堆肥用木質(zhì)纖維素降解菌篩選技術(shù)規(guī)程

DB13/Txxx—2020PAGE1堆肥用木質(zhì)纖維素降解菌篩選技術(shù)規(guī)程1范圍本標準規(guī)定了堆肥用木質(zhì)纖維素降解菌菌株篩選的樣品采集、培養(yǎng)基配制、富集培養(yǎng)、菌株分離、初篩、復(fù)篩、菌株綜合鑒定，以及篩選菌株的保藏技術(shù)等。本標準適用于農(nóng)林牧及加工業(yè)的有機廢棄物堆肥、農(nóng)作物秸稈還田，及其它行業(yè)和生活垃圾的有機廢物中木質(zhì)纖維素降解與資源化利用領(lǐng)域。本標準不適用于厭氧發(fā)酵和其他材料及形式的處理與利用。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489-2008實驗室生物安全通用要求GB7959-87糞便無害化衛(wèi)生標準GB/T25246-2010畜禽糞便還田技術(shù)規(guī)范GB/T25169-2010畜禽糞便監(jiān)測技術(shù)規(guī)范GB/T26622-2011畜禽糞便農(nóng)田利用環(huán)境影響評價準則NY884-2012 生物有機肥GB4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》GB15618-2018土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風險管控標準GB/T36195-2018畜禽糞便無害化處理技術(shù)規(guī)范HJ497畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染治理工程技術(shù)規(guī)范NY/T1168畜禽糞便無害化處理技術(shù)規(guī)范NY/T3442-2019畜禽糞便堆肥技術(shù)規(guī)范NY/T3441-2019蔬菜廢棄物高溫堆肥無害化處理技術(shù)規(guī)程HJ1088-2020排污單位自行監(jiān)測技術(shù)指南磷肥、鉀肥、復(fù)混肥料、有機肥料和微生物肥料NY/T525-2021有機肥料3縮略語下列縮略語適用于本文件。TSA：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基；TSB：胰蛋白胨大豆液體培養(yǎng)基；GSM：高斯氏合成培養(yǎng)基；GGSM：改良高斯氏合成培養(yǎng)基；PDA：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；PDB：馬鈴薯葡萄糖液態(tài)培養(yǎng)基；CMC-Na：羧甲基纖維素鈉；DNA：脫氧核糖核酸；rDNA：核糖體DNA；ITS：內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)；PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)；CMCase：羧甲基纖維素酶；FPA：濾紙酶；Lip：木質(zhì)素過氧化物酶；Mnp：錳過氧化物酶；Lac：漆酶；PBS：磷酸緩沖液；ABTS：2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸。4菌株篩選包括樣品采集、各種篩選培養(yǎng)基制備、木質(zhì)纖維素降解菌的富集與分離、菌株初篩與復(fù)篩。4.1樣品采集從養(yǎng)殖場、有機肥廠、菌菇廠、垃圾填埋場、污水處理廠、林地和農(nóng)田等采集發(fā)酵過程中的糞便、堆肥、菌菇發(fā)酵料、活性污泥以及林下腐殖土和耕層土壤等樣品，將樣品按類別、采樣點和采樣時間做好標記，當天帶回實驗室，在24h內(nèi)進行富集或分離培養(yǎng)。4.2篩選培養(yǎng)基配制木質(zhì)纖維素富集培養(yǎng)基：秸稈末（濾紙漿粉）5g，蛋白胨5g，NaCl5g，CaCO32g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，蒸餾水1000mL。TSA培養(yǎng)基：TSA粉30g，蒸餾水1000mL。TSB培養(yǎng)基：TSB粉30g，蒸餾水1000mL。GSM培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g，磷酸氫二鉀0.5g，氯化鈉0.5g，七水硫酸鎂0.5g，七水硫酸亞鐵0.01g，瓊脂20g，水1000mL，pH7.2~7.4。GGSM培養(yǎng)基：KNO31g，KH2PO40.5g，NaCl0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，可溶性淀粉20g，酵母膏1g，葡萄糖10g，蒸餾水1000mL，pH7.2-7.4。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL。PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。CMC剛果紅培養(yǎng)基：(NH4)2SO42.0g，MgSO4·7H2O0.5g，K2HPO41.0g，NaCl0.5g，CMC-Na2.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，pH7.0。另配制1mg/mL剛果紅染液和1mol/LNaCl溶液。木質(zhì)素苯胺藍培養(yǎng)基：(NH4)2SO42g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl0.5g/L，堿性木質(zhì)素5g/L，瓊脂粉22g/L，H2O950mL；苯胺藍粉末0.25g溶于50mL無菌水中，用一次性醫(yī)用注射器吸取苯胺藍染液，再裝上無菌過濾器注入滅菌后的培養(yǎng)基中趁熱于超凈臺中混合均勻。木質(zhì)素亮藍培養(yǎng)基：(NH4)2SO42g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl0.5g/L，堿性木質(zhì)素5g/L，亮藍0.25g，瓊脂粉22g/L，H2O1L。亮藍的除菌方法同苯胺藍。發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮50g，蛋白胨3g，(NH4)2SO43g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.3g，NaCl5g，水1000mL。濾紙條崩解培養(yǎng)基：KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.4g，(NH4)2SO43g，酵母粉0.1g，H2O1000mL。秸稈降解培養(yǎng)基：玉米秸稈粉2%，蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，(NH4)2SO40.4%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.05%，pH值7.2~7.4。上述培養(yǎng)基于121℃高壓滅菌30min，冷卻至55~60℃傾注平板備用。4.3富集培養(yǎng)稱取各類樣品各20g，充分打散混勻；稱取2份10g混合樣品，分別放入2個滅菌的含100mL木質(zhì)纖維素富集培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中，兩瓶分別于35℃和45℃、160r/min搖瓶48h。4.4分離純化將富集培養(yǎng)液搖勻，各取1.0mL懸液置于含9mL無菌水的離心管，搖勻后得10﹣1稀釋液，依此倍比稀釋至10﹣5稀釋液；分別從兩個溫度富集培養(yǎng)液及其系列稀釋液（100~10﹣5）中取100μL菌懸液，均勻涂布于細菌、放線菌、真菌分離培養(yǎng)基平板，每個稀釋度重復(fù)2次，將富集培養(yǎng)液的稀釋平板分別置于35℃和45℃條件下恒溫培養(yǎng)1~7d。在培養(yǎng)期間每天觀察菌落生長情況，并從適當稀釋平板上挑取不同形態(tài)單菌落，在新的分離培養(yǎng)基平板上劃線分離純化培養(yǎng)；重復(fù)以上操作至得純菌株。4.5初篩將分離純化的菌株分別接種于CMC剛果紅培養(yǎng)基、木質(zhì)素苯胺藍培養(yǎng)基、木質(zhì)素亮藍培養(yǎng)基上。每個平板接種一株菌，均勻分散點接三個點，兩個平行，35℃培養(yǎng)3d。在明亮背景下觀察、測量不同培養(yǎng)基上各菌落及其周圍透明圈的直徑大小，并計算同一菌株菌落直徑（d）、透明圈直徑（D）的平均值以及D/d的比值。剛果紅培養(yǎng)基上的透明圈需染色才能看到：將配制的剛果紅染液倒入平板中染色10~15min，倒去染液，加入NaCl溶液顯色15min即可。按菌株在初篩培養(yǎng)基上的菌落直徑、透明圈直徑、D/d值、透明圈清晰度對每個菌株進行積分，將同類菌株的積分進行比較，選擇積分較高的菌株進入復(fù)篩。4.6復(fù)篩4.6.1酶活測定將初篩入選菌株分別進行CMCase、FPA、Lip、Mnp和Lac酶活性測定。CMCase測定：采用3,5-二硝基水楊酸法測定內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶催化羧甲基纖維素鈉降解產(chǎn)生的還原糖的含量。Cx(μg/(min·mL))=1000×(ΔA+0.0673)÷6.4078×V總÷V樣÷T=14.305×(ΔA+0.0673)。FPA測定：濾紙酶水解濾紙產(chǎn)生的還原糖能與3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色氨基化合物，在540nm處有最大光吸收，在一定范圍內(nèi)反應(yīng)液顏色深淺與還原糖的量成正比，可測定計算濾紙酶的活力。FPA(U/ml)=(ΔA+0.0255)÷0.2805×V總÷V樣÷T=0.416×(ΔA+0.0255)。上述公式中，V總：反應(yīng)體系總體積(mL)；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積(mL)；T：反應(yīng)時間(min)；ΔA：測定組與對照組的吸光值差。Lip測定：采用木質(zhì)素過氧化物酶活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）檢測。木質(zhì)素過氧化物酶氧化藜蘆醇生成藜蘆醛在310nm處有特殊吸收峰。將菌株發(fā)酵培養(yǎng)液超聲波冰浴破碎菌體，然后10000g離心10min，取上清液100μL裝入2mL離心管中，放置于冰上待測。反應(yīng)體系含有1mM藜蘆醇，50mMpH7.2的磷酸緩沖液（PBS）和0.1mM過氧化氫，總體積1mL。超純水作為對照，分別測定310nm處反應(yīng)10S和310S的吸光值，分別記為A1和A2，ΔA=A2-A1。酶活性定義為每升培養(yǎng)液60S內(nèi)氧化1nmol藜蘆醇所需酶量為一個酶活力單位，藜蘆醛摩爾消光系數(shù)ε=9300L·mol-1·cm-1。計算公式如下：Lip(nmol·min-1·L-1)=ΔA÷(ε×d)×V總÷V樣÷TMnp測定：錳過氧化物酶也是一種含有亞鐵血紅素的氧化酶，在Mn2+存在的條件下將愈創(chuàng)木酚氧化為四鄰甲氧基連酚，在465nm處有特征吸收峰。使用木質(zhì)素錳過氧化物酶活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）進行測定。將發(fā)酵培養(yǎng)液10000g離心10min，取上清液作為粗酶液放置于冰上待測。反應(yīng)樣品100μL，底物反應(yīng)體系900μL，充分混勻反應(yīng)體系與樣品，在37℃反應(yīng)10min，于1mL玻璃比色皿中，蒸餾水調(diào)零，測定465nm處吸光值，計算與對照組差值ΔA。酶活性定義：每升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個酶活力單位。愈創(chuàng)木酚消光系數(shù)ε=12100L·mol-1·cm-1，計算公式如下：Mnp(nmol·min-1·L-1)=ΔA÷(ε×d)×V總÷V樣÷TLac測定：漆酶是含銅的多酚氧化酶，具有較強的氧化能力。使用漆酶活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）測定。漆酶分解ABTS產(chǎn)生ABTS自由基，在420nm處吸光系數(shù)遠大于ABTS，測定ABTS自由基增長率得到漆酶活性。離心后粗酶液0.1mL，加入反應(yīng)體系液0.6mL，對照組樣品煮沸后加入。樣品加入后在60℃水浴3min，測定其420nm處吸光值，計算與對照組的差值ΔA。ABTS消光系數(shù)ε=36L·mmol-1·cm-1。定義每毫升每分鐘氧化1nmol底物ABTS時所需的酶量為一個酶活單位。計算公式如下：Lac(U·L-1)=ΔA÷(ε×d)×V總÷V樣÷T上述公式中d：比色杯光徑；V總：反應(yīng)總體積；V樣：反應(yīng)中樣品體積；T：反應(yīng)時間。4.6.2秸稈降解率測定將玉米秸稈粉碎后于105℃烘干至恒重，配制秸稈降解培養(yǎng)基備用。將初篩入選菌株接種于相應(yīng)種子培養(yǎng)基（TSB、GGSM、PDB），在35℃、150r/min搖瓶培養(yǎng)24~72h；取菌懸液按2%接種率接種到裝有150mL秸稈降解培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，35℃搖床培養(yǎng)5d。培養(yǎng)結(jié)束后，在錐形瓶中加入裝液量20%的中性洗滌劑（3%十二烷基硫酸鈉），煮沸10min以便除去可溶性物質(zhì)。將培養(yǎng)液用質(zhì)量恒定（m0）濾紙進行過濾，經(jīng)蒸餾水沖洗過濾后，將濾紙和濾渣置于105℃烘箱中干燥至恒重（m2）。質(zhì)量恒定后的m2?m0即為降解剩余物質(zhì)量m1。玉米秸稈木質(zhì)纖維素降解率Y計算公式為：Y=(m-m1)/m×100%公式中m：培養(yǎng)基中初始玉米秸稈的質(zhì)量（g）。將復(fù)篩菌株的CMCase、FPA、Lip、Mnp和Lac酶活性值和秸稈降解率進行積分，比較同類菌株間復(fù)篩積分高低，并結(jié)合初篩結(jié)果對復(fù)篩菌株進行取舍。5菌株的綜合鑒定包括形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。參照GB19489-2008實驗室生物安全通用要求的相關(guān)條款。5.1菌株形態(tài)特征將復(fù)篩入選菌株以平板劃線的方法接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，24～72h后觀察各菌株在平板上的菌落形態(tài)特征；挑取菌體進行涂片染色，細菌用革蘭氏染色法，放線菌用結(jié)晶紫染色，真菌用苯胺藍染色，鏡檢觀察菌體顯微形態(tài)特征，結(jié)合菌株的典型菌落形態(tài)和菌體形態(tài)特征進行初步鑒別。5.2菌株的分子生物學(xué)鑒定5.2.1基因組DNA提取細菌、放線菌DNA的提?。簩?mL的TSB液體培養(yǎng)基放入2mL的EP管中，用接種環(huán)挑取純化完成的單個菌落放入其中，35℃，160r/min培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)好的菌液12000r/min離心5min，棄上清；加入1mL無菌水，震蕩混勻，12000r/min離心3min后棄上清，重復(fù)2次。加入30-50μL的無菌水，震蕩混勻，98℃水浴，細菌水浴15min，放線菌水浴35min。水浴完成后，12000r/min離心2min，上清液即為提取的細菌DNA，取上清移入新的EP管中，-20℃保存?zhèn)溆?。真菌DNA的提?。赫婢腄NA提取采用北京索萊寶生物科技有限公司的真菌試劑盒，按說明書指導(dǎo)方法進行提取。5.2.2引物合成細菌和放線菌采用16SrDNA通用引物，真菌采用真核生物rDNA的ITS序列通用引物，引物由華大基因公司合成，引物序列如下表：表1引物序列菌株上下游引物細菌上游引物：5’-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3’下游引物：5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’真菌上游引物ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’下游引物ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’放線菌上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’下游引物1492R：5’-GGTTAC