào)道發(fā)生在1991年的加拿大,是由PCV-2引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)。至1994年P(guān)MWS已呈廣泛性流行,法國、美國、西班牙、北愛爾蘭及日本相繼報(bào)道了該病的發(fā)生,此后韓國、意大利、德國、丹麥、荷蘭、墨西哥等國家也證實(shí)了該病的存在。我國雖然自2000年才有對(duì)圓環(huán)病毒感染豬的報(bào)道并引起重視,但對(duì)于豬血清中豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)抗體所作的回顧性檢測(cè)以及對(duì)豬的組織樣本所作的回顧性檢測(cè)結(jié)果表明,PCV-2抗體至少從1969年起就已經(jīng)存在于豬群中了。臨床上豬感染PCV-1很常見,普遍認(rèn)為廣泛存在于豬體內(nèi)及豬源傳代細(xì)胞系,由于其無致病性,所以無法通過臨床癥狀或病理診斷來確定是否感染PCV-1。但PCV-2與豬群中發(fā)生的多種疾病相關(guān),有其相應(yīng)的臨床癥狀和病理表現(xiàn),在臨床上主要引起PMWS、豬皮炎腎病綜合征(Porcinedermatitisandnephropathysyndrome,PDNS)、豬呼吸道疾病復(fù)合征(Porcinerespiratorydiseasecomplex,PRDC)及A2型先天性震顫(Congenitaltremor,CT)。PCV-2與豬細(xì)小病毒(Porcineparvovirus,PPV)、豬流感病毒(Swineinfluenzavirus,SIV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)等病原可以混合感染,致病性增強(qiáng)。本文綜述了豬圓環(huán)病毒診斷學(xué)方法的研究進(jìn)展,以供借鑒。1豬一般情況的發(fā)生情況豬感染PCV-2后主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性消瘦,生長遲緩,采食量下降,被毛粗亂,精神差,相當(dāng)一部分豬只出現(xiàn)呼吸困難呈腹式呼吸,少數(shù)豬只有拉稀癥狀,有的豬出現(xiàn)貧血,個(gè)別豬出現(xiàn)黃疸癥狀;PCV-2感染豬引起的CT,震顫為雙側(cè),影響骨骼肌肉,當(dāng)臥下或睡覺時(shí)震顫消失,外界刺激可引發(fā)或加重震顫,有的在整個(gè)生長和發(fā)育期間都不斷發(fā)生震顫;PCV-2感染豬引起PDNS的臨床癥狀常見為皮膚發(fā)生圓型或不規(guī)則的隆起,呈現(xiàn)紅色或紫色中央為黑色病灶。2肺長期感染型感染豬感染PCV-2后,最顯著的剖檢病變是全身淋巴結(jié),特別是腹股溝淋巴結(jié)、縱隔淋巴結(jié)、肺門淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)及下頜淋巴結(jié)腫大2倍~5倍,有時(shí)可達(dá)10倍;肺臟腫脹、堅(jiān)硬或似橡皮,部分病例形成固化、致密的病灶。嚴(yán)重病例肺泡出血,肺呈紫褐色,有的肺尖葉和心葉萎縮或?qū)嵸|(zhì)性病變;半數(shù)病例為輕度到中度的肝萎縮,花斑肝。肝小葉間結(jié)締組織增生明顯;脾臟常腫大,呈肉樣變化;腎為花斑腎,水腫,呈灰白色,被膜下有時(shí)有白色壞死灶;胃的食管部黏膜水腫和非出血性潰瘍;回腸和結(jié)腸段腸壁變薄,盲腸和結(jié)腸黏膜充血和出血。另外,經(jīng)常見到由繼發(fā)感染引起的胸膜炎、腹膜炎、心包炎(心包膜內(nèi)有大量炎性滲出物)和關(guān)節(jié)炎。當(dāng)發(fā)現(xiàn)豬全身淋巴結(jié)腫大,肺退化不全或形成固化、致密病灶時(shí),應(yīng)懷疑為PCV-2感染。如病理組織學(xué)檢查可見全身淋巴組織的淋巴細(xì)胞減少,單核巨噬細(xì)胞浸潤及形成多核巨細(xì)胞,并在這些細(xì)胞中觀察到嗜堿性或兩性染色的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)包涵體,則基本可以確診。3豬圓形感染的實(shí)驗(yàn)室診斷3.1超微結(jié)構(gòu)的觀察利用電鏡技術(shù)可以直觀、準(zhǔn)確的鑒別病毒,根據(jù)病毒本身所具有的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和大小等不同特征,可即刻做出診斷。Stevenson首次在透射電鏡下對(duì)被PCV-2持續(xù)感染的PK-15細(xì)胞內(nèi)的PCV-2進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察,并詳細(xì)描述了在細(xì)胞的細(xì)胞漿與細(xì)胞核內(nèi)的病毒包涵體及病毒粒子的形態(tài)。郎洪武從發(fā)病豬的脾臟和淋巴結(jié)組織的超薄切片中觀察到了大量直徑17nm、圓形、無囊膜的PCV病毒粒子。3.2家兔的免疫鑒定Sorden等采用純化的PCV-2抗原免疫兔子,得到兔抗PCV-2高免血清。利用此高免血清結(jié)合福爾馬林固定石蠟包埋組織中的PCV-2抗原,再采用生物素標(biāo)記的抗兔二抗與兔血清結(jié)合,最后用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素染色。他們應(yīng)用此法發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞內(nèi)存在大量濃染的圓形結(jié)構(gòu),大小和形狀與包涵體相似。Chianini等也用兔抗PCV-2的陽性血清建立了免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)檢測(cè)技術(shù)。Magar等為了克服內(nèi)源性過氧化物酶對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,將過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體改用免疫膠體銀標(biāo)記,取得了更好的檢測(cè)效果。3.3接種免疫熒光檢測(cè)pcv免疫熒光技術(shù)(immunofluorescenceassay,IFA)可用于PCV的抗體檢測(cè)及抗原組織定位的研究。Allan利用接免疫熒光來檢測(cè)PCV,就是將組織病料以蓋玻片在PK-15細(xì)胞中培養(yǎng),丙酮固定,用兔抗PCV高免血清與細(xì)胞培養(yǎng)物中的PCV反應(yīng),可對(duì)PCV進(jìn)行檢測(cè)和分型。崔尚金等將接種PCV-2且經(jīng)多次傳代的PK-15細(xì)胞分散到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,制成抗原診斷板,檢測(cè)血清中PCV-2的抗體?，F(xiàn)在一般認(rèn)為IFA是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)PCV-2的一種快速、靈敏、成本低的方法,但操作上較復(fù)雜,不宜作為臨床快速診斷。3.4elisa檢測(cè)和基因原核表達(dá)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)可以檢測(cè)抗體,也可以檢測(cè)抗原,具有靈敏、簡(jiǎn)單、快捷的特點(diǎn)。采用Walker等的競(jìng)爭(zhēng)ELISA來檢測(cè)PCV-2抗體,此法的檢出率為99.58%。Allan等也利用單抗建立了抗原捕獲ELISA來檢測(cè)PCV-2特異性抗體。琚春梅等利用PCV-2-ORF2基因原核表達(dá)產(chǎn)物建立了ELISA檢測(cè)方法。崔尚金等以重組桿狀病毒表達(dá)PCV衣殼蛋白作為ELISA抗原,提高了HRP標(biāo)記的二抗的稀釋倍數(shù),降低了背景的非特異性。林彥星等應(yīng)用原核表達(dá)的PCV-2Cap蛋白建立了間接ELISA。張曉勇等利用巴斯德畢赤酵母高效表達(dá)PCV-2-ORF2基因編碼蛋白建立了ELISA。3.5檢測(cè)抗體的方法Dulac等首先報(bào)道了免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(Immunoperoxidasemonolayerassay,IPMA),方法是將生長有PCV的PK-15細(xì)胞在96孔板上長成單層后檢測(cè)血清中的抗體。劉長明等在優(yōu)化IPMA檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上,研制出一種新的IPMA抗體檢測(cè)試劑盒,用于豬血清中PCV-2抗體檢測(cè),具有特異、敏感、操作簡(jiǎn)便、實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)。3.6膠體金標(biāo)記物作免疫快速檢測(cè)劑免疫膠體金技術(shù)(immunecolloidalgoldtechnique,ICGT)產(chǎn)生于20世紀(jì)60年代,最先用作電鏡的示蹤標(biāo)記物,1971年Faulk將膠體金引入免疫化學(xué)后發(fā)展成為一種新的免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)。其原理是以微孔濾膜為載體,以紅色膠體金為標(biāo)記物,通過滲濾而逐步反應(yīng),整個(gè)過程3min~5min即可完成。王慧杰等通過對(duì)Cap蛋白基因的羧基端進(jìn)行克隆和表達(dá)研究,結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù),建立了PCV-2Cap抗體膠體金診斷體系。3.7多重pcr檢測(cè)聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechainreaction,PCR)是一種快速、簡(jiǎn)便、特異的診斷方法,可直接檢測(cè)病毒核酸。目前已報(bào)道的PCR方法有很多,常用的有套式PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)定量PCR等。3.7.1常規(guī)PCRMorozov從PCV-PK-15DNA鏈上設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng),可直接檢測(cè)組織病料及其細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒核酸。Liu等建立了用競(jìng)爭(zhēng)PCR方法以檢測(cè)仔豬血清中的PCV病毒DNA。3.7.2多重PCR(MultiplexPCR)Larochelle等建立了多重PCR方法來檢測(cè)和區(qū)分PCV-1和PCV-2。LeeCS等建立了可以檢測(cè)和區(qū)分PCV、PRV和PCMV的多重PCR,并具有較高的靈敏度。GiammarioliM等建立了熱啟動(dòng)多重PCR,可以同時(shí)檢測(cè)ASFV、PRRSV、CSFV、PCV-2、PPV。崔尚金等建立的檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的多重PCR方法可以同時(shí)區(qū)分PCV-1和PCV-2。3.7.3套式PCR(Nested-PCR)Wijit等用套式PCR來檢測(cè)PCV-2。Celera等通過設(shè)計(jì)3個(gè)寡核苷酸引物進(jìn)行半套式PCR來檢測(cè)PCV-2的DNA,并證實(shí)該方法是特異的。Kim等建立了檢測(cè)和區(qū)分PCV-1和PCV-2的多重套式PCR方法。KimJ等運(yùn)用多重套式PCR來同時(shí)檢測(cè)PCV-1、PCV-2及PPV。呂艷麗等設(shè)計(jì)合成了PCV-2特異性引物和PCV通用引物,建立了能夠區(qū)分PCV-1和PCV-2的檢測(cè)方法。3.7.4實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timequantitativePCR)與普通PCR相比,實(shí)時(shí)定量PCR特異性和靈敏度都更高一些,而且便于觀測(cè),能實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過程。BrunborgIM等建立了以TaqMan為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)定量PCR方法,用于血清、血漿及組織樣品中的PCV-2的定量檢測(cè)。ChungWB等也建立了實(shí)時(shí)定量PCR方法用于PRRSVcDNA和PCV-2DNA的定量檢測(cè)。羅玉均等建立了TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,檢測(cè)PCV-2。YangZZ等利用SYBRGreenI建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PCV-2,80個(gè)樣品中PCV-2陽性為68個(gè),而用常規(guī)PCR方法只能檢測(cè)出56個(gè)。3.7.5PCR-限制性長度多態(tài)性(RFLP)分析方法Hamel等借助于RFLP建立了可以分型的PCR診斷方法,很容易檢測(cè)PCV-1和PCV-2。Fenaux等根據(jù)已有的PCV株的基因序列,建立了通用的PCR-RFLP分析方法,該方法不但可以用于PCV-2的致病性研究,而且可以用來檢測(cè)來自不同地理區(qū)域的PCV-2的感染情況。王新等借助RFLP方法,對(duì)PK-15細(xì)胞、IBRS-2細(xì)胞以及疑似豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎炎綜合征(PDNS)的病料進(jìn)行了PCV檢測(cè)以及血清型的鑒定。3.8正、負(fù)鏈探針檢測(cè)ChoiC等用地高辛標(biāo)記的探針做原位雜交檢測(cè)PCV,研究PCV-2和豬細(xì)小病毒在豬體內(nèi)的分布狀況。NawagitgulP等根據(jù)PCV的基因序列,設(shè)計(jì)了一組探針,包括ORF1及ORF2的正、負(fù)鏈探針,可鑒別PCV-1和PCV-2兩種基因型。Sirinarumitr等應(yīng)用快速加強(qiáng)雜交(rateenhancementhybridization,REH),僅用7h~8h,比傳統(tǒng)的雜交方法(用時(shí)2d)檢測(cè)時(shí)間大大縮短,更適用于對(duì)PCV-2的診斷。Sirinarumitr等建立了雙雜交方法同時(shí)檢測(cè)豬PRRSV和PCV,而且可確定這兩種病毒是否共同感染同一細(xì)胞。姚鑫等利用地高辛標(biāo)記的核酸探針建立了直接從組織中檢測(cè)和定位PCV-2的原位雜交檢測(cè)方法。3.9項(xiàng)高新技術(shù)dna芯片檢測(cè)基因芯片技術(shù)是近年來分子生物學(xué)與微電子學(xué)等多學(xué)科交叉融合而成的一項(xiàng)高新技術(shù)DNA芯片技術(shù)檢測(cè)疾病具有高通量、并行性和結(jié)果判讀客觀、準(zhǔn)確和信息化的特點(diǎn)。肖馳等建立了CSF-PRRS-PCV2診斷DNA芯片,能同時(shí)檢測(cè)PR