從細(xì)胞因子及能量代謝角度研究慢性心力衰竭治療的新課件

心血管藥理講座從細(xì)胞因子及能量代謝角度研究慢性心力衰竭治療的新靶點(diǎn)及干預(yù)策略心血管藥理講座從細(xì)胞因子及能量代謝角度研究慢性心力衰竭治療1主要介紹內(nèi)容一、研究慢性心衰治療新策略的必要性二、改善心肌能量代謝-治療心衰的關(guān)鍵三、新策略及靶點(diǎn)：細(xì)胞因子、能量代謝與心力衰竭四、TNF-α及其受體—心衰的治療靶點(diǎn)及希望？五、抑制TNF-α與TNF-R1的結(jié)合活性的合成的優(yōu)選多肽Pep3治療心衰效果評(píng)價(jià)六、進(jìn)一步研究思路2主要介紹內(nèi)容一、研究慢性心衰治療新策略的必要性22精品資料精品資料3你怎么稱呼老師？如果老師最后沒有總結(jié)一節(jié)課的重點(diǎn)的難點(diǎn)，你是否會(huì)認(rèn)為老師的教學(xué)方法需要改進(jìn)？你所經(jīng)歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽(yáng)曬，也不怕那風(fēng)雨狂，只怕先生罵我笨，沒有學(xué)問無顏見爹娘……”“太陽(yáng)當(dāng)空照，花兒對(duì)我笑，小鳥說早早早……”從細(xì)胞因子及能量代謝角度研究慢性心力衰竭治療的新課件4世界衛(wèi)生組織08年10月發(fā)布了全球疾病狀況的最新評(píng)估報(bào)告，心血管疾病是當(dāng)前導(dǎo)致人類死亡的最主要原因。一、研究慢性心衰治療新策略的必要性心血管疾病腫瘤傳染病(29%)心血管疾病的主要死亡原因—心力衰竭發(fā)病率高：國(guó)內(nèi)患病率0.8%～0.9%，患者約1200萬,而且每年呈現(xiàn)50萬遞增的趨勢(shì)；預(yù)后差：每年死亡>20萬，五年死亡率>50％；費(fèi)用大：在歐美，治療費(fèi)用占整個(gè)衛(wèi)生支出的2%，是腫瘤的2倍。世界衛(wèi)生組織08年10月發(fā)布了全球疾病狀況一、研究慢性心衰治5死亡代償期失代償期惡化期結(jié)構(gòu)和功能的改變---重塑高血壓，冠心病遺傳，心肌病瓣膜病，先心病****心力衰竭心力衰竭的誘因和病理過程6死亡代償期失代償期惡化期結(jié)構(gòu)和功能的改變---重塑高血壓，冠6分子機(jī)制跨膜信號(hào)傳遞胞外刺激基因表達(dá)活化細(xì)胞形態(tài)、功能改變血流動(dòng)力學(xué)因素神經(jīng)-體液因素CARDIACHYPERTROPHY:TheGood,theBad,andtheUgly.AnnuRevPhysiol,2003.分子機(jī)制跨膜信號(hào)傳遞胞外刺激基因表達(dá)活化細(xì)胞形態(tài)、功能改變7激素、藥物、神經(jīng)遞質(zhì)膜受體第二信使

Ca2+離子通道活性肽心力

衰竭心律失常線粒體活性氧心臟病相關(guān)基因活性肽(1)(1)心力衰竭心力衰竭可能的發(fā)展基礎(chǔ)8激素、藥物、膜受體第二信使離子通道活性肽心力

衰竭心律失常線8FirstStepRef:Webster,MD,PhD:Acne.Dermatol1996,8:237-268慢性心衰治療理念的進(jìn)步70年代：改善血流動(dòng)力學(xué)紊亂：強(qiáng)心、利尿、擴(kuò)血管SecondStep90年代：抑制神經(jīng)體液因子：β阻滯劑、ACEI/ARB

ThirdStep21世紀(jì)：心肌代謝療法可望成為CHF治療的新靶點(diǎn)。FirstStepRef:Webster,MD,PhD:9任何減少能量消耗的心力衰竭療法，如β受體阻滯劑，ACEI，ARB均可以改善心衰患者的預(yù)后。增加能量消耗的藥物，如正性肌力藥物，則增加心衰的死亡率。“衰竭的心臟是一臺(tái)缺乏燃料的發(fā)動(dòng)機(jī)”能量缺乏可能是心衰的重要發(fā)病機(jī)制NeubauerS.NEnglJMed,2007,356:1140-1151.二、改善心肌能量代謝-治療心衰的關(guān)鍵調(diào)節(jié)心肌能量代謝有望成為治療心衰的新策略任何減少能量消耗的心力衰竭療法，如β受體阻滯劑，ACEI，A10

心臟耗能位居所有器官之首，每天消耗6kgATP，搏動(dòng)約10萬次，向全身泵出10噸血液。心臟通過能量代謝將儲(chǔ)存于脂肪酸或葡萄糖中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，為心臟收縮和舒張?zhí)峁┠芰?。若能量產(chǎn)生和利用的效率發(fā)生改變，心臟便會(huì)出現(xiàn)功能障礙。心臟的能量代謝心臟耗能位居所有器官之首，每天消耗6kgATP，搏112、糖酵解（極少）1、線粒體氧化代謝脂肪酸（60%-90%）葡萄糖（10%-40%）正常心肌的能量代謝ATP來源2、糖酵解（極少）1、線粒體氧化代謝脂肪酸（60%-12正常心肌的能量代謝底物代謝氧化磷酸化能量利用正常心肌的能量代謝底物代謝氧化磷酸化能量利用13正常心肌的能量代謝過程（一）：底物的利用丙酮酸葡萄糖脂肪酸糖酵解脂酰CoA合成酶乙酰CoA丙酮酸脫氫酶（PDH）有氧狀態(tài)脂酰CoA脂酰CoAβ-氧化三羧酸循環(huán)CO2+NADHMitochondriacytoplasmBlood肉毒脂酰轉(zhuǎn)移酶（CPT）正常心肌的能量代謝過程（一）：底物的利用丙酮酸葡萄糖脂肪酸糖14正常心肌的能量代謝過程（二）：氧化磷酸化線粒體內(nèi)膜ⅠⅡⅢⅣQH+H+H+O2H2OH+ⅤATP合酶ADP+PiATPNADH＋HNAD＋FADH2FAD三羧酸循環(huán)游離脂肪酸β氧化Mitochondria正常心肌的能量代謝過程（二）：氧化磷酸化線粒體內(nèi)膜ⅠⅡⅢⅣQ15主要表現(xiàn)：2004年，VanBilsen等提出心肌代謝重構(gòu)的概念。

VanBilsenM,etal.CardiovascRes,2004,61:218-226心肌代謝重構(gòu)（metabolicremodeling）

由心肌細(xì)胞糖類和脂肪等物質(zhì)代謝紊亂引起心臟能量代謝途徑改變，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常的現(xiàn)象。主要表現(xiàn)：2004年，VanBilsen等提出心肌代謝重16脂肪酸氧化作用受損，主要的心肌能量來源從脂肪酸β氧化變?yōu)樘墙徒狻Ｖ貥?gòu)過程至失代償狀態(tài)，心肌能量缺乏。RazeghiP,etal.Circulation,2001,102:2923-2931.PaolissoG,etal.Metabolism,1994,43:174–179.1心肌底物利用變化衰竭心肌的能量代謝FFA氧化率正?；蛟黾樱咸烟菙z取和糖酵解可能加速，心肌細(xì)胞處于代償狀態(tài)。

心衰早期

心衰晚期

脂肪酸氧化作用受損，主要的心肌能量來源從脂肪酸β氧化變?yōu)樘墙?7脂肪酸氧化受損可能繼發(fā)于線粒體結(jié)構(gòu)紊亂。PDH和CPT-1活性改變脂肪酸氧化的基因表達(dá)下調(diào)BilsenMV.CardiovasularRes.2009,81:420-428衰竭心肌的能量代謝1心肌底物利用變化脂肪酸氧化受損可能繼發(fā)于線粒體結(jié)構(gòu)紊亂。BilsenMV.18ATP產(chǎn)生減少，心肌收縮、舒張功能障礙2

氧化磷酸化受損線粒體結(jié)構(gòu)、數(shù)量改變電子傳遞鏈活性降低ATP合酶效能降低解偶聯(lián)蛋白表達(dá)增強(qiáng)IdeT,etal.CircRes,2001,88:529-35.QuigleyAF,etal.JCardFail,2000,6:47-55.CasademontJ,etal.HeartFailRev,2002;7:131-9.衰竭心肌的能量代謝ATP產(chǎn)生減少，心肌收縮、舒張功能障礙2氧化磷酸化受損193ATP轉(zhuǎn)移和利用受損線粒體內(nèi)膜ANT蛋白表達(dá)下降cytoplasmATPADP+線粒體肌酸激酶+肌酸（Cr）

磷酸肌酸（PCr）衰竭心肌的能量代謝3ATP轉(zhuǎn)移和利用受損線粒體內(nèi)膜ANT蛋白表達(dá)下20PPARα調(diào)節(jié)心肌線粒體功能及脂肪酸氧化的重要核轉(zhuǎn)錄因子。PPARα基因敲除鼠心肌脂肪酸氧化明顯降低，而轉(zhuǎn)基因鼠心肌脂肪酸氧化增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，心衰患者心肌組織PPARα的表達(dá)較正常心肌組織下降54％，PPARα受損可能導(dǎo)致心肌能量匱乏。KarbowskaJ,etal.CellMolBiolLett,2003,8:49-53衰竭心肌能量代謝的基因調(diào)節(jié)重要的核受體轉(zhuǎn)錄因子--PPARα

PPARα調(diào)節(jié)心肌線粒體功能及脂肪酸氧化的重要核轉(zhuǎn)錄因子。K21外源性配體（調(diào)脂藥）內(nèi)源性配體（長(zhǎng)鏈脂肪酸）PPARαPPRE脂肪酸氧化（FAO）基因CD36/FATFABPFACSmCPT-1MCAD,LCADUCP3細(xì)胞核PPARα衰竭心肌能量代謝的基因調(diào)節(jié)StanleyWC.PhysiolRev.2005,85:1093-1129外源性配體（調(diào)脂藥）內(nèi)源性配體PPARαPPRE脂肪酸氧22重要的核轉(zhuǎn)錄共活化因子—PGC-1α衰竭心肌能量代謝的基因調(diào)節(jié)可與PPARα等多種核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合PGC-1α生物學(xué)效應(yīng)脂肪酸氧化增強(qiáng)葡萄糖氧化減弱線粒體生物合成增加重要的核轉(zhuǎn)錄共活化因子—PGC-1α衰竭心肌能量代謝的基23ZhouSG,LiuPQ*（劉培慶，通訊作者）.ProteomicAnalysisofHypertension-InducedLeftVentricularHypertrophybyTwo-DimensionalDifferenceGelElectrophoresisandMassSpectrometry"JProteomeRes,2006,5(11):2901-2908(IF6.92)24①SHR與2k2cRHR心肌肥大大鼠心肌組織蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了18個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中12個(gè)是能量代謝密切的酶，如α-烯醇化酶、短鏈脂酰輔酶A脫氫酶、NADH脫氫酶α亞復(fù)合體10、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶等研究基礎(chǔ)ZhouSG,LiuPQ*（劉培慶，通訊作者）.Pro24研究了NAD合成的限速酶在心肌肥大中點(diǎn)變化及調(diào)控機(jī)制Nmnat2protectscardiomyocytesfromhypertrophyviaactivationofSIRT6.Nmnat3protectscardiomyocytesfromhypertrophyviaactivationofSIRT3.研究了NAD合成的限速酶在心肌肥大中點(diǎn)變化及調(diào)控機(jī)制25NAD+的生物合成尼克酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（Nampt）和煙酰胺單核苷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶（Nmnat）對(duì)NAD+的合成起到了關(guān)鍵的催化作用。NAD+的生物合成尼克酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（Nampt）和26NAD+的轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞分布NAD+的轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞分布27從細(xì)胞因子及能量代謝角度研究慢性心力衰竭治療的新課件28③證明了PPARα、NFATc4及GATA-4之間相互作用在心肌肥大中的意義。29③證明了PPARα、NFATc4及GATA-4之間相互作用29②心衰過程中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PGC-1α、RIP140表達(dá)與能量代謝關(guān)鍵指標(biāo)的關(guān)系30②心衰過程中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PGC-1α、RIP140表達(dá)30增加線粒體生物合成NRF(核呼吸因子)PGC-1α--PPAR線粒體生物合成。此二者是調(diào)控心肌脂肪酸分解和線粒體供能的樞紐心肌代謝療法—底物的調(diào)節(jié)增加線粒體生物合成NRF(核呼吸因子)線粒體生物合成。此31心肌代謝的爭(zhēng)議與思考脂肪酸葡萄糖心肌肥厚和心衰時(shí)，能量代謝底物改變何種程度是代償性的，何種程度是失代償性的？脂肪酸氧化抑制在何時(shí)？抑制到什么程度?可以改善心衰。心衰時(shí)葡萄糖代謝可以代償脂肪酸氧化降低的能量不足嗎？心衰心肌代謝心衰心肌代謝的爭(zhēng)議與思考脂肪酸葡萄糖心肌肥厚和心衰時(shí)，能量代32代謝重構(gòu)在心衰治療中的意義

拮抗神經(jīng)體液：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、β-受體阻滯劑心衰缺能－底物的調(diào)節(jié)：

1）增加葡萄糖氧化：曲美他嗪（Trimetazidine,TMZ)

2）抑制脂肪酸氧化：L-卡尼丁(L-carnitine)3）增強(qiáng)呼吸鏈功能：輔酶Q10

4）補(bǔ)充磷酸肌酸

5）Potentialtherapy:promotemitochondriabiogenesis代謝重構(gòu)在心衰治療中的意義拮抗神經(jīng)體液：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶33三.新策略及靶點(diǎn)

細(xì)胞因子受體、能量代謝調(diào)控？心衰過程中增高的細(xì)胞因子、神經(jīng)激素及生長(zhǎng)因子形成網(wǎng)絡(luò)，其錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)紊亂決定了心衰病理過程的復(fù)雜性，針對(duì)某一靶點(diǎn)或單一環(huán)節(jié)的藥物往往難以起到理想的治療心衰效果。靶向細(xì)胞因子受體及心肌能量代謝關(guān)鍵環(huán)節(jié)的藥物具有重要的研發(fā)前景，心衰新靶點(diǎn)的干預(yù)正在成為治療心衰的希望。34ArdehaliH,etal..EurJHeartFail.2012;14(2):120-9.三.新策略及靶點(diǎn)

細(xì)胞因子受體、能量代謝調(diào)控？心衰過程中增高34經(jīng)典的神經(jīng)-體液因素

腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)交感神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)皮素系統(tǒng)

胰島素抵抗細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子經(jīng)典的神經(jīng)-體液因素35

血管平滑肌細(xì)胞成纖維細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞心肌細(xì)胞免疫細(xì)胞肥大凋亡舒縮增殖膠原的合成和分泌合成細(xì)胞因子調(diào)控心肌細(xì)胞血管生成炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)心臟微循環(huán)炎癥反應(yīng)血管平滑成纖維細(xì)胞血管內(nèi)皮免疫細(xì)胞肥大增殖血管生成炎癥反應(yīng)36細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)與炎癥反應(yīng)通路引自:SunSC.ThenoncanonicalNF-κBpathway.ImmunolRev.2012,246(1):125-4037細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)與炎癥反應(yīng)通路引自:SunSC.Theno37TNF-α及其受體—炎癥性疾病重要治療靶點(diǎn)！TNF-α是諸多炎性相關(guān)疾病細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵部分，也是與能量代謝障礙密切相關(guān)的細(xì)胞因子，TNF-α主要通過TNFR1介導(dǎo)胞內(nèi)信息傳遞及細(xì)胞功能改變，是炎癥性疾病重要治療靶點(diǎn)。38ChenG,GoeddelDV.TNF-R1signaling:abeautifulpathway.Science.2002，296:1634TNF-α及其受體—炎癥性疾病重要治療靶點(diǎn)！TNF-α是諸多38

以TNF-α孵育AC16（人源性心肌細(xì)胞株）或H9c2細(xì)胞（心肌細(xì)胞株），可以明顯下調(diào)丙酮酸脫氫酶激酶4、PGC-1α、肉堿脂?；D(zhuǎn)移酶Ⅰ(CPT-Ⅰ)，誘導(dǎo)葡萄糖氧化率顯著增加，同時(shí)增加MCP-1及IL-6表達(dá)增加，該作用主要通過NFκB及P38信號(hào)通路。心臟特異性過表達(dá)TNF-α小鼠(Musmusculus)也表現(xiàn)出明顯的PGC-1α表達(dá)下調(diào)。GaoF,etal.JCardiovascPharmacol.2012;59(6):500-6PalomerXetal.CardiovascRes2009;81:703-712四、TNF-α及其受體—心衰的治療靶點(diǎn)及希望？（一）TNF-α與心肌能量代謝

以TNF-α孵育AC16（人源性心肌細(xì)胞株）39SchematicrepresentationofthemechanismsinvolvedinthemetabolicdysregulationofAC16cellstreatedwithtumournecrosisfactor-α.PalomerXetal.CardiovascRes2009;81:703-712PublishedonbehalfoftheEuropeanSocietyofCardiology.Allrightsreserved.?TheAuthor2008.Forpermissionspleaseemail:journals.permissions@Schematicrepresentationofth40（二）TNF-α及其受體—心衰的治療靶點(diǎn)及希望？普遍支持慢性心衰患者循環(huán)血中TNF-α水平顯著增高，且增高的程度與CHF的嚴(yán)重程度、心功能分級(jí)及死亡率呈正相關(guān)。不同病因間（高血壓、冠心病、風(fēng)濕性心臟病、擴(kuò)張型心肌病）所導(dǎo)致的心力衰竭循環(huán)中TNF-α的含量無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示循環(huán)血中TNF-α增高參與心衰的基本病理過程。LevineB,etal.NEnglJMed.1990;323(4):236-41.KosarF,etal.EurJHeartFail.2006;8(3):270-4.SharmaR,etal.AmJCardiol.2003;15;92(2):188-93.411、臨床研究資料（二）TNF-α及其受體—心衰的治療靶點(diǎn)及希望？普遍支持慢性412.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平研究1.

轉(zhuǎn)TNF-α基因小鼠出現(xiàn)心衰表現(xiàn)，提示TNF-α與心衰的密切關(guān)系2.TNF基因敲除(TNF-/-)小鼠對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄介導(dǎo)的心臟重構(gòu)、炎癥反應(yīng)等均比C57背景鼠輕得多，而且心功能也明顯改善3.灌注TNF-α可導(dǎo)致大鼠心肌收縮性明顯下降以及心室過度舒張。4.心衰時(shí)心臟既是TNF-α作用的靶器官，也是其生物合成的場(chǎng)所。TNF-α的表達(dá)水平與心衰的嚴(yán)重性相關(guān)，心肌表達(dá)TNF-α受體。

ShustermanV,etal.AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2010;298(2):H440-50JobeLJ,etal.AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2009;297(4):H1462-8；SunM,etal.Circulation.2007;115(11):1398-407.422.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平研究1.轉(zhuǎn)TNF-α基因小鼠出現(xiàn)心衰表423.靶向TNF-α途徑治療心衰現(xiàn)狀已上市的TNF-α抑制劑：依那西普（Etanercept）、英利昔單抗（Infliximab）和阿達(dá)木單抗（Adalimumab）等大分子蛋白藥物。其機(jī)制為競(jìng)爭(zhēng)性和TNF-α結(jié)合，阻斷TNF-α和細(xì)胞表面TNF受體結(jié)合，降低TNF-α活性，為非選擇性拮抗TNF-α作用。其臨床適應(yīng)癥主要為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，以往缺乏單純治療心衰治療的大樣本臨床資料。Nurmoham等近期對(duì)10.9萬RA患者（其中4.8萬例暴露于抗TNF治療)的大樣本回顧性研究明確：抗TNF治療與未用TNF治療相比顯著減少包括心衰在內(nèi)的多種CV事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

Nurmoham,etal.AnnRheumDis2012;71(Suppl3):52

。433.靶向TNF-α途徑治療心衰現(xiàn)狀已上市的TNF-α抑制劑43（三）研究TNFR1亞型及胞外區(qū)的意義TNF受體:目前發(fā)現(xiàn)的有TNFR1和TNFR2，兩種都為跨膜蛋白。TNFR1及TNFR2胞外區(qū)有30%同源性，胞內(nèi)區(qū)無同源性，提示二者介導(dǎo)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,TNFR1是TNF-α引發(fā)炎癥反應(yīng)的主要受體，也是心衰過程中心臟的主要表達(dá)受體。TNFR2不能直接激活胞內(nèi)信號(hào)通路,亦有研究認(rèn)為激活TNFR2有助于心衰治療。利用高選擇性多肽或選擇性小分子抑制劑區(qū)分TNFR1不同胞外TNF-α結(jié)合區(qū)，分別研究TNFR1不同胞外區(qū)介導(dǎo)的相關(guān)的胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制，有望發(fā)現(xiàn)適合治療心衰新的靶點(diǎn)、信號(hào)途徑及相關(guān)靶基因。44（三）研究TNFR1亞型及胞外區(qū)的意義TNF受體:目前發(fā)現(xiàn)的44ChenG,GoeddelDV.TNF-R1signaling:abeautifulpathway.Science.2002;296(5573):1634-5TNF受體途徑1）TNF－α與TNFR1胞外區(qū)結(jié)合，使TNFR1形成三聚體。

2）三聚體TNFR1通過其聚集的胞內(nèi)區(qū)死亡結(jié)構(gòu)域（DD）招募下游信號(hào)傳導(dǎo)蛋白（TRADD、FADD、TRAF2、RIP）。

3）下游信號(hào)傳導(dǎo)蛋白形成復(fù)合體，激活下游的caspase8以及各種效應(yīng)分子caspases，產(chǎn)生級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)，最終引起靶細(xì)胞凋亡。

4）TNF還可通過下游激活蛋白R(shí)IP，TRAF2等，分別激活NIK和MEKK，從而激活NF－KB和c－Jun，抑制細(xì)胞凋亡。ChenG,GoeddelDV.TNF-R1sig45TNFR1主要通過第2、3功能區(qū)（CRD2,CRD3)與TNF-α相互識(shí)別，TNF-α與TNFR1的識(shí)別的兩個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)分別位于CRD2和CRD3的A1模塊,關(guān)鍵的作用位點(diǎn)存在于A1模塊的疏水區(qū),目前對(duì)于TNFR1的研究及TNFR1抑制劑的設(shè)計(jì)和開發(fā)主要集中在這2個(gè)功能區(qū)，特別是針對(duì)CRD3已研究出選擇性及抗炎效價(jià)較高的環(huán)肽抑制劑（YCWSQYLCY,C-C），但并沒有進(jìn)行治療心衰效果評(píng)價(jià)。

TakasakiW,etal.NatBiotechnol1997;15:1266-70MukaiY,etal.JMolBiol2009;385:1221-9

46TNFR1主要通過第2、3功能區(qū)（CRD2,CRD3)與T46CRD4亦有非常保守的A1模塊結(jié)構(gòu)，針對(duì)于CRD4A1模塊結(jié)構(gòu)疏水區(qū)域的作用研究對(duì)于客觀認(rèn)識(shí)TNF-α和TNFR1的結(jié)合模式我們以TNF-R1的胞外CRD4區(qū)的A1模塊疏水區(qū)為模板，設(shè)計(jì)合成TNFR1衍生小肽序列，并對(duì)其進(jìn)行活性測(cè)試，篩選出對(duì)TNF-αCRD4區(qū)有較高親和力，可以通過對(duì)TNF-α的識(shí)別及阻斷作用抑制TNF-α信號(hào)傳導(dǎo)較高活性肽Pep3，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示出比Etanercept更好的治療心衰效果，申請(qǐng)并已獲得專利授權(quán)。CaoY,LiuP*.AsyntheticpeptidederivedfromA1moduleinCRD4ofhumanTNFreceptor-1inhibitsbindingandproinflammatoryeffectofhumanTNF-alpha,Inflammation,2009,32:139-145一種多肽及其在制備抗心衰和炎性反應(yīng)藥物中的應(yīng)用，中國(guó)發(fā)明專利授權(quán)號(hào)：ZL200810218732.2；發(fā)

明

(設(shè)計(jì))人：劉培慶;蔣建敏;曹穎男CRD4亦有非常保守的A1模塊結(jié)構(gòu)，針對(duì)于CRD4A147四.針對(duì)TNF-α及其受體TNFR1的研究我們利用心梗致心衰大鼠模型比較了Etanercept和我們前期篩選到的TNFR1CRD4區(qū)抑制劑Pep3，發(fā)現(xiàn)盡管Etanercept抑制TNF-α活性作用高于Pep3，但改善心臟功能作用不及Pep3。TNFR1可與TNF-α結(jié)合的胞外端包括CRD3區(qū)和CRD4區(qū)，是否TNF-α與TNFR1CRD3區(qū)、CRD4區(qū)結(jié)合介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制、靶基因及轉(zhuǎn)錄調(diào)控不同？針對(duì)TNF-α受體及亞型的選擇性抑制更有利于心衰治療？

四.針對(duì)TNF-α及其受體TNFR1的研究我們利用心梗致心衰48(一）建立了針對(duì)TNFR1CRD4區(qū)多肽合成、多肽表征鑒定及活性篩選體系1.肽庫(kù)的設(shè)計(jì)及多肽合成以I型TNF受體（TNFR1）N端胞外第四區(qū)域（Domain4）的天然結(jié)構(gòu)為目標(biāo)，應(yīng)用組合化學(xué)、多肽固相合成技術(shù)，結(jié)合現(xiàn)代合成、分離純化技術(shù)，建立各種不同的多肽衍生物，通過各種波譜分析及HPLC等確定它們的結(jié)構(gòu)純度。小分子肽的合成采用固相Fmoc法，選用2-Chlorotritylchloride樹脂作為固相載體，N,N-二甲基甲酰胺做溶劑，縮合試劑選用二異丙基碳二亞胺，使用ReagentB切除肽鏈和側(cè)鏈保護(hù)基，有關(guān)合成技術(shù)已經(jīng)完善。49(一）建立了針對(duì)TNFR1CRD4區(qū)多肽合成、多肽表征鑒定49圖1.

固相Fmoc法合成肽鏈?zhǔn)疽鈭D

50圖1.固相Fmoc法合成肽鏈?zhǔn)疽鈭D50502.建立了合成多肽分子量的ESI-MS質(zhì)譜表征分析、多肽純度的HPLC表征分析、合成的粗產(chǎn)品HPLC純化方法及活性分析TNF-αbinding實(shí)驗(yàn)方法254nm214nmFig.2.HPLCanalysisofPep3at254nmand214nm.Fig.3.ESI-MSanalysisofPep3512.建立了合成多肽分子量的ESI-MS質(zhì)譜表征分析、多513.證明了已合成的優(yōu)選多肽Pep3具有較高的抑制TNF-α與TNF-R1的結(jié)合活性、抑制HeLa細(xì)胞IκB-α降解及NF-κBp65核轉(zhuǎn)位。Fig.4.InhibitionofTNF-αbindingtoTNF-R1bysyntheticpeptidesinELISA.Fig.5.EffectofPep3onTNF-α-induceddegradationofIκB-αinHeLacells.Fig.6.EffectofPep3onTNF-α-inducedNF-κBp65subunitnucleartranslocation.Cao,Y,Liu,P*(劉培慶，通訊作者).AsyntheticpeptidederivedfromA1moduleinCRD4ofhumanTNFreceptor-1inhibitsbindingandproinflammatoryeffectofhumanTNF-alpha,Inflammation,2009,32:139-145523.證明了已合成的優(yōu)選多肽Pep3具有較高的抑制TNF-α52YuS,LiuP.*(劉培慶，通訊作者).Sirtuin6protectscardiomyocytesfromhypertrophyinvitroviainhibitionofNF-kappaB-dependenttranscriptionalactivity,BrJPharmacol,2012.DOI:10.1111/j.1476-5381.2012.01903.x④發(fā)現(xiàn)Sirt6通過以酶活性依賴性方式抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮抑制心肌肥大及炎性反應(yīng)的作用53YuS,LiuP.*(劉培慶，通訊作者).Sirtu53⑥建立了巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，為從炎性病變角度研究心衰提供了技術(shù)支持。XuS,LiuPQ*（劉培慶，通訊作者）.TanshinoneII-AinhibitsoxidizedLDL-inducedLOX-1expressioninmacrophagesbyreducingintracellularsuperoxideradicalgenerationandNF-κBactivation.TranslRes.2012Aug;160(2):114-24⑥建立了巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，為從炎性病變角度研究心衰提供了54鑒于TNF-α在心衰過程中的重要作用，TNF-α及其受體TNFR1有望成為心衰治療的新途徑及新靶點(diǎn)！鑒于TNF-α在心衰過程中的重要作用，TNF-α及55六、進(jìn)一步研究思路通過多肽設(shè)計(jì)、合成及優(yōu)化,獲得更高活性及選擇性多肽研究TNF-α通過TNFR1胞外不同區(qū)域介導(dǎo)心衰能量代謝紊亂的機(jī)制明確干預(yù)TNF-α信號(hào)途徑治療心衰可行性，確定具體干預(yù)靶點(diǎn)對(duì)研發(fā)的高活性高選擇性多肽進(jìn)行治療心衰的藥效學(xué)評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步小分子化合物的設(shè)計(jì)及研發(fā)奠定良好的基礎(chǔ)。56六、進(jìn)一步研究思路通過多肽設(shè)計(jì)、合成及優(yōu)化,獲得更高活性及56短肽庫(kù)TNR1活性測(cè)試（試劑盒）有機(jī)合成靶標(biāo)（

TNFR1）專利多肽Pep3構(gòu)效關(guān)系分析優(yōu)選多肽Pepx合理化設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)優(yōu)化細(xì)胞活性測(cè)試（IC50）小分子抑制劑合理化設(shè)計(jì)1.多肽設(shè)計(jì)、合成及優(yōu)化短肽庫(kù)TNR1活性測(cè)試（試劑盒）有機(jī)合成靶標(biāo)專利多肽Pep57TNFReceptor1、TNF

和小分子抑制劑的模建作用模式基于晶體結(jié)構(gòu)：1FT4和1TNR58TNFReceptor1、TNF和小分子抑制劑的模建作58TNF

小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)（設(shè)計(jì)、合成和活性測(cè)試）活性測(cè)試分子動(dòng)力學(xué)模擬分子對(duì)接小分子數(shù)據(jù)庫(kù)大于40萬化合物苗頭化合物目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)改造有機(jī)合成活性測(cè)試先導(dǎo)化合物59中國(guó)天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)（CNPD）TNF小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)（設(shè)計(jì)、合成和活性測(cè)試）活性測(cè)試分59(A)ChemicalstructureofthesmallmoleculeTNF-αinhibitor.See(12)forsyntheticrouteused.(B)CompoundinhibitionofTNF-αbindingtoTNFR1invitro.AnELISA(12)wasusedtomeasureinhibitionofsolution-phaseTNF-R1horseradishperoxidaseconjugatebindingtobiotinylatedTNF-αimmobilizedonastrepavidin-coatedmicrotiterplatebyserialdilutionsofcompound.Thesolidlinerepresentsafour-parametercurvefit(20)thatyieldedanIC50valueof22μM.(C)CompoundinhibitionofTNF-αinducedIκB-αdepletioninHeLacells.CellsweretreatedwithsufficientTNF-αorIL-1βtogivean80%ofmaximalIκB-αdepletionresponseaftera30-minexposure(0.4and0.04ng/ml,respectively),asmeasuredinanassayofcelllysates(12).SolidcirclesshowthatcompoundadditioninhibitsthisTNF-α–inducedIκB-αdepletionandyieldsanIC50valueof4.6μM.OpencirclesshowthatcompoundadditiondoesnotaffectorthogonalIL-1β–inducedIκB-αdepletion.Errorbarsindicatestandarddeviationsfortriplicatemeasurements.二甲基胺為隔離基相聯(lián)結(jié)的三氟甲基苯基吲哚和二甲基色酮能夠抑制TNF-α和它的受體之間的鏈接。抑制TNF-α與TNFR1結(jié)合IC50為22μmol/L，而抑制TNF-α誘導(dǎo)的IκB-α解離IC50為4.6μmol/L。(A)Chemicalstructureofthe602.正在進(jìn)行TNF

小分子抑制劑的研發(fā)工作通過與本院“結(jié)構(gòu)生物學(xué)與藥物設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室”羅海彬教授課題組合作，以靶蛋白及其受體的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)為模板，進(jìn)行“TNFReceptor1、TNF和小分子抑制劑的模建作用模式及TNF

小分子抑制劑的設(shè)計(jì)、合成和活性測(cè)試”。雙方已有良好合作基礎(chǔ)，共同發(fā)表文章如下，為靶向TNF及其受體的小分子抑制劑研發(fā)奠定了良好基礎(chǔ)。LiuM,HeL,HuX,LiuP,LuoHB.3D-QSAR,homologymodeling,andmoleculardockingstudiesonspiropiperidinesanaloguesasagonistsofnociceptin/orphaninFQreceptor.BioorgMedChemLett.2010;20(23):7004-7010ChenSK,ZhaoP,ShaoYX,LiZ,ZhangC,LiuP,LuoHB,HuX.MoracinMfromMorusalbaL.isanaturalphosphodiesterase-4inhibitor.BioorgMedChemLett.2012;22(9):3261-3264.ShaoYX,ZhaoP,LiZ,LiuM,LiuP,LuoHB.ThemolecularbasisfortheinhibitionofhumancytochromeP4501A2byoroxylinandwogonin.EurBiophysJ.2012;41(3):297-306.612.正在進(jìn)行TNF小分子抑制劑的研發(fā)工作通過與本院“結(jié)構(gòu)61(A)X-raycrystallographystructureoftheTNF-αdimer–compoundcomplex.(B)ShiftinsubunitorientationwithintheTNF-αdimer–compoundcomplex.SuperpositionoftheTNF-αtrimerstructure(gray)withtheTNF-αdimer–compoundcomplexstructure(yellow-blue)showsaslightwideningintheanglebetweenthesubunitsatthecompoundbindingsite.(C)ViewofcompoundbindingsiteontheTNF-αdimer.Imageshowsthe2Fo–Fcelectrondensityomitmapofthecompound(contouredto1σ)calculatedfromphasesderivedfromrefinementofthestructurewithoutcompound(mesh).ThebindingpocketcanbeseentocompriseresiduesfrombothchainA(yellow)andchainB(blue).(D)βsheetsecondarystructurearoundthecompoundbindingsiteandthelocationofsixtyrosineresiduesthatcontactthecompound.Thetyrosinesarecolored-codedwithTyr59(tan),Tyr151(purple),andTyr119(blue)residuesbeingpresentedfrombothchainAandchainB.具有TFN-α的化合物的X射線晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定表明抑制劑取代了蛋白質(zhì)的3個(gè)亞單元并與TNF-α亞單元二聚體形成配合物。研究者認(rèn)為,在研究因蛋白質(zhì)解離而使復(fù)雜蛋白質(zhì)失活的小分子抑制劑時(shí),這個(gè)結(jié)果將有助于鑒定用試樣的設(shè)計(jì)。(A)X-raycrystallographystru62①我們用蛋白差異表達(dá)技術(shù)研究了SHR與2k2cRHR心肌肥大大鼠心肌組織蛋白組學(xué)，發(fā)現(xiàn)了18個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中12個(gè)是能量代謝密切的酶,為心肌肥大及心衰的能量代謝異常學(xué)說提供了重要依據(jù)。②建立了慢性心衰能量代謝相關(guān)的信號(hào)通路、基因及線粒體功能、核轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳等分析方法，證明了能量代謝異常在心肌肥大及心衰病理過程中的重要性③研究了NAD合成的限速酶在心肌肥大中點(diǎn)變化及調(diào)控機(jī)制④發(fā)現(xiàn)Ⅲ型組蛋白去乙?；福⊿irt）通過以酶活性依賴性方式抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮抑制心肌肥大作用，為心肌肥大的炎性反應(yīng)及心衰的表觀遺傳調(diào)控提供了依據(jù)⑤對(duì)心肌肥大及心衰病理過程中細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的相互作用及網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系進(jìn)行了系統(tǒng)研究，特別是核受體及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控分析，證明了PPARα、NFATc4及GATA-4之間相互作用。⑥建立了巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，證明了中藥單體丹參酮ⅡA主要通過抑制細(xì)胞內(nèi)NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)作用，為從炎性病變角度研究心衰提供了技術(shù)支持①我們用蛋白差異表達(dá)技術(shù)研究了SHR與2k2cRHR心肌肥63主要內(nèi)容正常心肌能量代謝CHF心肌能量代謝變化CHF的代謝療法展望主要內(nèi)容正常心肌能量代謝CHF心肌能量代謝變化C64正常心肌的能量代謝過程（三）：ATP的轉(zhuǎn)移和利用心臟收縮肌酸激酶能量穿梭機(jī)制

MitochondriacytoplasmATPADP+線粒體肌酸激酶+肌酸（Cr）

磷酸肌酸（PCr）肌纖維肌酸激酶ADP+

磷酸肌酸（PCr）+肌酸（Cr）ATP正常心肌的能量代謝過程（三）：ATP的轉(zhuǎn)移和利用心臟收縮肌M65能量代謝與心肌肥大心衰關(guān)系①我們用蛋白差異表達(dá)技術(shù)研究了SHR與2k2cRHR心肌肥大大鼠心肌組織蛋白組學(xué)，發(fā)現(xiàn)了18個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中12個(gè)是能量代謝密切的酶,為心肌肥大及心衰的能量代謝異常學(xué)說提供了重要依據(jù)。②建立了慢性心衰能量代謝相關(guān)的信號(hào)通路、基因及線粒體功能、核轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳等分析方法，證明了能量代謝異常在心肌肥大及心衰病理過程中的重要性③研究了NAD合成的限速酶在心肌肥大中點(diǎn)變化及調(diào)控機(jī)制④發(fā)現(xiàn)Ⅲ型組蛋白去乙?；福⊿irt）通過以酶活性依賴性方式抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮抑制心肌肥大作用，為心肌肥大的炎性反應(yīng)及心衰的表觀遺傳調(diào)控提供了依據(jù)⑤對(duì)心肌肥大及心衰病理過程中細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的相互作用及網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系進(jìn)行了系統(tǒng)研究，特別是核受體及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控分析，證明了PPARα、NFATc4及GATA-4之間相互作用。⑥建立了巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，證明了中藥單體丹參酮ⅡA主要通過抑制細(xì)胞內(nèi)NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)作用，為從炎性病變角度研究心衰提供了技術(shù)支持能量代謝與心肌肥大心衰關(guān)系①我們用蛋白差異表達(dá)技術(shù)研究了SH66研究背景從心肌肥厚到心力衰竭的發(fā)生機(jī)制：心肌細(xì)胞功能異常：收縮蛋白等；心肌細(xì)胞數(shù)量減少：凋亡，自噬等；心肌微血管障礙；細(xì)胞外間質(zhì)增加。研究背景從心肌肥厚到心力衰竭的發(fā)生機(jī)制：67研究背景從心肌肥厚到心力衰竭的發(fā)生機(jī)制：心肌細(xì)胞功能異常：收縮蛋白等；心肌細(xì)胞數(shù)量減少：凋亡，自噬等；心肌微血管障礙；細(xì)胞外間質(zhì)增加。研究背景從心肌肥厚到心力衰竭的發(fā)生機(jī)制：68研究背景心肌細(xì)胞凋亡是使心肌肥厚從“代償”向“失代償”轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一，是心力衰竭進(jìn)行性惡化的重要基礎(chǔ)。心肌細(xì)胞自噬是心肌對(duì)壓力超負(fù)荷的適應(yīng)性反應(yīng)之一；自噬反應(yīng)的異常也是導(dǎo)致心臟功能低下的原因。中藥“芪藶強(qiáng)心膠囊”治療慢性心衰實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)資料：鄒云增，上海市心血管病研究所研究背景心肌細(xì)胞凋亡是使心肌肥厚從“代償”向“失代償”轉(zhuǎn)化的69心肌細(xì)胞凋亡與心力衰竭WT:WildtypemiceRyR-2+/-:Ryanodinereceptor2knockoutmiceSham:ShamoperationTAC:TransverseaortaconstrictionHypertensioninRevising心肌細(xì)胞凋亡與心力衰竭WT:WildtypemiceS70WT:WildtypemiceRyR-2+/-:Ryanodinereceptor2knockoutmiceSham:ShamoperationTAC:Transverseaortaconstriction心肌細(xì)胞凋亡與心力衰竭WT:WildtypemiceSham:Shamo71心肌細(xì)胞自噬與心力衰竭WT:WildtypemiceRyR-2+/-:Ryanodinereceptor2knockoutmiceSham:ShamoperationTAC:Transverseaortaconstriction心肌細(xì)胞自噬與心力衰竭WT:WildtypemiceS72芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)壓力超負(fù)荷2周心肌細(xì)胞肥大的影響芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)壓力超負(fù)荷2周心肌細(xì)胞肥大的影響73芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)壓力超負(fù)荷4周心肌纖維化的影響芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)壓力超負(fù)荷4周心肌纖維化的影響74芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)壓力超負(fù)荷4周心肌細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL)芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)壓力超負(fù)荷4周心肌細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL)75芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)壓力超負(fù)荷4周心肌細(xì)胞自噬的影響(LC3b)芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)壓力超負(fù)荷4周心肌細(xì)胞自噬的影響(LC3b)76#*###芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)壓力超負(fù)荷4周心肌細(xì)胞自噬的影響(LC3b)#*###芪藶強(qiáng)心膠囊對(duì)壓力超負(fù)荷4周心肌細(xì)胞自噬的影響(L77小結(jié)芪藶強(qiáng)心膠囊：—延緩壓力超負(fù)荷后心室重構(gòu)的發(fā)生；—保護(hù)壓力超負(fù)荷后的心臟收縮功能；—減少壓力超負(fù)荷晚期的心肌細(xì)胞凋亡和自噬小結(jié)芪藶強(qiáng)心膠囊：78四、進(jìn)一步研究思路通過多肽設(shè)計(jì)、合成及優(yōu)化,獲得更高活性及選擇性多肽研究TNF-α通過TNFR1胞外不同區(qū)域介導(dǎo)心衰能量代謝紊亂的機(jī)制明確干預(yù)TNF-α信號(hào)途徑治療心衰可行性，確定具體干預(yù)靶點(diǎn)對(duì)研發(fā)的高活性高選擇性多肽進(jìn)行治療心衰的藥效學(xué)評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步小分子化合物的設(shè)計(jì)及研發(fā)奠定良好的基礎(chǔ)。79四、進(jìn)一步研究思路通過多肽設(shè)計(jì)、合成及優(yōu)化,獲得更高活性及79短肽庫(kù)TNR1活性測(cè)試（試劑盒）有機(jī)合成靶標(biāo)（

TNFR1）專利多肽Pep3構(gòu)效關(guān)系分析優(yōu)選多肽Pepx合理化設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)優(yōu)化細(xì)胞活性測(cè)試（IC50）小分子抑制劑合理化設(shè)計(jì)1.多肽設(shè)計(jì)、合成及優(yōu)化短肽庫(kù)TNR1活性測(cè)試（試劑盒）有機(jī)合成靶標(biāo)專利多肽Pep80TNFReceptor1、TNF

和小分子抑制劑的模建作用模式基于晶體結(jié)構(gòu)：1FT4和1TNR81TNFReceptor1、TNF和小分子抑制劑的模建作81TNF

小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)（設(shè)計(jì)、合成和活性測(cè)試）活性測(cè)試分子動(dòng)力學(xué)模擬分子對(duì)接小分子數(shù)據(jù)庫(kù)大于40萬化合物苗頭化合物目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)改造有機(jī)合成活性測(cè)試先導(dǎo)化合物82TNF小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)（設(shè)計(jì)、合成和活性測(cè)試）活性測(cè)試分82(A)ChemicalstructureofthesmallmoleculeTNF-αinhibitor.See(12)forsyntheticrouteused.(B)CompoundinhibitionofTNF-αbindingtoTNFR1invitro.AnELISA(12)wasusedtomeasureinhibitionofsolution-phaseTNF-R1horseradishperoxidaseconjugatebindingtobiotinylatedTNF-αimmobilizedonastrepavidin-coatedmicrotiterplatebyserialdilutionsofcompound.Thesolidlinerepresentsafour-parametercurvefit(20)thatyieldedanIC50valueof22μM.(C)CompoundinhibitionofTNF-αinducedIκB-αdepletioninHeLacells.CellsweretreatedwithsufficientTNF-αorIL-1βtogivean80%ofmaximalIκB-αdepletionresponseaftera30-minexposure(0.4and0.04ng/ml,respectively),asmeasuredinanassayofcelllysates(12).SolidcirclesshowthatcompoundadditioninhibitsthisTNF-α–inducedIκB-αdepletionandyieldsanIC50valueof4.6μM.OpencirclesshowthatcompoundadditiondoesnotaffectorthogonalIL-1β–inducedIκB-αdepletion.Errorbarsindicatestandarddeviationsfortriplicatemeasurements.二甲基胺為隔離基相聯(lián)結(jié)的三氟甲基苯基吲哚和二甲基色酮能夠抑制TNF-α和它的受體之間的鏈接。抑制TNF-α與TNFR1結(jié)合IC50為22μmol/L，而抑制TNF-α誘導(dǎo)的IκB-α解離IC50為4.6μmol/L。(A)Chemicalstructureofthe832.正在進(jìn)行TNF

小分子抑制劑的研發(fā)工作通過與本院“結(jié)構(gòu)生物學(xué)與藥物設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室”羅海彬教授課題組合作，以靶蛋白及其受體的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)為模板，進(jìn)行“TNFReceptor1、TNF和小分子抑制劑的模建作用模式及TNF

小分子抑制劑的設(shè)計(jì)、合成和活性測(cè)試”。雙方已有良好合作基礎(chǔ)，共同發(fā)表文章如下，為靶向TNF及其受體的小分子抑制劑研發(fā)奠定了良好基礎(chǔ)。LiuM,HeL,HuX,LiuP,LuoHB.3D-QSAR,homologymodeling,andmoleculardockingstudiesonspiropiperidinesanaloguesasagonistsofnociceptin/orphaninFQreceptor.BioorgMedChemLett.2010;20(23):7004-7010ChenSK,ZhaoP,ShaoYX,LiZ,ZhangC,LiuP,LuoHB,HuX.MoracinMfromMorusalbaL.isanaturalphosphodiesterase-4inhibitor.BioorgMedChemLett.2012;22(9):3261-3264.ShaoYX,ZhaoP,LiZ,LiuM,LiuP,LuoHB.ThemolecularbasisfortheinhibitionofhumancytochromeP4501A2byoroxylinandwogonin.EurBiophysJ.2012;41(3):297-306.842.正在進(jìn)行TNF小分子抑制劑的研發(fā)工作通過與本院“結(jié)構(gòu)84(A)X-raycrystallographystructureoftheTNF-αdimer–compoundcomplex.(B)ShiftinsubunitorientationwithintheTNF-αdimer–compoundcomplex.SuperpositionoftheTNF-αtrimerstructure(gray)withtheTNF-αdimer–compoundcomplexstructure(yellow-blue)showsaslightwideningintheanglebetweenthesubunitsatthecompoundbindingsite.(C)ViewofcompoundbindingsiteontheTNF-αdimer.Imageshowsthe2Fo–Fcelectrondensityomitmapofthecompound(contouredto1σ)calculatedfromphasesderivedfromrefinementofthestructurewithoutcompound(mesh).ThebindingpocketcanbeseentocompriseresiduesfrombothchainA(yellow)andchainB(blue).(D)βsheetsecondarystructurearoundthecompoundbindingsiteandthelocationofsixtyrosineresiduesthatcontactthecompound.Thetyrosinesarecolored-codedwithTyr59(tan),Tyr151(purple),andTyr119(blue)residuesbeingpresentedfrombothchainAandchainB.具有TFN-α的化合物的X射線晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定表明抑制劑取代了蛋白質(zhì)的3個(gè)亞單元并與TNF-α亞單元二聚體形成配合物。研究者認(rèn)為,在研究因蛋白質(zhì)解離而使復(fù)雜蛋白質(zhì)失活的小分子抑制劑時(shí),這個(gè)結(jié)果將有助于鑒定用試樣的設(shè)計(jì)。(A)X-raycrystallographystru853.心肌細(xì)胞模型指標(biāo)檢測(cè)①心肌能量代謝狀態(tài)及線粒體功能檢測(cè):已建立了HPLC及磁共振波譜（mrs）檢測(cè)心肌高能磷酸化合物PCr和ATP水平的方法:PCr作為輸送ATP從線粒體到細(xì)胞質(zhì)的工具，是能量物質(zhì)的中介，PCr/ATP比值是分析能量代謝的最重要參數(shù)，其準(zhǔn)確度高于NYHA分級(jí)等臨床參數(shù)和左室EF等功能參數(shù)②TMRE染料檢測(cè)心肌線粒體膜電位、透射電鏡觀察線粒體功能與生成狀態(tài)

③心肌細(xì)胞脂肪酸、葡萄糖氧化及氧化磷酸化代謝關(guān)鍵基因如PGC-1α、ERRα、PPARα、HIF-1α、PARP1、NF-κB等mRNA等蛋白表達(dá)水等變化④測(cè)定心肌細(xì)胞表面積、檢測(cè)[3H]亮氨酸攝入率及肥大及心衰相關(guān)基因ANF、BNP的mRNA及蛋白表達(dá)水平

通過以上指標(biāo)體系檢測(cè),綜合分析TNF-α通過是否通過TNFR1不同功能區(qū)發(fā)揮對(duì)肥大重構(gòu)及缺血心肌能量代謝的調(diào)控作用。3.心肌細(xì)胞模型指標(biāo)檢測(cè)①心肌能量代謝狀態(tài)及線粒體功能檢測(cè)864.系統(tǒng)建立治療心衰藥物的基礎(chǔ)研究及評(píng)價(jià)體系

①超聲心動(dòng)及心臟插管法檢測(cè)心臟收縮及舒張功能②心肌高能磷酸化合物PCr和ATP水平HPLC及磁共振波譜（mrs）檢測(cè)方法③TMRE染料檢測(cè)心肌線粒體膜電位、透射電鏡觀察線粒體功能與生成狀態(tài)

④Clark氧電極法檢測(cè)心肌線粒體耗氧速率⑤脂肪酸、葡萄糖氧化及氧化磷酸化代謝關(guān)鍵基因及蛋白如PGC-1α、ERRα、PPARα、HIF-1α、PARP1、NF-κB等變化；874.系統(tǒng)建立治療心衰藥物的基礎(chǔ)研究及評(píng)價(jià)體系

①超聲心動(dòng)及心872.TNFR1不同胞外區(qū)介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制利用培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，以不同濃度TNF-α為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞炎性反應(yīng)及能量代謝障礙，比較分別給予Pepx（作用于CRD4）和環(huán)肽（C-C，作用于CRD3），觀察對(duì)細(xì)胞功能和能量代謝主要指標(biāo)的影響，研究TNF-α通過TNFR1不同胞外區(qū)介導(dǎo)的相關(guān)的胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制，探討TNF-α調(diào)控心肌能量代謝的受體機(jī)制及信號(hào)通路。882.TNFR1不同胞外區(qū)介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制利用培養(yǎng)的心肌細(xì)883.干預(yù)TNFR1不同胞外區(qū)對(duì)模型動(dòng)物心衰治療效果評(píng)價(jià)及機(jī)制研究1）利用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎復(fù)制SD大鼠心衰模型，經(jīng)超聲心動(dòng)圖、血流動(dòng)力學(xué)分析以及組織病理檢測(cè)等方法檢測(cè)Pepx和環(huán)肽（C-C）對(duì)心臟功能的影響，探討干預(yù)TNFR1與TNF-α結(jié)合的不同胞外區(qū)對(duì)心衰治療效果，明確干預(yù)TNF-α信號(hào)途徑治療心衰的靶點(diǎn)，并進(jìn)行治療心衰的藥效學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)體系：增加Clark氧電極法檢測(cè)心肌線粒體耗氧速率，其他指標(biāo)同心肌細(xì)胞。2）Beagle犬建立慢性快速右心室起搏心衰模型，進(jìn)行優(yōu)選多肽Pepx或篩選出的先導(dǎo)化合物的抗心衰作用藥效學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)體系：增加犬冠脈流量測(cè)定及心肌酶譜檢測(cè)，其它同大鼠心衰模型893.干預(yù)TNFR1不同胞外區(qū)對(duì)模型動(dòng)物心衰治療效果評(píng)價(jià)及機(jī)89研究?jī)?nèi)容概括如下研究?jī)?nèi)容概括如下90三、工作基礎(chǔ)近年來在負(fù)責(zé)的6項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(包括中加合作項(xiàng)目)及廣東省自然科學(xué)基金團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目、重點(diǎn)項(xiàng)目支持下，圍繞高血壓心肌肥大、心衰等進(jìn)行了系統(tǒng)的病理機(jī)制及藥物干預(yù)靶點(diǎn)研究，建立了心肌肥大、心衰研究模型及靶點(diǎn)研究方法。負(fù)責(zé)承擔(dān)了科技部十一五“重大新藥創(chuàng)制”專項(xiàng)“新藥臨床前藥效學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)平臺(tái)”（2009ZX09303-007）“心腦血管疾病藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)平臺(tái)”建設(shè)，建立了完善的治療心衰等心腦血管疾病藥物臨床前藥效學(xué)評(píng)價(jià)模型及技術(shù)體系（已順利結(jié)題）。三、工作基礎(chǔ)近年來在負(fù)責(zé)的6項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(包括913.建立了心衰評(píng)價(jià)模型及藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)體系①大鼠心衰模型及評(píng)價(jià)指標(biāo)體系:冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎的SD大鼠心衰模型ChenY,LiuP*.MolCellEndocrinol.2012;362(1-2):11-18②Beagle犬建立慢性快速右心室起搏心衰模型及評(píng)價(jià)指標(biāo)體系，完成了中藥單體前胡丙素及1類化藥TBN(暨南大學(xué)委托）的抗心衰藥效學(xué)評(píng)價(jià)。3.建立了心衰評(píng)價(jià)模型及藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)體系①大鼠心衰模型及評(píng)92（三）開展了治療心衰藥物的研發(fā)工作指導(dǎo)了本課題直接相關(guān)的博士研究生曹穎男順利畢業(yè)并已獲得博士學(xué)位，學(xué)位論文題目《多肽類腫瘤壞死因子alpha抑制劑的設(shè)計(jì)、合成及抗炎活性研究》，為本課題的實(shí)施奠定了良好基礎(chǔ)。獲得了活性多肽Pep3在制備抗心衰和炎性反應(yīng)藥物中的應(yīng)用的中國(guó)發(fā)明專利授權(quán)號(hào)，為進(jìn)一步作為治療心衰藥物研發(fā)提供了知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)。93（三）開展了治療心衰藥物的研發(fā)工作指導(dǎo)了本課題直接相關(guān)的博士931.JCardiovascPharmacol.2012Jun;59(6):500-6.doi:10.1097/FJC.0b013e31824c853c.AtorvastatinattenuatesTNF-α-inducedincreaseofglucoseoxidationthroughPGC-1αupregulationincardiomyocytes.GaoF,NiY,LuoZ,LiangY,YanZ,XuX,LiuD,WangJ,ZhuS,ZhuZ.DepartmentofCardiology,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing,China.Recentstudieshaveshownthatatorvastainhasanti-inflammatoryeffectandcanpreventcardiachypertrophy.Thedevelopmentofcardiachypertrophyanddysfunctionisassociatedwithanincreaseincardiacglucoseutilization.Inthisstudy,weinvestigatedtheeffectofatorvastatinonglucoseoxidationintumornecrosisfactorα(TNF-α)-stimulatedcardiomyocytes(H9c2cells)andthepotentialroleofperoxisomeproliferation-activatedreceptorcoactivator1α(PGC-1α)inthiseffect.ExposureofH9c2cellstoTNF-αinhibitedtheexpressionsofPGC-1α,pyruvatedehydrogenasekinase4,andcarnitinepalmityltransferase1andinducedasignificantincreaseinglucoseoxidationrate.However,theeffectsofTNF-αweresignificantlyreversedbyatorvastatin.SelectivesilenceofPGC-1αinH9c2cellsresultedinthedownregulationofpyruvatedehydrogenasekinase4andcarnitinepalmityltransferase1andfurtherincreasedtheTNF-α-inducedglucoseoxidation.Interestingly,theeffectofatorvastatinonPGC-1αwasalmostabolishedbymevalonateandpartiallybyfarnesolbutnotbygeranylgeraniol.Inconclusion,atorvastatininhibitsTNF-α-inducedglucoseoxidationthroughPGC-1αupregulationincardiomyocytes,whichmightbeassociatedwiththeregulationofisoprenoidmetabolites.1.JCardiovascPharmacol.20194AIMS:Inflammatoryresponsesintheheartthataredrivenbysustainedincreasesincytokineshavebeenassociatedwithseveralpathologicalprocesses,includingcardiachypertrophyandheartfailure.Emergingdatasuggestalinkbetweencardiomyopathyandmyocardialmetabolismdysregulation.Tofurtherelucidatetherelationshipbetweenapro-inflammatoryprofileandcardiacmetabolismdysregulation,ahumancelllineofcardiacorigin,AC16,wastreatedwithtumournecrosisfactor-alpha(TNF-alpha).METHODSANDRESULTS:ExposureofAC16cellstoTNF-alphainhibitedtheexpressionofperoxisomeproliferator-activatedreceptorcoactivator1alpha(PGC-1alpha),anupstreamregulatoroflipidandglucoseoxidativemetabolism.Studiesperformedwithcardiac-specifictransgenicmice(Musmusculus)overexpressingTNF-alpha,whichhavebeenwellcharacterizedasamodelofcytokine-inducedcardiomyopathy,alsodisplayedreducedPGC-1alphaexpressionintheheartcomparedwiththatofcontrolmice.ThemechanismbywhichTNF-alphareducedPGC-1alphaexpressioninvitroappearedtobelargelymediatedviabothp38mitogen-activatedproteinkinaseandnuclear