葉綠素光降解動(dòng)力學(xué)研究

葉綠素光降解動(dòng)力學(xué)研究

0葉綠素降解動(dòng)力學(xué)近年來(lái)，天然食用染料引起了人們的注意。然而，這些染料大多不穩(wěn)定。在生產(chǎn)、加工和儲(chǔ)存過(guò)程中，容易受到光、酶、熱、酸等因素的破壞，導(dǎo)致分解，嚴(yán)重影響了該產(chǎn)品的品質(zhì)。探討引起該類(lèi)色素降解的主要因素,可以在果蔬產(chǎn)品的生產(chǎn)和加工中予以克服和避免,更好地保證產(chǎn)品在貨架期內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和感官品質(zhì),提高經(jīng)濟(jì)效益。葉綠素廣泛存在于自然界的植物中,是植物原料的重要功能成分,它不僅賦予果蔬及其制品良好的色澤,還具有改善便秘、降低膽固醇、抗突變等生理功能。作為綠色果蔬的主要色素,它在一定程度上也決定了這類(lèi)果蔬產(chǎn)品的品質(zhì)特征,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,該色素主要有兩大降解途徑:酶降解和光降解,酶降解目前在植物生理及園藝學(xué)方面研究較多也較為成熟,而葉綠素的光降解動(dòng)力學(xué)及降解機(jī)理研究較少。本文重點(diǎn)探討了不同波長(zhǎng)的單色光和光照強(qiáng)度對(duì)葉綠素降解作用,旨在篩選出導(dǎo)致葉綠素降解速率最快的某段或某幾段波長(zhǎng)的光,定量說(shuō)明葉綠素對(duì)光的敏感度,較系統(tǒng)地研究葉綠素光降解的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)綠色果蔬及其制品包裝材料的選擇和預(yù)測(cè)產(chǎn)品貯藏期葉綠素的保存情況有較好的指導(dǎo)意義,也可為太陽(yáng)能干制綠色果蔬產(chǎn)品設(shè)施的研究開(kāi)發(fā)提供參考。1材料和方法1.1細(xì)化學(xué)品有限公司合成減染劑試驗(yàn)采用新鮮菠菜購(gòu)于北京超市發(fā)超市。主要試劑:葉綠素標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于sigma公司;乙腈、甲醇、正己烷、三氯甲烷(均為進(jìn)口的色譜純);95%乙醇、無(wú)水乙醇、丁醇、蒸餾水(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司);主要儀器:T6新世紀(jì)-紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司),SC-80C型全自動(dòng)色差計(jì)(北京康光儀器有限公司),TES-1334A數(shù)位式照度計(jì)(中國(guó)臺(tái)灣泰仕電子工業(yè)股份有限公司),高效液相色譜儀(北分儀器公司,檢測(cè)器型號(hào):K-2501,高壓泵型號(hào):K-1001,流動(dòng)相混合器型號(hào):K-1500,色譜柱型號(hào):CosmosilColumn:4.6μm×250mm,5C18-AR-Ⅱ),SHZ-Ⅲ型循環(huán)真空泵(上海亞榮生化儀器廠),AnkeGL-20G-Ⅱ飛鴿牌離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器有限公司)。1.2方法1.2.1研磨浸泡和研磨紫菜中葉綠素的降解本研究以新鮮菠菜為原料,以95%乙醇為提取溶劑,葉綠素提取工藝路線如下:新鮮菠菜→清洗、去根去莖→剪碎→沸水浴熱燙15s→研磨浸泡→粗提取液→4800r/min離心20min→過(guò)0.45μm膜→柱層析分離→葉綠素提取液→樣品液備用根據(jù)前人研究,葉綠素酶的活性最適溫度范圍為60~82℃,80℃以上其活性開(kāi)始下降,100℃完全失活,因此本試驗(yàn)采用沸水浴100℃、15s鈍化菠菜中導(dǎo)致葉綠素降解的酶,以消除由酶引起的色素降解。葉綠素提取柱層析條件為:丁醇、乙醇、水的體積比為3︰1︰1洗脫葉綠素。1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用95%乙醇將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至合適濃度,取10mg/L的葉綠素標(biāo)準(zhǔn)液,用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描后得到葉綠素乙醇溶液的最大吸收峰為葉綠素a:430、665nm,葉綠素b:470、650nm,葉綠素a+b,469、660nm。將葉綠素a、葉綠素b標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不同的濃度,分別測(cè)定它們?cè)?65、650和660nm下的吸光值,以濃度x(mg/L)為橫坐標(biāo),吸光值y為縱坐標(biāo),得到葉綠素a的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.0788+0.05107x,R=0.99945;葉綠素b:y=0.05027+0.04668x,R=0.99969;葉綠素a+b:y=0.05387+0.04073x,R=0.99967。1.2.3復(fù)合光譜分析試驗(yàn)特定做了較為精確的全介質(zhì)雙半波單色濾光片,這些濾光片經(jīng)過(guò)波譜掃描后呈現(xiàn)較好的光的單色性。單色光范圍包括紫外線、可見(jiàn)光、紅外線3個(gè)區(qū)域,本試驗(yàn)將復(fù)合光通過(guò)濾光片后得到的單色光波長(zhǎng)分別為365、430、470、490、530、577、590、650、808、821、940nm.,其中365nm為紫外區(qū),430~650nm為可見(jiàn)光區(qū),808~940nm為紅外區(qū)。選用光源為50W和100W的溴鎢燈,不同條件下的光照強(qiáng)度采用照度計(jì)測(cè)量,單位為lux,試驗(yàn)在常溫下進(jìn)行。1.2.4單色光法ws測(cè)定總試劑中紅外光wsf和分光光wsf兩光異性wsf-1.2.2單色光wsf-2.2單色光wsf-2-o為了篩選出對(duì)葉綠素破壞作用最大的一段或幾段波長(zhǎng)的單色光,為探討不同單色光對(duì)葉綠素的降解速率和降解半衰期,本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了不同單色光對(duì)葉綠素降解過(guò)程。方法是:在同一光源下(50W的溴鎢燈),采用不同的濾光片得到不同波長(zhǎng)的單色光,將樣品液置于濾光片下方,樣品距離光源泉約5cm。連續(xù)光照,每天測(cè)定一次樣品液在最大吸收區(qū)(紅光區(qū))的吸光值,測(cè)定10d,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出不同單色光條件下色素含量的變化值,試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。試驗(yàn)中將葉綠素提取液分裝在25mL血清瓶中,為了避免有機(jī)溶劑揮發(fā),利用進(jìn)口Parafilm封口膜外加密封瓶蓋口,每次將3個(gè)平行樣品置于光照暗箱(圖1)中的單色光下。1.2.5光照強(qiáng)度的測(cè)定為進(jìn)一步探討光對(duì)葉綠素降解的動(dòng)力學(xué),本試驗(yàn)在分析了單色光對(duì)葉綠素降解動(dòng)力學(xué)的基礎(chǔ)上,又設(shè)計(jì)了不同光照強(qiáng)度下葉綠素的降解動(dòng)力學(xué)過(guò)程。試驗(yàn)以室內(nèi)室外的光照強(qiáng)度為基準(zhǔn),選用50W和100W的溴鎢燈為光源,通過(guò)不同的照射距離來(lái)設(shè)定光照強(qiáng)度分別為500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000lux,光照強(qiáng)度用照度計(jì)測(cè)定,采用紫外分光光度計(jì)和全自動(dòng)色差計(jì)定量,每隔5h取出溶液進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定其吸光度和色差值-a*。試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。1.2.6溫度對(duì)葉綠素降解過(guò)程的影響由于整個(gè)試驗(yàn)均在常溫下進(jìn)行,而樣品液在連續(xù)光照期間,溶液溫度有一定程度上升,試驗(yàn)過(guò)程中用溫度計(jì)監(jiān)測(cè)其溫度,發(fā)現(xiàn)溶液在不同光照強(qiáng)度和光照時(shí)間條件下,最高溫度約在40℃。因此,設(shè)定了以下溫度梯度:30、40、50、60℃,以探討溫度對(duì)葉綠素降解過(guò)程的影響,試驗(yàn)中將樣品液置于恒溫水浴鍋內(nèi),避光,每隔5h測(cè)定一次。有研究指出:葉綠素的光降解過(guò)程須有氧氣參加反應(yīng),氧氣是葉綠素光氧化的一個(gè)最重要的條件,因此,筆者比較了充氮條件和非充氮條件下葉綠素的光降解速率,試驗(yàn)選用470nm、300lux單色光,每隔5h測(cè)定一次兩種條件下的葉綠素含量,試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。1.2.7葉綠素含量檢測(cè)以上研究都是基于復(fù)雜體系中的葉綠素光降解動(dòng)力學(xué),然而,復(fù)雜體系中葉綠素定量分析可能會(huì)受到一些因素的干擾,葉綠素b在光照條件下還可以轉(zhuǎn)化為葉綠素a,因此,為進(jìn)一步探討葉綠素的光降解反應(yīng),選用了純體系進(jìn)行了葉綠素a和葉綠素b的光降解研究。選擇470nm的單色光,光照強(qiáng)度為300lux,在連續(xù)光照過(guò)程中,每隔5h取出一定量的葉綠素溶液,采用高效液相色譜法定量分析,每個(gè)樣平行3次,取平均值。色譜條件:色譜柱:Cosmosil5C18-AR-Ⅱ(NACALAITESQUE,INC.,5μm,4.6mm×250mm),流動(dòng)相︰乙睛︰甲醇︰三氯甲烷︰正己烷=75︰12.5︰7.5︰7.5(體積比),柱溫為30℃,流速為1mL/min,等度洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng)為430nm,進(jìn)樣量為20μL。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,利用內(nèi)標(biāo)法定量葉綠素及其降解產(chǎn)物有較好的效果,但考慮到試驗(yàn)條件的限制,本文采用外標(biāo)法對(duì)不同光照強(qiáng)度和光照時(shí)間后的葉綠素a和葉綠素b進(jìn)行定量分析,色譜峰面積進(jìn)行定量,由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各種不同處理?xiàng)l件下的葉綠素a和葉綠素b的含量。2結(jié)果與分析2.1不同單色光對(duì)葉綠素降解的影響將不同光照條件下葉綠素含量C(mg/L)取自然對(duì)數(shù)值lnC對(duì)時(shí)間(d)做圖(圖2),由圖2知,隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng),葉綠素含量的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)直線減少的趨勢(shì),說(shuō)明單色光對(duì)葉綠素的降解過(guò)程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。不同單色光對(duì)葉綠素破壞作用不同。其中紫外區(qū)(365nm)對(duì)葉綠素破壞作用最大;可見(jiàn)光區(qū)(470、650、430nm)對(duì)葉綠素降解作用次之,而這3種波長(zhǎng)的光正好位于葉綠素溶液光譜掃描的最大吸收區(qū)附近;紅外線區(qū)對(duì)葉綠素破壞速度較慢?？梢?jiàn)光區(qū)430nm和470nm位于藍(lán)光區(qū)域,650nm位于紅光區(qū)。因此,在可見(jiàn)光區(qū),藍(lán)光和紅光將是導(dǎo)致葉綠素降解速率最快的單色光,其它不同波段的光對(duì)葉綠素破壞作用不同,但相對(duì)藍(lán)光和紅光來(lái)說(shuō),這些波段的單色光對(duì)葉綠素降解作用較弱,由此可以推測(cè),被葉綠素吸收程度最大的單色光也是促進(jìn)葉綠素降解速率最快的單色光。葉綠素含量可用公式表示:式中C——t時(shí)的葉綠素含量,mg/L;C0——初始時(shí)葉綠素含量,mg/L;t——光照時(shí)間,d;k——葉綠素降解速率常數(shù),(mg·L)/d。通過(guò)對(duì)各曲線進(jìn)行線性回歸,得到單色光下葉綠素降解的動(dòng)力學(xué)方程、降解速率常數(shù)k值以及降解半衰期T1/2((ln2)/k),即葉綠素降解一半所需的連續(xù)光照時(shí)間(見(jiàn)表1)。由表1知,不同單色光對(duì)葉綠素降解的動(dòng)力學(xué)方程的線性擬合度R2值均在0.86以上,線性擬合度較好;相同條件下,不同單色光對(duì)葉綠素的降解速率常數(shù)不同;365、430、470、650nm的單色光下,葉綠素降解的半衰期分別為12、16、13、20d,即紫外區(qū)、可見(jiàn)光區(qū)的藍(lán)光和紅光區(qū)是導(dǎo)致葉綠素光降解的最主要波段區(qū)。2.2葉綠素光降解動(dòng)力學(xué)模型將不同光照條件下葉綠素的含量C(mg/L)的自然對(duì)數(shù)值lnC對(duì)時(shí)間(h)做圖(圖3),由圖3知,隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng),其自然對(duì)數(shù)呈現(xiàn)直線減少的趨勢(shì),說(shuō)明不同光強(qiáng)下葉綠素的降解過(guò)程為一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。對(duì)各曲線進(jìn)行線性回歸,得到不同光強(qiáng)條件下葉綠素降解的動(dòng)力學(xué)方程、降解速率常數(shù)k值以及降解半衰期T1/2(表2)。由表2知,不同光照強(qiáng)度對(duì)葉綠素降解速率不同,光照強(qiáng)度越強(qiáng),葉綠素降解的越快,光照強(qiáng)度為500、2000、5000lux時(shí),葉綠素降解的半衰期分別為16.9、9.8、4.0h;不同光照強(qiáng)度下,葉綠素降解動(dòng)力學(xué)模型的線性擬合度R2值均在0.97以上,線性擬合度較好。上述試驗(yàn)對(duì)葉綠素光降解的評(píng)價(jià)手段主要采取分光光度法進(jìn)行評(píng)價(jià),而全自動(dòng)色差計(jì)也是評(píng)價(jià)顏色變化的一種重要方法,可以為葉綠素光降解的動(dòng)力學(xué)研究提供更加有效的補(bǔ)充。色差計(jì)測(cè)定的值包括溶液的色度值和亮度值,其中色度值由a*值和b*值組成,a*由負(fù)值向正值表示溶液顏色為綠色向紅色轉(zhuǎn)變,b*由負(fù)值向正值表示溶液顏色為藍(lán)色向黃色轉(zhuǎn)變。將不同時(shí)間和光照強(qiáng)度下葉綠素溶液的色差值-a*值對(duì)時(shí)間作圖(圖4)。從圖3可以得出,隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)和光照時(shí)間的延長(zhǎng),葉綠素降解速率加快,并且降解過(guò)程呈指數(shù)衰減,且指數(shù)降解的幅度越來(lái)越大;圖4表明隨著光強(qiáng)和光照時(shí)間的增加,-a*值減小,即溶液的綠色度越來(lái)越淺,表明隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)和光照強(qiáng)度的增強(qiáng),葉綠素降解程度越來(lái)越明顯,這一結(jié)果與分光光度法定量葉綠素降解過(guò)程得到的結(jié)論一致。2.3不同溫度對(duì)葉綠素降解率的影響以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo),葉綠素含量(mg/L)為縱坐標(biāo),繪制溫度對(duì)葉綠素降解影響的曲線圖(圖5)。由圖5可知,60℃以下溫度對(duì)葉綠素破壞作用不明顯,30、40、50、60℃避光條件下,恒溫保持35h,葉綠素降解率分別為2.0%、2.6%、4.0%、5.2%。因此,在研究單因素光對(duì)葉綠素降解動(dòng)力學(xué)過(guò)程中,連續(xù)光照導(dǎo)致葉綠素溶液溫度的少許上升不會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成較大誤差。2.4充氮對(duì)葉綠素降解的影響本試驗(yàn)選用了光照強(qiáng)度為300lux,470nm單色光對(duì)充氮/非充氮兩種體系下的葉綠素進(jìn)行光降解過(guò)程探討(圖6)。由圖6可知,充氮(飽和)條件下葉綠素在光照下基本不發(fā)生降解,連續(xù)光照35h,葉綠素降解率僅為5%,而非充氮條件下葉綠素降解較明顯,連續(xù)光照35h,葉綠素降解率為26%。所以氧氣是葉綠素光降解過(guò)程中一個(gè)非常重要的條件,在護(hù)綠技術(shù)中,應(yīng)盡可能降低體系中氧氣的濃度,以抑制葉綠素的降解。2.5不同光照條件對(duì)葉綠素a和b的降解曲線圖以光照時(shí)間(h)為橫坐標(biāo),葉綠素濃度C(mg/L)為縱坐標(biāo),繪制對(duì)葉綠素a和b的降解曲線圖(圖7)。由圖7可知,相同光照條件下,葉綠素a和葉綠素b對(duì)光的敏感程度不同,葉綠素a比葉綠素b更易受到破壞;葉綠素a的降解速率約為葉綠素b降解速率的3~4倍。3不同光照條件對(duì)葉綠素降解的影響1)通過(guò)葉綠素光降解試驗(yàn),由數(shù)據(jù)回歸確定其降解過(guò)程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)模型。2)不同波長(zhǎng)單色光對(duì)葉綠素破壞作用不同,紫外線對(duì)葉綠素有很強(qiáng)的破壞性,可見(jiàn)光區(qū)的藍(lán)光(430nm,470nm)、紅光(650nm)降解作用次之,紅外線對(duì)葉綠素破壞作用較小。3)不同光照強(qiáng)度對(duì)葉綠素有不同程度的降解作用,光照強(qiáng)度為500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000lux,葉綠素降解的半衰期分別為16.9、14.1、11.5、9.8、8.8、8.2、7.1、6.0、5.2、4.0h。4)60℃以下溫度對(duì)葉綠素降解作用不明顯,30、40、50、60℃避光條件下,恒溫保持35h,葉綠素降解率分別為2.0%、2.6%、4.0%、5.2%。5)充氮(飽和)條件下葉綠素在光照下基本不發(fā)生降解,而非充氮條件下葉綠素降解較明顯,光照強(qiáng)度為300lux,波長(zhǎng)為470nm的單色光連續(xù)光照35h,兩種條件下葉綠素降解率分別為5.0%、26.4%。6)葉綠素a和葉綠素b對(duì)光照的敏感度不同,葉綠素a更易受到光作用而降解,相同光照條件下葉綠素a的降解速率明顯快于葉綠素b,且前者降解速率約為后者的3~4倍。4葉綠素光降解動(dòng)力學(xué)方程本文對(duì)葉綠素光降解的動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,并首次從單色光、光照強(qiáng)度兩個(gè)角度研究了葉綠素的降解動(dòng)力學(xué),并確立了此降解反應(yīng)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。動(dòng)力學(xué)模型在食品科學(xué)和農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏領(lǐng)域有著非常重要的應(yīng)用,特別是在產(chǎn)品的質(zhì)量控制,貨架期的確定,新產(chǎn)品的研究開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域。食品中絕大多數(shù)的營(yíng)養(yǎng)成分在貯藏加工過(guò)程中都會(huì)受到各種因素的影響而降解,這些成分發(fā)生降解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)模型基本上為零級(jí)或一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)模型,而大部分色素和維生素的降解反應(yīng)符合一級(jí)反應(yīng)。本試驗(yàn)得到的不同光強(qiáng)下葉綠素降解的動(dòng)力學(xué)方程、降解速率常數(shù)以及降解半衰期,可為綠色果蔬貯藏期間葉綠素的保存和分解情況提供預(yù)測(cè)參考,在光照