提高蛋白質(zhì)藥物的體內(nèi)外抗氧化研究進(jìn)展

提高蛋白質(zhì)藥物的體內(nèi)外抗氧化研究進(jìn)展

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)藥物已成為生物技術(shù)藥物的主要形式。如促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、干擾素、白介素、胰島素以及各種疫苗等。目前已有40種以上重要的治療藥物上市,720多種生物技術(shù)藥物正進(jìn)行Ⅰ-Ⅲ期臨床試驗(yàn)或接受FDA審評(píng),其中200種以上的藥物進(jìn)人最后的批準(zhǔn)階段。但是蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)會(huì)被快速清除,這是由于組織中大量存在的蛋白酶,能夠水解蛋白質(zhì)藥物,使其喪失活性,同時(shí)由于腎小球的濾過作用,分子量小于69kDa的分子在代謝過程中易被清除,肝臟在藥物代謝過程中也具有重要作用,因而蛋白質(zhì)藥物半衰期都很短。為了維持一定的療效需要大劑量頻繁用藥,長(zhǎng)期的反復(fù)注射不僅增加了病人的痛苦而且易引發(fā)一系列副反應(yīng)。因此臨床上需要研制長(zhǎng)效的蛋白質(zhì)藥物。目前,已經(jīng)建立的改善蛋白質(zhì)藥物半衰期的技術(shù)包括:蛋白藥物的化學(xué)修飾、蛋白質(zhì)融合、微囊化/納米粒、糖基化、構(gòu)建抗蛋白酶突變體等。本文將上述五種技術(shù)用于蛋白質(zhì)藥物長(zhǎng)效化的研究進(jìn)展作一綜述。1peg修飾的蛋白質(zhì)藥物化學(xué)修飾是延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物半衰期的一個(gè)有效途徑。它是一種將分子量小的蛋白質(zhì)藥物共價(jià)連接到具有較大分子量的分子上,例如聚乙二醇和白蛋白,共價(jià)連接到大分子上能減小免疫原性,改善可溶性和生物學(xué)利用度,以及增加抗蛋白水解作用,同時(shí)也能夠延長(zhǎng)半衰期。然而,生物活性分子共價(jià)修飾的作用被內(nèi)在生物活性的損失所限制,例如,由于空間位阻而使受體結(jié)合減少,無活性分子整合到活性肽的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)而產(chǎn)生的異質(zhì)性。終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性通常伴隨著功能異質(zhì)性,致使生物活性或酶活性減小。聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)是由環(huán)氧乙烷聚合而成的大分子聚合物,PEG類修飾劑和其他修飾劑相比,具有無毒性,良好的溶解性,免疫原性低,且相對(duì)分子量范圍寬,選擇余地大等優(yōu)點(diǎn)。而且PEG可以將它的許多優(yōu)良特性賦予修飾后的生物分子。經(jīng)聚乙二醇共價(jià)修飾后,蛋白質(zhì)藥物的相對(duì)分子質(zhì)量有所增加,減少了藥物排泄,增加其抵抗蛋白酶分解的穩(wěn)定性,降低免疫原性,這些改變均有利于延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的半衰期,從而,蛋白質(zhì)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效性質(zhì)得到明顯改善。例如,PEG修飾的干擾素-α(IFN-α)與未修飾的IFN-α相比,半衰期延長(zhǎng)10～20倍;超氧化物歧化酶PEG修飾前半衰期為5min,PEG修飾后半衰期延長(zhǎng)至4.2h。Stigsnaes等用PEG5000修飾胰高血糖素,然后檢驗(yàn)此種修飾對(duì)胰高血糖素的構(gòu)象和生物學(xué)穩(wěn)定性的影響。檢測(cè)胰高血糖素樣品和PEG修飾的胰高血糖素的二級(jí)結(jié)構(gòu),并評(píng)估其物理穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)未經(jīng)修飾的胰高血糖素,分子間形成了許多β-折疊結(jié)構(gòu),成纖維的延遲時(shí)間短;而PEG修飾后的胰高血糖素只有少量的分子間β-折疊,并未出現(xiàn)纖維,物理穩(wěn)定性明顯高于前者。1991年,第一種經(jīng)聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物—PEG腺苷脫氨酶被FDA批準(zhǔn)上市,用于治療一種嚴(yán)重的兒童免疫缺陷癥。2001年,PEG修飾的干擾素(PEG-intron)獲FDA批準(zhǔn)上市,用于治療慢性丙型肝炎。迄今為止,國(guó)外已有多種PEG修飾的蛋白質(zhì)類藥物應(yīng)用于臨床。目前已經(jīng)上市的PEG化的蛋白藥物有PEG化的L-天冬酰胺酶(Enzon公司的Oncaspar)、PEG化的干擾素α-2b(IFNα-2b)(Schering公司的PEGIntron)、PEG化的干擾素α-2a(IFNα-2a)(Roche公司的Pegasys)和PEG化的粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)(Amgen公司的Neulasta)。除了上述這些已上市的長(zhǎng)效PEG化蛋白質(zhì)藥物外,處于臨床前研究的還有:超氧化物歧化酶(即將上市,Enzon公司)、白介素-2(Ⅱ期,Chiron公司)、水蛭素(Ⅱ期,BASFAG公司)等,這些重組蛋白質(zhì)藥物在上市之后都會(huì)有預(yù)期的長(zhǎng)效。2免疫原性的特點(diǎn)應(yīng)用蛋白質(zhì)融合能夠構(gòu)建具有雙功能的目的蛋白,這種融合蛋白是將兩個(gè)或多個(gè)基因的編碼區(qū)首尾連接,由同一調(diào)控序列控制構(gòu)成的基因表達(dá)產(chǎn)物。在分子水平,這個(gè)技術(shù)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單靈活的特性,因?yàn)闃?gòu)建突變體時(shí)不需要插入連接序列而直接在C-端或N-端融合。因此,這種技術(shù)能廣泛地應(yīng)用于構(gòu)建生物活性分子,而且它的應(yīng)用性不會(huì)因?yàn)樯锓肿拥拇笮』蚧钚远艿较拗?。常選用半衰期較長(zhǎng),分子量較大的分子作為載體構(gòu)建融合蛋白,人血清白蛋白(HSA)或免疫球蛋白(IgG)的Fc片段應(yīng)用最為廣泛。故以人血清白蛋白和Fc片段的融合技術(shù)為代表進(jìn)行闡述。人血清白蛋白是血漿中含量最多的蛋白,分子量67kDa,它在血管和血管外室的循環(huán)中分布廣,半衰期可達(dá)到19天,且結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定,無明顯的免疫原性,是血液中重要的物質(zhì)輸送和藥物運(yùn)輸載體,所以它成為藥物設(shè)計(jì)理想的載體蛋白,用于改善藥物的半衰期,延遲藥物清除,增加藥物暴露,減少注射頻率,改善病人對(duì)治療的順從性和耐受性。目前,多種蛋白與HSA融合后在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)半衰期的延長(zhǎng)得到了證實(shí),例如成功地將白蛋白與激素(胰島素﹑天然胰高血糖素-1、人生長(zhǎng)激素)、細(xì)胞因子(干擾素α-2b、IL-2)等融合,獲得更穩(wěn)定的循環(huán)蛋白,融合蛋白同時(shí)具有人血清白蛋白的長(zhǎng)半衰期,和生物學(xué)活性及治療特性。通過此技術(shù)已對(duì)許多蛋白質(zhì)進(jìn)行了改造。人胰島素/白蛋白融合蛋白(Albulin)在小鼠體內(nèi)半衰期比天然胰島素提高了42倍。在畢赤酵母中表達(dá)的胰高血糖樣肽素-1融合蛋白(GLP-1/HSA)在小鼠體內(nèi)的半衰期比單獨(dú)的GLP-1延長(zhǎng)4倍。干擾素-α融合蛋白(IFN-α/HSA)的半衰期比未融合的干擾素-α(IFN-α)延長(zhǎng)了大約18倍。Müller等為了延長(zhǎng)幾種雙特異性抗體(scFv2、scDb、taFv)的半衰期,將它們與HSA融合后,不僅穩(wěn)定性大大提高(半衰期大于4天),scFv2-HSA的半衰期由5min增加至117min,scDb-HSA由8min增加至43min,taFv-HSA也由9min增加至37min。利用抗體Fc段所特有的生物學(xué)功能與某些多肽或蛋白融合也可增加該蛋白質(zhì)的血漿半衰期。人IgG免疫球蛋白是體內(nèi)的主要抗體,它的半衰期約為20天。IgG融合蛋白的構(gòu)建方式大多是將IgG的Fc(Hinge-CH2-CH3)片段或CH(CH1-Hinge-CH2-CH3)片段的N端與活性蛋白的C端相連。IL-10是一種抗炎癥因子,制備重組IL-10/IgG2Fc融合蛋白能明顯延長(zhǎng)IL-10的半衰期。免疫粘合素(immunoadhesin)是通過將受體的靶向結(jié)合區(qū)域,粘附分子,配體或者酶融合到IgG的Fc片段構(gòu)成,用來治療自身免疫性疾病。王磊等構(gòu)建了IFNα-2b與人IgG免疫球蛋白Fc片段的融合基因(IFNα2b-Fcγ)并在畢赤酵母中以二聚體形式分泌表達(dá),不同亞型Fcγ片段的融合蛋白對(duì)IFNα-2b抗病毒活性均有一定影響,大鼠皮下注射后循環(huán)血液中半衰期達(dá)65h,血液中存留時(shí)間120h以上,比商品重組干擾素體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)了8倍。3蛋白質(zhì)藥物的使用微囊化技術(shù)已廣泛用于增強(qiáng)治療因子的藥代動(dòng)力學(xué)特性,改進(jìn)藥物穩(wěn)定性以及使藥物靶向釋放等方面。用微囊包埋蛋白質(zhì)和多肽藥物,不僅可以通過緩釋作用實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效皮下注射制劑,而且可以通過微囊表面和粒徑的設(shè)計(jì),實(shí)現(xiàn)口服、黏膜給藥、吸入等新劑型。此技術(shù)的原理是將藥物活性部分包封于聚合層中,通過皮下或肌肉給藥,聚合層隨著時(shí)間減少,使藥物從微囊中緩慢持續(xù)釋放,這有利于穩(wěn)定藥物,減少胃腸道酶的破壞,改變其體內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)過程,延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間?，F(xiàn)在蛋白質(zhì)藥物的微球注射制劑已經(jīng)研究成功并應(yīng)用于臨床。它是用生物可降解聚合物作為骨架材料包裹蛋白質(zhì)藥物制成直徑為1～250μm的可注射微球劑,生物可降解聚合物主要包括淀粉、明膠、葡聚糖、白蛋白、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚鄰酯、聚內(nèi)酯和聚酐等。目前用于制備緩釋微球的骨架材料主要是PLGA和PLA,其中又以PLGA更為常用。此外,美杜莎持續(xù)釋放系統(tǒng)也被用于蛋白質(zhì)藥物緩釋過程中,它是由多聚L-谷氨酸骨架組成,帶有疏水的α-生育酚分子,形成毫微球粒的膠體懸液。由于毫微球粒的疏水區(qū)域的藥物相互作用產(chǎn)生了持續(xù)釋放藥物的效果。在體內(nèi),蛋白質(zhì)藥物被生理溶液中內(nèi)源蛋白代替,導(dǎo)致藥物緩釋。蛋白質(zhì)藥物最高濃度顯著降低,藥物釋放明顯延長(zhǎng)。美杜莎持續(xù)釋放技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于靜脈注射IL-2和IFN-α(2b),臨床上已經(jīng)應(yīng)用于腎癌和丙型肝炎C的治療。目前聚乳酸及其共聚物類緩釋制劑已經(jīng)上市的藥物有,促甲狀腺激素釋放激素TRH類藥物——曲普瑞林(商品名Decapepty1)PLGA緩釋微球,用于治療前列腺癌,可緩慢釋藥1個(gè)月,是第一個(gè)多肽微球產(chǎn)品。亮丙瑞林(Leuprorelin)PLGA緩釋微球,主要用于前列腺癌及子宮內(nèi)膜異位癥,也可釋藥1個(gè)月。以后又有多種LHRH類似物的緩釋微球注射劑先后上市。還有不少蛋白質(zhì)藥物的緩釋微球注射劑正在實(shí)驗(yàn)室研究或動(dòng)物試驗(yàn)階段。4蛋白水解突變體的生物活性生物藥物的蛋白酶水解作用是給藥技術(shù)發(fā)展中需要突破的重要障礙。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)很容易被內(nèi)源血清中或組織中蛋白酶分解,并且蛋白酶對(duì)蛋白的降解可以發(fā)生在吸收、分布及排泄等各個(gè)階段,這就直接影響藥物的體內(nèi)半衰期、生物利用度、血漿清除率等參數(shù)。將一個(gè)或多個(gè)抗蛋白水解突變體引入到生物活性分子上,是藥物設(shè)計(jì)和發(fā)展的研究焦點(diǎn)。體內(nèi)的穩(wěn)定作用也通過引入人造氨基酸類似物(β-aminoacids)而達(dá)到。這些變體發(fā)生細(xì)小的構(gòu)象變化,導(dǎo)致增強(qiáng)抗蛋白水解作用。例如,通過取代蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中任意肽鍵,提高蛋白藥物抵抗蛋白酶降解的穩(wěn)定性,在模擬肽的生物活性的基礎(chǔ)上,通過肽的骨架修飾,改變肽的主體結(jié)構(gòu),是擬肽設(shè)計(jì)的目標(biāo)。Markert等為了提高核糖核酸酶A(RNaseA)抵抗蛋白酶K和枯草桿菌蛋白酶水解的能力,通過定點(diǎn)突變,用Pro替代了Ala20,經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)突變體酶(Ala20Pro-RNaseA)的構(gòu)象沒有發(fā)生明顯的變化,生物活性也和野生型RNaseA一樣,但是抵抗蛋白酶水解的能力顯著增加。通過SDS電泳結(jié)果顯示,蛋白酶水解常數(shù)下降2倍。5重組人epo的體外修飾作用蛋白質(zhì)表面的糖鏈能夠影響蛋白的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、生物活性和穩(wěn)定性等,并且,糖基化是某些蛋白質(zhì)發(fā)揮生物活性所必需的。對(duì)比治療性蛋白質(zhì)的糖基化形式和非糖基化形式,一方面蛋白質(zhì)藥物表面增加了側(cè)鏈,提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性,阻礙蛋白酶對(duì)蛋白藥物的降解作用,另一方面使蛋白質(zhì)藥物分子量增大,減少腎小球?yàn)V過。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一個(gè)高度糖基化的含唾液酸的酸性糖蛋白,它含有3個(gè)N-糖鏈和1個(gè)O-糖鏈。構(gòu)建重組人促紅細(xì)胞生成蛋白,分別在33和88位各增加一個(gè)N-糖基化位點(diǎn),研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組人EPO的體內(nèi)半衰期是EPO的3倍。重組人EPO的O-糖基化對(duì)于體內(nèi)外活性及清除速率作用無關(guān),而N-糖基化不完全的重組人EPO體外活性正常,體內(nèi)活性則降低到體外活性的1/500,且體內(nèi)清除率也明顯加快。因此,N-糖基化對(duì)蛋白質(zhì)藥物的修飾有重要作用。重組人EPO突變體(Amgen公司的Aranesp)已經(jīng)研制成功并上市。組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)在體循環(huán)中的清除率很高,半衰期僅為6min。Keyt等構(gòu)建了tPA變體,發(fā)現(xiàn)突變體具有減少tPA血漿清除率的特性,同時(shí)保持正常的纖維蛋白結(jié)合能力和血塊溶解活性。有效延長(zhǎng)半衰期的tPA突變體是通過在Kringle1處進(jìn)行糖基化修飾,用Asn替代Thr-103形成,即T-tPA。隨后在296-299位置發(fā)生四等位基因替換反應(yīng)[KNRR(296-299)AAA]形成突變體(TK-tPA)。TK-tPA表現(xiàn)出抗纖溶酶原激活劑抑制因子1的能力比tPA高80倍。TK-tPA延長(zhǎng)了體內(nèi)清除時(shí)間,能夠減小清除率,同時(shí)保持正常的凝血活性。因此可以作為有效的低劑量血栓溶解劑。6其他技術(shù)的發(fā)展綜上所述,目前已經(jīng)發(fā)展了許多有效提高蛋白質(zhì)藥物半衰期的技術(shù),各