附睪和睪丸冷凍精子行卵胞漿內(nèi)單精子注射臨床效果

附睪和睪丸冷凍精子行卵胞漿內(nèi)單精子注射臨床效果

自1992年卵胞漿內(nèi)單精子注射［1］問世以來，實(shí)現(xiàn)了男性少、弱，畸形精子癥患者獲得遺傳學(xué)后代的愿望，1993年Schoysman等［2］報(bào)道了無精子癥患者應(yīng)用睪丸精子行ICSI獲得成功。此后，經(jīng)皮附睪抽吸、睪丸切開行ICSI已作為有正常生精的梗阻性無精或睪丸衰竭的非梗阻性無精及不射精患者常規(guī)治療方法。臨床上，無精子癥患者在排除遺傳性疾病的基礎(chǔ)上一般首先要進(jìn)行附睪或睪丸的診斷性活檢，其參數(shù)可預(yù)測(cè)附睪或睪丸內(nèi)是否有精子。為了避免在其后的ICSI周期中反復(fù)的睪丸手術(shù)造成的血行阻斷和可能的永久性損害，可以將前期診斷性睪丸活檢獲取的精子或ICSI治療周期所剩余的微量活精子進(jìn)行冷凍保存，然后擇期行ICSI治療。本研究回顧性分析了本中心進(jìn)行的冷凍附睪或睪丸精子復(fù)蘇后行ICSI治療的有效性，并與新鮮睪丸精子相比較。

1、資料與方法

一般資料回顧性分析了2007年9月~2008年1月應(yīng)用冷凍復(fù)蘇后的附睪、睪丸精子行ICSI5個(gè)周期，新鮮附睪、睪丸精子行ICSI41個(gè)周期，共46個(gè)周期。46對(duì)男性梗阻性無精的不育夫婦中2例為不射精，11例為先天性輸精管缺如，6例為附睪結(jié)核，1例先天性右側(cè)輸精管缺如伴左側(cè)隱睪，其余均為原因不明的無精子癥。確定無精至少需3次射出的精液標(biāo)本離心處理并檢測(cè)沉淀。

卵巢刺激給予長效促性腺激素釋放激素類似物抑制垂體，重組促性腺激素刺激卵巢，誘導(dǎo)多個(gè)卵泡生長，B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，當(dāng)至少有2個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)到17mm后，停用GnRH-a和FSH；予以絨毛膜促性腺激素5000~10000IU肌注后32～36h后，在B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穹隆穿刺取卵。去除卵冠丘復(fù)合物外的顆粒細(xì)胞，MⅡ期成熟卵子待行ICSI。

精子的獲取PESA：局部麻醉下，患者采取仰臥位，常規(guī)消毒，鋪巾，將附睪固定于陰囊皮下，用已預(yù)先抽進(jìn)少量培養(yǎng)液的1mlBD注射器于肉眼直視下穿刺附睪頭并負(fù)壓抽吸，直至針管內(nèi)有淡黃色混濁附睪液體抽出。如未見液體抽出，則改變穿刺點(diǎn)。將附睪液注入培養(yǎng)皿，在倒置顯微鏡下尋找活動(dòng)精子。如鏡下未見活動(dòng)精子，則再次穿刺取精或行對(duì)側(cè)附睪穿刺，若仍無精子，則考慮TESE法取精。TESE：局部麻醉下，在陰囊皮膚做一個(gè)小切口，穿過腹膜鞘膜在白膜上做一個(gè)或多個(gè)小切口，切取一塊睪丸組織放入1006培養(yǎng)液中，室溫下保持15min，洗滌2次，在解剖顯微鏡下用兩個(gè)無菌BD注射器將睪丸組織撕碎，在倒置顯微鏡下檢驗(yàn)一滴懸液，檢測(cè)有無精子。

精子懸液的制備和冷凍檢測(cè)到活動(dòng)精子的附睪懸液或睪丸組織懸液，加入到含3ml1006培養(yǎng)液Falcon試管中，2次離心，棄上清，加入培養(yǎng)液，稀釋混勻。放入37℃%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，待行ICSI。如ICSI后所剩余精子數(shù)目足以再行ICSI，則將剩余精子加以冷凍；診斷性活檢則將精子2次離心洗滌處理后直接冷凍。將精子冷凍保護(hù)液8020和精子懸液按體積1∶1比例混勻，分裝入冷凍管中，在液氮?dú)庀嘀斜┞?5min，最后投入液氮冷凍保存。

冷凍精子復(fù)蘇和ICSI取卵日有成熟卵子即可復(fù)蘇附睪或睪丸冷凍精子，從液氮中取出冷凍管，迅速將其投入37℃水浴中5min，后用1006培養(yǎng)液離心洗滌2次，沉淀用培養(yǎng)液混勻，放入37℃%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h，在倒置顯微鏡下檢驗(yàn)一滴復(fù)蘇的懸液，檢測(cè)有無活動(dòng)精子。有活動(dòng)精子在取卵后4h行ICSI。

受精、胚胎評(píng)估和胚胎移植ICSI后18h觀察受精，正常受精可觀察到雙原核和兩個(gè)清晰或碎裂的極體，后24h、48h觀察胚胎分裂情況，取卵后第3天選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移植，移植后14天檢測(cè)HCG，如陽性，則為生化妊娠，再于移植后35天測(cè)血β-HCG升高，B超檢查顯示妊娠囊、見胎心搏動(dòng)則為臨床妊娠。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，P＜認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2、結(jié)果

回顧性分析了46對(duì)男性梗阻性無精的不育夫婦，共46個(gè)促排卵周期，行冷凍復(fù)附睪或睪丸精子ICSI5個(gè)周期，行新鮮附睪或睪丸精子ICSI41個(gè)周期。凍精組男性平均年齡為歲，女性平均年齡為歲；對(duì)照組男性平均年齡為歲，女性平均年齡為歲。見表1。對(duì)比兩組ICSI的受精率、卵裂率和優(yōu)胚率，未顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。凍精組共移植5個(gè)周期，妊娠4例，繼續(xù)妊娠3例，宮外孕1例；對(duì)照組共移植39個(gè)周期，放棄移植2個(gè)周期，妊娠17例，繼續(xù)妊娠15例，流產(chǎn)2例。凍精組臨床妊娠率和胚胎種植率明顯高于對(duì)照組，但差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。表1凍精組、對(duì)照組患者的一般情況表2凍精組、對(duì)照組的ICSI參數(shù)和臨床結(jié)局新晨范文網(wǎng)

3、討論

新鮮附睪或睪丸精子行ICSI被廣泛地應(yīng)用于無精子癥患者，使更多的無精子癥患者擁有了自己的遺傳學(xué)后代。然而這項(xiàng)技術(shù)主要缺點(diǎn)之一就是每一次ICSI操作都需要外科手術(shù)取精，大部分的不孕夫婦仍需行多個(gè)取卵和ICSI周期才會(huì)受孕，這不僅給患者帶來麻煩，還會(huì)損害附睪和睪丸［3］。為了解決這個(gè)問題，近些年來，診斷性活檢時(shí)冷凍附睪或睪丸精子后復(fù)蘇行ICSI逐漸應(yīng)用于臨床，而且取得了與新鮮附睪或睪丸精子ICSI周期相近的臨床結(jié)果［4，5］。我們是2007年7月初探PESA精子冷凍，8月初探TESE精子冷凍，并于2007年9月獲得第1例TESE精子冷凍復(fù)蘇后ICSI的臨床妊娠，2007年10月獲得第1例PESA精子冷凍復(fù)蘇后ICSI的臨床妊娠。本資料回顧性分析了診斷性附睪或睪丸活檢冷凍精子復(fù)蘇后行ICSI治療的有效性及妊娠結(jié)局，結(jié)果顯示冷凍復(fù)蘇的附睪或睪丸精子行ICSI所得受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、妊娠率和種植率與使用新鮮附睪或睪丸精子行ICSI相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與Gianaroli等［6］報(bào)道一致。盡管有報(bào)道證實(shí)［7］，附睪或睪丸精子的冷凍復(fù)蘇會(huì)對(duì)精子造成胞漿空泡增多，細(xì)胞核和胞質(zhì)膜皺縮或水腫、膜斷裂、頂體等損害，但冷凍也間接起到了一種篩選的作用，清除了大部分有缺陷的精子，只有那些活動(dòng)力較好、膜功能穩(wěn)定、代謝旺盛、染色體正常的精子才能經(jīng)受住低溫而得以保全，這種選擇，解釋了本研究凍精組臨床妊娠率和種植率高于對(duì)照組的結(jié)果，但本研究也與一些文獻(xiàn)報(bào)道相反［8］，考慮是否與樣本較少有關(guān)，還需增大樣本來進(jìn)一步證實(shí)。冷凍并沒有降低精子的發(fā)育潛能，使用冷凍附睪或睪丸精子ICSI的結(jié)果是可以接受的。ICSI治療周期前行診斷性睪丸活檢并凍存