免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課件

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課件免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室中性粒細(xì)胞的吞噬作用【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.熟悉中性粒細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)的原理和方法。2.通過(guò)本實(shí)驗(yàn)理解機(jī)體的非特異性免疫機(jī)制?！緦?shí)驗(yàn)原理】中性粒細(xì)胞具有吞噬殺菌功能，當(dāng)與顆粒性物質(zhì)（如葡萄球菌等）混合孵育一定時(shí)間后，顆粒性物質(zhì)被吞噬殺滅，根據(jù)吞噬率、吞噬指數(shù)可反映該細(xì)胞的吞噬功能。【實(shí)驗(yàn)材料】1.表皮（白色）葡萄球菌菌液（濃度6~10億/ml)。2.肝素溶液（25U/ml）；甲醇，堿性美藍(lán)（或瑞氏）染液。3.血紅蛋白吸管，凹玻片，載玻片，采血針，微量加樣器，濕盒，顯微鏡，恒溫培養(yǎng)箱，75%酒精，棉簽，香柏油，二甲苯等?！緦?shí)驗(yàn)方法】1、用微量加樣器，吸取肝素20ul加入潔凈凹玻片凹孔內(nèi)。2、用酒精棉簽消毒手指后，刺破皮膚，以血紅蛋白吸管取血40ul，立即放入盛有肝素的凹玻片凹孔內(nèi)，并充分混勻。3、用微量加樣器取葡萄球菌菌液20ul加入上述凹玻片凹孔內(nèi)，充分混勻。4、將凹玻片置于濕盒內(nèi)，30℃溫箱中30min，其間每隔10min搖勻一次。5、取一小滴上述混合液，置于載玻片上，用另一載玻片推成薄血片，待干。6、滴加甲醇固定3min，水洗。7、加堿性美藍(lán)染色1~2min，水洗，印干。8、置油鏡下觀察吞噬和未吞噬的白細(xì)胞并計(jì)數(shù)。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】

【實(shí)驗(yàn)思考】1、在吞噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌時(shí)，如何區(qū)別吞噬的細(xì)菌和粘附在吞噬細(xì)胞表面的細(xì)菌？2、簡(jiǎn)述機(jī)體非特異性免疫的概念及特點(diǎn)。凝集反應(yīng)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?．了解凝集反應(yīng)的原理、基本類型及其臨床意義。2．掌握玻片凝集實(shí)驗(yàn)、間接凝集實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果分析?！靖攀觥?/p>

在一定濃度的電解質(zhì)溶液中，顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集塊，稱為凝集反應(yīng)。凝集反應(yīng)是一種定性的檢測(cè)方法，也可以進(jìn)行半定量檢測(cè)。凝集反應(yīng)可分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)。由于凝集反應(yīng)方法簡(jiǎn)便，目前在臨床檢驗(yàn)中仍被廣泛應(yīng)用。

一、直接凝集反應(yīng)細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性抗原，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集，稱為直接凝集反應(yīng)。常用的凝集試驗(yàn)有玻片法和試管法兩種。玻片凝集試驗(yàn)——ABO血型鑒定玻片凝集試驗(yàn)為定性試驗(yàn)，一般用已知抗體作為診斷血清，與受檢顆?？乖?，如菌液或紅細(xì)胞抗原各加一滴在玻片上，混勻，數(shù)分鐘后即可用肉眼觀察凝集結(jié)果，出現(xiàn)凝集顆粒的為陽(yáng)性。此法簡(jiǎn)便，快速，適用于從病人標(biāo)本中分離得到的菌種的診斷或分型，也可用于紅細(xì)胞ABO血型的鑒定。

【實(shí)驗(yàn)原理】人類ABO血型抗原主要有A和B兩種，根據(jù)紅細(xì)胞表面這兩種抗原的有無(wú)可把血型分為四種。據(jù)此，將抗A和抗B抗體分別與待測(cè)紅細(xì)胞混合，抗A或（和）抗B抗體與紅細(xì)胞表面上的相應(yīng)抗原結(jié)合而引起紅細(xì)胞凝集，據(jù)其凝集情況便可判定出受試者的血型。ABO血型的劃分

紅細(xì)胞表面Ag血清中AbA型A抗BB型B抗AAB型A、B—、—O型—、—抗A、抗B【實(shí)驗(yàn)材料】1．ABO血型鑒定試劑盒內(nèi)含抗A分型試劑和抗B分型試劑各1支。2．一次性采血針1枚、潔凈玻片2塊、75％酒精、滅菌棉簽。3．84消毒液3．用酒精棉簽消毒被檢者手指尖端，以采血針刺破皮膚，稍加擠壓，使血液流出。用另一載玻片一端取適量血液加入抗抗A分型試劑，并混勻；用另一端再取適量血液加入抗抗B分型試劑，并混勻。用干棉簽止血。4．觀察紅細(xì)胞有無(wú)凝集發(fā)生。如有凝集，可見(jiàn)紅細(xì)胞凝集成塊；無(wú)凝集，紅細(xì)胞呈均勻分散。判定結(jié)果后把玻片放入消毒液中。AB【實(shí)驗(yàn)方法】1．取潔凈載玻片1塊，并標(biāo)記（如圖）2．將抗A、B分型試劑分別加1滴于標(biāo)記有A、B的玻片兩側(cè)?？笰抗B抗A分型試劑側(cè)抗B分型試劑側(cè)血型+—A—+B++AB——O“＋”表示紅細(xì)胞凝集，“－”表示紅細(xì)胞未凝集【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】記錄受檢者紅細(xì)胞凝集情況，根據(jù)ABO血型鑒定表(下表)，判斷受檢者的血型。

ABO血型鑒定表二、間接凝集反應(yīng)

將可溶性抗原或抗體先吸附于適當(dāng)大小的顆粒性載體表面（這種載體與免疫無(wú)關(guān)），然后與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合，在適量的電解質(zhì)存在下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應(yīng)。根據(jù)載體的不同可將間接凝集反應(yīng)分為：間接血細(xì)胞凝集試驗(yàn)、間接乳膠凝集試驗(yàn)（及間接乳膠凝集抑制試驗(yàn)）和金黃色葡萄球菌協(xié)同凝集試驗(yàn)等。間接凝集抑制試驗(yàn)——妊娠試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】可溶性抗原致敏的乳膠顆粒與相應(yīng)抗體作用可使乳膠顆粒凝集，此為間接乳膠凝集試驗(yàn)。若使抗體先與可溶性抗原作用，再加入該抗原致敏的乳膠顆粒，則乳膠凝集被抑制，此為間接乳膠凝集抑制試驗(yàn)。孕婦尿中絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。HCG與抗HCG抗體先作用后，再加入HCG致敏的乳膠顆粒，不出現(xiàn)凝集反應(yīng)，此為妊娠試驗(yàn)陽(yáng)性；非孕婦尿中HCG含量不足以消耗掉抗HCG抗體，抗體與后加入的HCG致敏乳膠結(jié)合呈現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則妊娠試驗(yàn)陰性?！緦?shí)驗(yàn)材料】1．妊娠診斷試劑盒：內(nèi)含抗血清（抗HCG）、乳膠抗原（HCG致敏）各一支2．待檢尿、孕婦尿、正常尿。3．有格玻片和毛細(xì)吸管等?！緦?shí)驗(yàn)方法】1．在玻片的第1、第2和第3格內(nèi)分別加1滴正常尿、待檢尿及孕婦尿。2．每格內(nèi)加入妊娠診斷試劑抗血清1滴。輕輕搖動(dòng)1~2min使其充分混勻。3．每格加入乳膠抗原1滴，輕輕搖動(dòng)玻片3~5min后觀察結(jié)果，記錄各標(biāo)本有無(wú)凝集現(xiàn)象。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】孕婦尿格呈均勻渾濁乳狀液，無(wú)凝集，妊娠試驗(yàn)陽(yáng)性；正常尿格出現(xiàn)白色細(xì)小凝集物，隨時(shí)間延長(zhǎng)凝集物變成小塊狀，妊娠試驗(yàn)陰性。待檢尿若為乳狀液，妊娠試驗(yàn)陽(yáng)性；若出現(xiàn)凝集，則妊娠試驗(yàn)陰性?！咀⒁馐马?xiàng)】1．試驗(yàn)所用診斷試劑用前應(yīng)充分搖勻，而且應(yīng)在有效期內(nèi)使用。2．加樣用的滴管及混勻用的牙簽不能共用。3．加樣不宜太多，玻片應(yīng)始終保持水平，以防兩格之反應(yīng)液相混。【實(shí)驗(yàn)思考】1．記錄血型鑒定試驗(yàn)、乳膠妊娠診斷試驗(yàn)的材料、方法及結(jié)果判定（可用圖示或表格方式表示）。2．直接凝集試驗(yàn)與間接凝集試驗(yàn)有何不同？3．在各凝集試驗(yàn)中都設(shè)有相應(yīng)對(duì)照，有何意義？若對(duì)照出現(xiàn)異常如何分析及解決？

沉淀反應(yīng)

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?．掌握對(duì)流免疫電泳的基本原理、方法。2．熟悉瓊脂單向擴(kuò)散，雙向擴(kuò)散的基本原理、方法、結(jié)果分析及臨床用途。3．了解火箭免疫電泳的基本原理、方法?！靖攀觥靠扇苄钥乖缪濉⒍舅?、細(xì)菌浸出液等與相應(yīng)抗體結(jié)合，當(dāng)兩者比例合適、并有適量電解質(zhì)存在時(shí)，形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物或沉淀線，稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)是臨床上最常用、最基本的方法之一。它的種類較多，可分為瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳試驗(yàn)、環(huán)狀沉淀試驗(yàn)及絮狀沉淀試驗(yàn)等。一、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)利用可溶性抗原與相應(yīng)抗體在半固體瓊脂內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)散，當(dāng)兩者比例合適時(shí)，就出現(xiàn)白色沉淀線，為陽(yáng)性反應(yīng)。本試驗(yàn)可在試管內(nèi)、平皿中以及玻片上的瓊脂內(nèi)進(jìn)行操作。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)可分為單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。(一)單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(示教)(二)雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(示教)二、對(duì)流免疫電泳【實(shí)驗(yàn)原理】帶電的膠體顆?？稍陔妶?chǎng)中移動(dòng)，移動(dòng)方向與膠體顆粒所帶電荷有關(guān)。多數(shù)蛋白質(zhì)抗原在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在電泳時(shí)從負(fù)極向正極移動(dòng)?？贵w屬球蛋白，在堿性緩沖液只帶微弱的負(fù)電荷，而且相對(duì)分子質(zhì)量較大，電泳力較小，在瓊脂電滲力作用下反而由正極向負(fù)極移動(dòng)。這樣就使抗原和抗體定向?qū)α?，在兩孔間相遇時(shí)發(fā)生反應(yīng)，并在比例合適處形成肉眼可見(jiàn)的白色沉淀線。這種將雙向瓊脂擴(kuò)散和電泳技術(shù)結(jié)合在一起的方法稱為對(duì)流免疫電泳?！緦?shí)驗(yàn)材料】1．電泳緩沖液：pH8.6巴比妥-鹽酸緩沖液。2．抗體：抗AFP。3．抗原：AFP陽(yáng)性血清、待檢病人血清。4．1％瓊脂用pH8.6巴比妥-鹽酸緩沖液配制，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

5．電泳儀、電泳槽、載玻片、打孔器、10ml吸管、移液器、移液頭。

【實(shí)驗(yàn)方法】

1．制板2．打孔3．加樣將抗原加入瓊脂板上有標(biāo)記孔側(cè)的小孔中，抗體加入另一側(cè)小孔中，以加滿為度，不可溢出孔外。(如圖示)4．電泳將加好樣品的瓊脂板置電泳槽上，抗原側(cè)置陰極端，抗體孔側(cè)置陽(yáng)極端。搭好橋后，接通電源，控制電壓6～10V/cm板長(zhǎng)，電泳約30～60min。5．關(guān)閉電源，取出瓊脂板，觀察結(jié)果。

AgAbAgAb標(biāo)記孔沉淀線【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】將玻片對(duì)著強(qiáng)光源，先觀察AFP陽(yáng)性血清孔與抗體孔之間的白色沉淀線，然后再觀察待檢血清孔與抗體孔之間是否也有沉淀線出現(xiàn)，如有沉淀線，則表示AFP試驗(yàn)陽(yáng)性，否則AFP試驗(yàn)為陰性?！咀⒁馐马?xiàng)】1．電泳時(shí)電流不宜過(guò)大，以免蛋白變性。2．抗原和抗體的電極方向不能搞錯(cuò)。3．抗原和抗體的濃度要適當(dāng)，抗原太濃或太稀都不易出現(xiàn)沉淀線。4．電泳所需時(shí)間與孔間距離有關(guān)，距離越大，電泳時(shí)間越長(zhǎng)?！緦?shí)驗(yàn)思考】1．單向擴(kuò)散與火箭電泳、雙向擴(kuò)散與對(duì)流免疫電流比較各有何特點(diǎn)？2．對(duì)流免疫電泳中，抗原為何放陰極端，抗體為何放陽(yáng)極端？

外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?．熟悉免疫細(xì)胞分離的常用方法。

2．掌握外周血單個(gè)核細(xì)胞分離方法的原理、操作規(guī)程?！緦?shí)驗(yàn)原理】人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。單個(gè)核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其他細(xì)胞不同。因此利用一種介于1.075～1.090之間而近于等滲的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque）混合分離液作密度梯度離心，離心后不同比重的血細(xì)胞在分離液中呈梯度分布。從而分離出PBMC?！緦?shí)驗(yàn)材料】1．肝素溶液用生理鹽水將肝素配成125～250U/ml的溶液，置4℃下保存?zhèn)溆谩?．淋巴細(xì)胞分層液市售或自配，20℃時(shí)密度應(yīng)為(1.077±0.001)g/L。3．Hanks平衡鹽溶液（HBSS）或磷酸鹽緩沖液（PBS）pH7.2～7.4。4．完全RPMI-1640培養(yǎng)液。5．15ml或50ml錐底離心管。6．水平離心機(jī)，顯微鏡。7．玻璃吸管，滴管，細(xì)胞計(jì)數(shù)板等。8．2％臺(tái)盼藍(lán)染液?！緦?shí)驗(yàn)方法】

1．采集靜脈血若干毫升（隨需要而定），注入盛有肝素的無(wú)菌小瓶中（每ml全血加0.1ml肝素溶液），加蓋后立即輕輕搖勻，使血液抗凝。2．用吸管加入等體積的室溫HBSS或PBS，使血液等倍稀釋。（此步驟亦可省去）3．吸取淋巴細(xì)胞分層液（每10ml稀釋血加5m1分層液）置于15m1或50m1離心管中，然后將離心管傾斜45°角，將稀釋血液在距分層液界面上1cm處沿試管壁緩慢加至分層液上面。應(yīng)注意保持兩界面清晰，勿使血液混入分層液內(nèi)。

4．將離心管置水平式離心機(jī)內(nèi)，在18～20℃下，以2000r/min離心30min，離心后，