貴州和海南艾納香藥材質(zhì)量比較研究

貴州和海南艾納香藥材質(zhì)量比較研究

愛(ài)納香[l.c.]是艾納香科的一種多年生木蘭或亞灌木，也被稱(chēng)為愛(ài)蘭姆風(fēng)艾和愛(ài)蘭姆亞麻布。主要藥物為全草或土壤材料，產(chǎn)于貴州、廣東、海南等地。艾納香主要的藥效成分包括揮發(fā)油和黃酮類(lèi)等,是影響艾納香質(zhì)量?jī)?yōu)劣的主要因素。揮發(fā)油主要成分為左旋龍腦,具有抗菌、消炎、消腫、止痛等作用,黃酮類(lèi)成分包括艾納香素、二氫黃酮醇等,具有抗感染、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用。不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量間存在差異,其化學(xué)成分種類(lèi)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)不盡相同。中藥材的功效講究來(lái)源的道地性,即中藥材必須在一定的地理環(huán)境下才能優(yōu)質(zhì)生長(zhǎng)、保證療效,因此探討不同產(chǎn)地的中藥材質(zhì)量差異對(duì)于指導(dǎo)臨床用藥具有重要現(xiàn)實(shí)意義。就艾納香而言,目前研究主要集中于揮發(fā)油類(lèi)和黃酮類(lèi)化學(xué)成分的分析、藥理作用及艾納香油指紋圖譜建立等方面。有關(guān)不同產(chǎn)地艾納香化學(xué)成分差異分析的報(bào)道較少,未見(jiàn)涉及海南和貴州產(chǎn)區(qū)艾納香化學(xué)成分比較研究的報(bào)道。本研究在建立左旋龍腦和總黃酮測(cè)定方法的基礎(chǔ)上,分析貴州和海南2個(gè)主產(chǎn)區(qū)及不同居群間(居群指同一時(shí)間里同一區(qū)域內(nèi)同一物種的集合,本文主要指在同一個(gè)縣所采集的樣品)艾納香中左旋龍腦、總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異,進(jìn)一步比較2個(gè)產(chǎn)區(qū)的藥材質(zhì)量,為艾納香藥材種植、提取加工及相關(guān)生產(chǎn)實(shí)踐提供依據(jù)。1儀器、試劑和儀器7890A氣相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司,包括FID氫火焰離子化檢測(cè)器、G4513A16位自動(dòng)進(jìn)樣器),SartariusCPA225D電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司],KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),UNICO2012-PCS紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)[尤尼柯(上海)儀器有限公司]。左旋龍腦對(duì)照品(阿法埃莎化學(xué)有限公司,批號(hào):10147015,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%),蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):100080-200707,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92.5%),水楊酸甲酯(分析純,天津光復(fù)精細(xì)化工研究所,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.5%),其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純,H2O為蒸餾水。試驗(yàn)材料均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所龐玉新副研究員鑒定為菊科艾納香屬植物艾納香[Blumeabalsamifera(L.)DC.]的功能葉片。詳見(jiàn)表1。2方法和結(jié)果2.1gc法測(cè)定易納香中左岸龍腦的質(zhì)量比2.1.1fid檢測(cè)條件HP-5石英毛細(xì)管色譜柱(0.32mm×30m,0.25μm);以80℃為起始溫度,保持2min;以5℃/min升溫至100℃,再以20℃/min升溫至200℃;進(jìn)樣口溫度為220℃;FID檢測(cè)器,檢測(cè)器溫度為240℃;進(jìn)樣量為0.6μL,分流比為9∶1。按上述條件測(cè)定,水楊酸甲酯+左旋龍腦對(duì)照品、艾納香供試品溶液的氣相色譜圖見(jiàn)圖1。2.1.2左旋龍腦對(duì)照品溶液精密稱(chēng)取左旋龍腦對(duì)照品100.00mg,置100mL容量瓶中,加乙酸乙酯定容,搖勻,即得質(zhì)量濃度為1.0317mg/mL的左旋龍腦對(duì)照品溶液。2.1.3內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱(chēng)取水楊酸甲酯250.00mg,置250mL容量瓶中,加乙酸乙酯定容,搖勻,即得質(zhì)量濃度為1.0144mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。2.1.4超聲提取工藝取艾納香葉片粉末(過(guò)20目篩)2g,精密稱(chēng)定,置于50mL具塞三角瓶中,加入乙酸乙酯25mL,稱(chēng)定質(zhì)量,在頻率40kHz、功率400W的條件下超聲提取30min。放冷,稱(chēng)定質(zhì)量,用乙酸乙酯補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取1mL續(xù)濾液至10mL容量瓶中,加入內(nèi)標(biāo)溶液1mL,用乙酸乙酯定容,搖勻,即得。2.1.5對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mL,置于10mL容量瓶中,精密加入“2.1.3”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)溶液1.0mL,再加入乙酸乙酯定容至刻度,搖勻,即得混合對(duì)照品溶液。精密吸取0.6μL,按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以左旋龍腦質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),對(duì)照品左旋龍腦與內(nèi)標(biāo)物水楊酸甲酯的峰面積比為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程:Y=14.823X+0.0129,r=0.9999,線性范圍為10.371~207.428μg/mL。2.1.6取貴州興義市采集的艾納香藥材,約2g,精密稱(chēng)定,按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次,記錄色譜圖。計(jì)算得左旋龍腦與水楊酸甲酯峰面積比的RSD值為2.1%,表明本方法精密度良好。2.1.7供試品溶液制備分別取貴州興義市采集的艾納香藥材5份,每份約2g,精密稱(chēng)定,按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果測(cè)得左旋龍腦質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值為3%,表明方法重復(fù)性良好。2.1.8測(cè)定項(xiàng)目的測(cè)定取貴州興義市采集的艾納香藥材1份,約2g,精密稱(chēng)定,按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,于室溫下放置,分別于0、2、4、8、12、24h依法測(cè)定。結(jié)果左旋龍腦與內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)峰面積比的RSD為0.49%,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.1.9精密稱(chēng)定量取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的艾納香葉片粉末(過(guò)20目篩)1g,精密稱(chēng)定,共6份。分別加入左旋龍腦對(duì)照品約5mg,按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表2。2.1.1含量測(cè)定結(jié)果取表1中各艾納香藥材,各2g,精密稱(chēng)定,按照“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,根據(jù)線性回歸方程計(jì)算各產(chǎn)地艾納香中左旋龍腦的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可知,海南白沙的艾納香中左旋龍腦質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,為6.99mg/g;貴州望謨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低,為3.86mg/g,不同居群間左旋龍腦質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,貴州與海南2個(gè)產(chǎn)區(qū)間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2用紫外分光光度法測(cè)定了艾納香中總黃酮的質(zhì)量比2.2.1alno3溶液配制稱(chēng)取NaNO225g,用H2O定容至500mL,配成5%(質(zhì)量濃度,下同)的NaNO2溶液,備用;稱(chēng)取Al(NO3)3·9H2O88g,用H2O定容至500mL,配成10%(質(zhì)量濃度,下同)的Al(NO3)3溶液,備用;稱(chēng)取NaOH20g,用H2O定容至500mL,配成4%(質(zhì)量濃度,下同)的NaOH溶液,備用。2.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取于105℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品12.00mg,置于50mL容量瓶中,加適量75%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇,置水浴鍋上微熱溶解,放冷,加75%乙醇定容,搖勻,即得質(zhì)量濃度為0.2359mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。2.2.3超聲提取工藝稱(chēng)取艾納香藥材粉末(過(guò)20目)0.5g,至具塞錐形瓶中,加75%乙醇溶液25mL,稱(chēng)定質(zhì)量,在頻率40kHz、功率400W下超聲提取40min,放冷。稱(chēng)定質(zhì)量,用75%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),即得。2.2.4加nano2溶液、alno33溶液分別精密量取對(duì)照品溶液2.00mL、供試品溶液0.50mL,分別置于25mL容量瓶中,各加75%乙醇至10mL。分別加5%NaNO2溶液1mL,搖勻,放置5min;再分別加10%Al(NO3)3溶液1mL,搖勻,放置5min;加4%NaOH溶液10mL,最后加入75%乙醇至刻度,搖勻,放置15min。以相應(yīng)的試劑溶液為空白,在300~999nm波長(zhǎng)間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,選擇最適測(cè)試波長(zhǎng)為509nm。吸收曲線如圖2所示。2.2.5l容量瓶吸光度測(cè)定精密量取蘆丁對(duì)照品溶液1.00、2.00、4.00、6.00、8.00mL,分別置于25mL容量瓶中,按“2.2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色反應(yīng),以相應(yīng)的試劑溶液為空白對(duì)照,在509nm處測(cè)定吸光度A。以對(duì)照品質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程為A=12.847ρ+0.0093,r=1,線性范圍為9.176~73.408μg/mL。2.2.6方法精密度試驗(yàn)取質(zhì)量濃度為0.2359mg/mL的對(duì)照品溶液2mL,置于25mL容量瓶中,按“2.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定吸收值,連續(xù)測(cè)定6次,吸光度值的RSD值為1.05%,表明方法精密度良好。2.2.7測(cè)定項(xiàng)目及程序取同一供試品溶液,置于25mL容量瓶中,按“2.2.4”項(xiàng)下方法操作,每隔10min測(cè)定其吸光度,共計(jì)60min。結(jié)果溶液在顯色后40min內(nèi)吸光度值的RSD值為1.89%,表明供試品溶液在40min內(nèi)較穩(wěn)定。2.2.8總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定分別取同一批艾納香藥材6份,每份0.5g,精密稱(chēng)定,按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,取供試品溶液0.5mL,按“2.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定并計(jì)算總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果測(cè)得總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值為3.8%,表明方法重復(fù)性良好。2.2.9精密稱(chēng)定,u3000結(jié)取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的艾納香葉片粉末(過(guò)20目篩)0.25g,精密稱(chēng)定,共6份。分別加入蘆丁對(duì)照品約30mg,按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,取供試品溶液0.5mL,按“2.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定并計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表4。2.2.1e-la-c、c取表1中各艾納香藥材適量,按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定各供試品溶液的吸光度,計(jì)算各產(chǎn)地艾納香中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見(jiàn)表5。從表5可知,海南儋州的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)超過(guò)其他居群,為127.29mg/g,是質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低的貴州望謨產(chǎn)艾納香(11.48mg/g)的11.09倍,貴州羅甸產(chǎn)艾納香質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.64mg/g,位列第2位,不同居群間質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但海南、貴州2個(gè)產(chǎn)區(qū)間質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3不同產(chǎn)地艾納香揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的統(tǒng)計(jì)分析夏稷子等研究表明,選擇水楊酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)物,不僅保留時(shí)間與左旋龍腦接近,分離度也很好,因此本研究選擇了水楊酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)物。本研究對(duì)貴州和海南2大產(chǎn)區(qū)的艾納香中左旋龍腦和總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行比較。結(jié)果表明,海南白沙樣品中左旋龍腦質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,海南瓊中產(chǎn)位居第2,但方差分析顯示,各居群間左旋龍腦質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。海南儋州樣品總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,為最低的貴州望謨產(chǎn)樣品的11.09倍,各居群間總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但海南和貴州2個(gè)產(chǎn)區(qū)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。羅夫來(lái)等研究表明,不同居群貴州產(chǎn)艾納香的揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。夏稷子等研究表明,不同產(chǎn)地間的艾納香揮發(fā)性成分種類(lèi)上差異不大,但成分比例和質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大。由于艾納香中揮發(fā)性成分受種質(zhì)、生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)發(fā)育階段等因素影響較大,上述結(jié)果的差異