黃磷亞砷酸鈉亞急性肝損害大鼠肝臟酶組織化學(xué)定量Ⅰ線粒體標(biāo)志酶變化

黃磷亞砷酸鈉亞急性肝損害大鼠肝臟酶組織化學(xué)定量Ⅰ線粒體標(biāo)志酶變化

關(guān)鍵詞：黃磷；亞砷酸鈉；毒性；肝疾病；組織細(xì)胞化學(xué)；酶學(xué)；疾病模型，動物；大鼠

在中毒性肝損害中線粒體作為毒物作用的“靶細(xì)胞器”，對各種毒物非常敏感，其生化功能首先受到干擾，最后導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)破壞［1，2］。鎂ATP酶，單胺氧化酶，琥珀酸脫氫酶，細(xì)胞色素氧化酶作為線粒體內(nèi)外膜標(biāo)志酶，經(jīng)組織化學(xué)方法原位顯示酶的活性，并定量觀察中毒性肝損害時(shí)酶活性的動態(tài)變化對評價(jià)毒物的毒理作用及各種毒物不同的作用特點(diǎn)具有重要意義。本研究通過對黃磷，亞砷酸鈉中毒大鼠肝臟上述酶的組化染色，利用圖像分析技術(shù)對肝小葉各區(qū)帶酶活性定量測定，并結(jié)合光鏡及電鏡下毒物結(jié)構(gòu)損害的特點(diǎn)［3］，探討黃磷和砷肝損害的酶學(xué)特點(diǎn)及其中毒機(jī)制。

1材料與方法

試劑與儀器ATP二鈉鹽；丁二酸鈉；細(xì)胞色素C；鹽酸色氨；氯化硝基四氮唑藍(lán)；二氨基聯(lián)苯胺；Histostat低溫冷凍切片機(jī)；圖像分析儀。

動物分組與染毒方式健康雄性大鼠90只，體重g，常規(guī)飼養(yǎng)，隨機(jī)分為三組，每組30只。黃磷/kg溶于芝麻油，亞砷酸鈉20mg/kg，溶于水；大鼠灌胃染毒，劑量為每100g體重，每周三次，連續(xù)12周。對照組給予等體積的芝麻油。

酶組化及圖像分析方法染毒后每2周各組隨機(jī)抽取大鼠5只，放血處死。取出肝臟立即在右肝正中切取5mm×5mm×3mm組織塊，“AO”低溫冷凍切片機(jī)在-15℃下切成10μm厚切片。繼而入新配制的孵育液作孵育等系列處理，甘油明膠封片。同時(shí)作去底物空白對照。Mg2+-ATPase，SDH，CO，MAO組化均采用經(jīng)典方法［4］，并經(jīng)本研究室改良。標(biāo)本次晨作圖像分析處理。在熒光屏直視下劃出肝小葉及其區(qū)帶。該圖像分析以光密度值表示染色的深線，光密度值大表示酶活性高。中央靜脈區(qū)參數(shù)為OD1，中間帶為OD2，周圍帶為OD3，全小葉為ODt。各組選取第2，4，10，12周標(biāo)本5只，每一標(biāo)本隨機(jī)取5個(gè)視野。所得參數(shù)由計(jì)算機(jī)作統(tǒng)計(jì)處理，多樣本均數(shù)的兩兩比較用方差分析，方差不齊者用秩和檢驗(yàn)。

2結(jié)果

+-ATPase的變化該酶活性主要位于肝小葉周圍帶，反應(yīng)顆粒呈棕褐色點(diǎn)狀和線狀。砷染毒早期，OD1酶活性增高；黃磷組則各區(qū)帶酶活性下降，其后兩組酶活性均下降。詳見附表。

與對照組同期比較：1)P＜；P＜

的變化對照組反應(yīng)為紫藍(lán)色甲顆粒，主要定位于肝小葉OD3，OD1相對較低，P，As染毒后，酶活性普遍下降，但OD1酶活性均無明顯影響。

的變化反應(yīng)物為紫色，對照組主要分布在周圍帶。P，As染毒后ODt和OD3下降明顯，但As組12周較10周酶活性增高。

的變化反應(yīng)物為棕色顆粒，對照組主要位于肝小葉周圍帶，從中央帶到周圍帶酶活性梯度遞增。在染毒早期各區(qū)帶酶活性無明顯變化。P組10～12周OD3活性下降，As組12周OD1酶活性增高，P＜)，其它區(qū)帶變化不明顯。

3討論

肝小葉中酶活性的正常分布及意義經(jīng)典肝小葉作為一古老概念，由于光鏡下邊界清楚，現(xiàn)仍用于教學(xué)和科研中?！案蜗倥荨钡囊霟o疑對肝功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)解釋更為完善，對肝臟病理和毒理研究有重大意義［5］。將肝小葉分為三個(gè)區(qū)帶，基本上與肝腺泡結(jié)構(gòu)吻合。小葉中央帶相當(dāng)于6個(gè)單腺泡的第Ⅲ帶；周圍帶相當(dāng)于6個(gè)單腺泡的第Ⅰ帶，只是門管區(qū)周圍包括了腺泡3個(gè)帶的部分肝細(xì)胞。肝小葉周圍帶集中大量的線粒體，其標(biāo)志酶含量極豐富，是生物氧化過程的主要場所；也最先接觸毒物。而中央帶富含混合功能氧化酶［6］，是藥物代謝的場所，肝細(xì)胞營養(yǎng)條件差，最受到藥物的損害。

黃磷、砷對肝酶系統(tǒng)的損害特點(diǎn)及其機(jī)制Mg2+-ATPase活性主要分布在膽小管，其次為線粒體，核膜及質(zhì)膜。本組砷染毒2周，中央帶Mg2+-ATPase，活性增高，第4周更為明顯；10周開始回落，12周酶活性下降明顯；而周圍帶持續(xù)下降。光鏡下發(fā)現(xiàn)，2～4周中央帶肝細(xì)胞濁腫變性；電鏡下線粒體腫脹，嵴膜完整清晰，膽小管輕度擴(kuò)張，10周線粒體基底密度降低，部分膜破裂［3］。此時(shí)，光鏡下可見點(diǎn)狀壞死，炎性細(xì)胞浸潤。提示砷中毒早期，膽小管及線粒體Mg2+-ATPase活性代償性增強(qiáng)。而砷中毒早期，砷的排泄除腎外，主要經(jīng)膽道由糞便排出，因此，Mg2+-ATPase活性增強(qiáng)可能是機(jī)體中毒早期的一種解毒機(jī)制。以后隨著膽小管和線粒體結(jié)構(gòu)的破壞、酶活性降低。黃磷對Mg2+-ATPase的損害無選擇性，各區(qū)帶酶活性下降程度大于砷組。光鏡下，2周即出現(xiàn)細(xì)胞脂變，10周出現(xiàn)小片狀壞死；電鏡下胞質(zhì)含有大量脂滴及次級溶酶體，部分線粒體膜破壞、嵴溶解［3］，說明脂質(zhì)過氧化作用損害了線粒體及其它生物膜結(jié)構(gòu)。同樣，黃磷也使周圍帶MAO，SDH活性下降，與張弘［2］報(bào)道的酶學(xué)變化相吻合。

然而，黃磷和砷對中央帶SDH無明顯影響則可能是OD1區(qū)SDH分布量甚少或毒物對其不敏感之故。砷作為氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑，對琥珀酸介導(dǎo)的呼吸無明顯影響［7］。砷組晚期MAO活性有回升則可能為細(xì)胞對砷產(chǎn)生耐受后酶活性部分恢復(fù)所致。黃磷組僅晚期外周帶CO活性下降，結(jié)合上述結(jié)構(gòu)改變，考慮為中毒早期CO對黃磷不敏感。砷中毒晚期中央帶CO活性增高，可能是砷干擾了線粒體氧化的“外途徑”，從而激活了“內(nèi)途徑”使CO活性增高以滿足ATP生成的需要［8］。

此外，從光鏡及酶組化發(fā)現(xiàn)：同一個(gè)體肝臟一定部位，中毒后不同的肝小葉其結(jié)構(gòu)及酶活性損害程度不同。同一小葉不同區(qū)帶其損害也不盡相同。電鏡下還觀察到，同一區(qū)帶內(nèi)不同的肝細(xì)胞其結(jié)構(gòu)損害差異亦很大。這種差異性，說明了肝細(xì)胞生理功能與細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)在

聯(lián)系的復(fù)雜性，其組織學(xué)及病理學(xué)意義有待進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)

1劉起展.黃磷引起肝臟損害機(jī)理及部位的研究.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1991，：10～14

2張弘.砷、磷、四氯化碳肝損害酶學(xué)指標(biāo)的比較研究.中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病的雜志，1991，：26～29

3詹道友，盧迪生，韓英士，等.黃磷、砷肝損害的電鏡和微體酶細(xì)胞化學(xué)比較研究.湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1993，18：243～246

4陳嘯梅.組織化學(xué)手冊.北京：人民衛(wèi)生出版社，

5顧長海.肝腺泡學(xué)說的概念及其意義.國外醫(yī)學(xué)*消化分冊，1984，4：79