梅花名方梅花冬蟲夏草的體外抗菌活性研究

梅花名方梅花冬蟲夏草的體外抗菌活性研究

梅西泮是自然的右旋龍腦（d-bon）。常用的名字有龍腦、婆羅洲、正面梅、機(jī)器片、龍眼香等。它是一種名貴的中藥材和辛香料,為龍腦香科植物龍腦香樹脂中析出的天然結(jié)晶化合物,如砍取其樹干及枝條,切碎,經(jīng)高壓蒸餾、冷卻后而凝成的結(jié)晶物為白色半透明粉末狀結(jié)晶,氣清香,味辛、苦,性涼,具揮發(fā)性和開竅消炎止痛癢的功效。龍腦香科植物適應(yīng)在熱帶雨林地區(qū)生長,分布于南洋群島,廣東省韶關(guān)地區(qū)也有梅花冰片樹的栽種,并有專門進(jìn)行梅花冰片提取的加工工藝廠家。從梅花冰片的物理性質(zhì)可以知道,其具有升華的物性,因此不少名貴中成藥將梅花冰片作為主要藥物成分之一,如冰硼散、六神丸、牛黃解毒丸等,其功效主治:開竅醒目,清熱止痛,明目退翳。內(nèi)治用于熱病神昏、痙厥、中風(fēng)痰厥、中風(fēng)昏迷,外用治目赤、口瘡、咽喉腫痛、耳道流膿。其抗菌功能有少量報(bào)道,但無藥敏的定量報(bào)道。因此,我們選用梅花冰片作為主要的研究對(duì)象,并對(duì)其3種常見劑型(油劑、粉劑和水劑)的體外抗菌活性進(jìn)行了初步研究比較,現(xiàn)報(bào)告如下:1實(shí)驗(yàn)材料1.1藥品、藥劑與水劑梅花冰片生藥產(chǎn)于廣東省韶關(guān)市乳源瑤族自治區(qū)工業(yè)園,梅花冰片油劑由韶源科技開發(fā)有限公司乳源芳香油精煉廠出品,藥品:神應(yīng)油噴霧劑,批號(hào)20001210,經(jīng)廣東省藥品檢驗(yàn)所檢測合格(藥品檢驗(yàn)報(bào)告書編號(hào)20010435)。粉劑由韶關(guān)市中醫(yī)院提供。梅花冰片水劑由韶關(guān)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備,制備方法以40g生藥與400mL95%乙醇的比例配合,采用乙醇回流提取法獲得。把梅花冰片的粉劑和水劑用肉湯培養(yǎng)基稀釋成1∶10的濃度,以此作為原液,油劑以神應(yīng)油噴霧劑用乙醚稀釋成1∶10,采用0.08mPa的蒸汽壓,1000℃的溫度滅菌15分鐘備用。1.2受試菌種質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923、大腸埃希氏菌(E.coli)ATCC25922來源于中國藥品生物制品檢定所。臨床分離的金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色葡萄球菌(S.albus)、福氏痢疾桿菌(S.sonnei)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、耐藥金黃色葡萄球菌(resistanceofStaphylococcusaureus)、傷寒沙門菌(S.typhi)、甲型副傷寒沙門菌(S.paratyphiA)、乙型副傷寒沙門菌(S.paratyphiB)、丙型副傷寒沙門菌(S.paratyphiC)、普通變形桿菌(P.vulgaris)、大腸埃希氏菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)12種受試菌菌種,來源于粵北人民醫(yī)院和韶關(guān)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科。將液氮保存的質(zhì)控菌株和臨床分離的實(shí)驗(yàn)菌株復(fù)活后,分別挑選長勢較好的受試菌接種到肉湯培養(yǎng)基,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24小時(shí),取適量的菌懸液用肉湯稀釋1000倍,以平板活菌計(jì)數(shù)法定量其菌液濃度為106CFU/mL,用于平板打孔藥敏試驗(yàn)和MIC的測定。1.3平板鉆孔藥敏試驗(yàn)組水解酪蛋白瓊脂(Mueller-Hinton培養(yǎng)基):用于平板打孔藥敏試驗(yàn)。肉湯培養(yǎng)基:用于受試菌的稀釋。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:由杭州生物試劑廠生產(chǎn),批號(hào)010408,用于微量瓊脂倍比稀釋法測定MIC。1.4ab水套式2d培養(yǎng)箱、sa-j-2fd超凈工作臺(tái)恒溫培養(yǎng)箱(上海醫(yī)用儀器設(shè)備二廠產(chǎn)品),美國SHELLAB水套式CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)2306-2),SA-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品),高壓蒸氣滅菌器(上海核子醫(yī)用儀器廠產(chǎn)品),光學(xué)顯微鏡油鏡等。2方法和結(jié)果2.1篩選對(duì)印花表型的敏感細(xì)菌本次實(shí)驗(yàn)分兩步進(jìn)行,第一步用平板打孔藥敏法進(jìn)行初篩,即從受試的12種菌中挑選出對(duì)梅花冰片藥液敏感的細(xì)菌。然后將初篩中明顯受梅花冰片藥液抑制的受試菌進(jìn)一步細(xì)篩,即用微量瓊脂倍比稀釋法測定其MIC。2.1.1培養(yǎng)織物在直徑9cm滅菌培養(yǎng)皿中加入19mL已融化冷卻至50℃的Mueller-Hinton培養(yǎng)基,如此制備14(受試菌數(shù))×3(梅花冰片劑型數(shù))×3(實(shí)驗(yàn)平行做3組)共126個(gè)培養(yǎng)基平皿,立即旋轉(zhuǎn)混勻。待瓊脂凝固后,取106CFU/mL的菌懸液均勻的涂布到培養(yǎng)基上,用外徑6mm的滅菌打孔器在培養(yǎng)基上打4個(gè)等距離的孔,注意不要打穿,以免漏液。用微量加樣器分別吸取50μL各種劑型的梅花冰片原液加入孔內(nèi),一孔作空白對(duì)照。立即置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。量取抑菌圈的直徑,以3次平均值為該劑型的抑菌圈直徑。2.1.2最低抑菌濃度測定將平板打孔藥敏實(shí)驗(yàn)中明顯受梅花冰片藥液抑制的受試菌挑選出來,采用微量瓊脂對(duì)倍稀釋法測定其MIC。其具體操作是:在96孔聚乙烯板上,用80℃加熱融化營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液,將藥液稀釋至10～0.1562mg/mL,用微量加樣器加受試菌液(106CFU/mL)5μL于每一個(gè)培養(yǎng)基孔中,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí),以不長菌落的最高藥物稀釋度為該藥液對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC),平行做3次實(shí)驗(yàn),以2次或3次相同結(jié)果為準(zhǔn)。根據(jù)受試菌的MIC,利用回歸方程求的MIC50、MIC90。結(jié)果梅花冰片藥液的3種劑型對(duì)金黃色葡萄球菌、耐藥金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌具有良好的抑菌作用。2.2抗菌活性研究在受試的14種常見致病菌的標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株中,對(duì)梅花冰片藥液敏感的有金黃色葡萄球菌、耐藥金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌,抑菌效果隨著藥物濃度的降低而降低,抑菌圈直徑≥3.25mm,梅花冰片對(duì)其它受試菌藥敏不明顯。初篩后進(jìn)一步研究梅花冰片不同劑型對(duì)金黃色葡萄球菌、耐藥金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌的MIC,結(jié)果是梅花冰片油劑的抗菌活性最好,其次是粉劑和水劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、2。3玫瑰花冰激凌的抗菌性能經(jīng)現(xiàn)代化學(xué)實(shí)驗(yàn)研究證明:梅花冰片主含天然右旋龍腦,同時(shí)含有β-欖香烯、石竹烯等倍半萜及齊墩果酸、麥珠子酸、積雪草酸、龍腦香醇酮、龍腦香二醇酮、古柯二醇等三萜化合物。其抗菌機(jī)理是通過使細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖層增厚、有空泡,藥物可能透過細(xì)胞壁作用于菌體細(xì)胞膜,改變膜的通透性,使藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),作用于線粒體膜上,使其受到損傷,從而達(dá)到抗菌的目的。實(shí)驗(yàn)證明梅花冰片對(duì)金黃色、白色葡萄球菌有明顯的抗菌作用。金黃色、白色葡萄球菌為革蘭氏染色陽性球菌,它在自然界中無處不在,是人類化膿性感染中最常見的病原菌,在自然界具有較強(qiáng)的抵抗力,特別是對(duì)熱的抵抗力僅次于芽孢菌,而金黃色葡萄球菌又是對(duì)抗生素耐藥率發(fā)生頻率最高的細(xì)菌之一,而一旦產(chǎn)生耐藥性,臨床治療非常棘手。因此,在“崇尚綠色,回歸自然”的今天,梅花冰片作為名貴中成藥具有升華作用的主要藥物成分,其抗菌效能亦起到了關(guān)鍵的協(xié)同作用。目前中草藥抗菌效能因其毒副作用小、菌株耐藥性頻率低、應(yīng)用前景廣泛而越來越受到人們的關(guān)注和青睞。目前,還沒有梅花冰片對(duì)臨床常見細(xì)菌藥敏定量實(shí)驗(yàn)的相關(guān)報(bào)道。本次實(shí)驗(yàn)選用梅花冰片作為主要的研究對(duì)象,并對(duì)其3種常見劑型的抗菌效能進(jìn)