范可尼貧血3例臨床分析

范可尼貧血3例臨床分析

氨基膽紅素（fa）是一種正常的染色體隱性遺傳疾病，主要表現為缺血和多發(fā)畸形。我國已有數十例FA病例報道,但僅少數有細胞遺傳學資料,其基因亞型尚未見報道?，F將1997年和1998年我科收治的3例FA患兒的細胞遺傳學和基因亞型檢測結果報告如下。對象和方法一、治療慢性面色繁雜3例均系本院住院患兒,符合文獻報道的診斷標準。就診年齡分別為8歲4個月、8歲6個月、8歲9個月,均為男性,病程0.5年～2年。臨床主要表現為進行性面色蒼白,體格發(fā)育落后,其中例1與例3有皮膚散在大小不一的淡棕褐色色素斑,伴右指多指畸形,而例2尚伴有甲狀腺及腎上腺皮質功能減低。外周血象示三系減少,網織紅細胞降低。骨髓象均符合再生障礙性貧血(簡稱再障)改變。治療上采用以康力龍、潑尼松、左旋咪唑等為主的中西醫(yī)結合治療,例2加用左旋甲狀腺片及氫化考的松。隨訪1.5～2年,患兒血象和骨髓象均有不同程度的改善,但例3療效較差,需間斷輸血方能維持正常生活。二、方法1.染色體斷裂試驗采取FA患兒外周血2ml,肝素抗凝,加入18mlHAM-10培養(yǎng)基,混勻后分為4組,分別加入絲裂霉素C(mitomycinC,MMC)(KyowaHakkoKogyoCoLtd,Japan)0、12.5、50ng/ml和100ng/ml,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)72h。收獲細胞前30min,加入秋水仙胺(Merck產品)。按常規(guī)收獲細胞,制片,Gimsa染色,于光鏡下觀察染色體斷裂情況。染色體斷裂計數:染色體(或單體)斷裂、裂隙、碎片等計為1個斷裂,四幅射體、三幅射體等計為2個斷裂。上述4組中每組檢查100個分裂像,分別記錄不同類型及數目的染色體斷裂,計算畸變率(畸變細胞%=有染色體斷裂的分裂像數/觀察的分裂像總數×100%)、平均斷裂率(每個細胞斷裂數=總斷裂數/觀察的分裂像總數)、每個畸變細胞的平均斷裂率(每個畸變細胞斷裂數=總斷裂數/有染色體斷裂的分裂像總數)和高斷裂數細胞率(高斷裂數細胞率=高斷裂數分裂像/觀察分裂像總數)。高斷裂數分裂像是指斷裂數在5個以上的分裂像。每次細胞遺傳學檢查均與正常健康兒進行對照。2.膠片和照片的制備和互補試驗取患兒外周血經EB病毒轉化后建立B-淋巴母細胞系,與參考細胞系進行細胞融合和互補試驗,方法見參考文獻。然后采用免疫沉淀法分離蛋白質、轉膜,再將膜依次與兔抗FANCA抗體、過氧化物酶標記的抗兔抗體孵育,最后用ECL(enhancedchemiluminescence)Westernblotting試劑盒制成膠片和照片。細胞融合和互補試驗原理:參照細胞系為已知亞型的細胞系。被檢測細胞系和參照細胞系,如果基因的缺陷(缺陷可不同)位于同一FA基因上,融合后的子代雜交細胞的該FA基因仍有缺陷,該雜交細胞仍對MMC超敏感(即不互補),因此不互補提示被測細胞系與參照細胞系屬同一亞型;若被檢測的細胞系和參照細胞系基因缺陷位于不同FA基因上,融合后的子代雜交細胞這兩個缺陷基因得到來自兩個父代細胞健康基因的FA互相補充,該雜交細胞對MMC不再超敏感(即互補),因此提示被測細胞系與參照細胞系不屬于同一亞型。結果一、3mmc對fa患兒外周血細胞染色體斷裂率的影響如表1所示,3例FA患兒外周血淋巴細胞在100ng/mlMMC誘導下染色體平均斷裂率分別為6.71、2.98、6.49;畸變率均為100%;每個畸變細胞的平均斷裂率分別為6.71、5.98、6.49。3例FA患兒外周血淋巴細胞染色體斷裂率均隨著MMC濃度增高而升高。3例FA的MMC誘導分裂像在50、100ng/mlMMC誘導下分別為34和74,明顯高于正常對照組(對照組MMC誘導分裂像在50ng/ml、100ng/ml時分別為0.07和0.11)。二、3病例1顯示了fa患兒基因亞型的結果3例FA患兒均缺乏FANCA蛋白的表達,提示均為FA-A亞型。討論一、細胞一般資料本組報道的3例FA占同期住院再障患兒的13%,均為男性患兒,于6歲后發(fā)病,3例皆有面色蒼白、發(fā)育遲緩,伴皮膚色素沉著和局限性色素缺失、拇指畸形,1例牙釉質發(fā)育不良,1例伴內分泌改變。外周血均示全血細胞減少,呈大細胞性貧血。骨髓象均符合再障改變。據文獻報道,222例FA患者中44%表現為骨髓造血異常和先天畸形,51%的患者僅有造血異?；蛳忍旎?5%的患者兩者皆無。但也有再障患兒伴先天畸形而無細胞遺傳學改變者,MMC誘導染色體斷裂無增高。因此,僅靠臨床表現可能會漏診或誤診。有文獻報道,一家中可有兄弟姐妹多人發(fā)病,部分患者表現為血小板減少癥。本組例1之胞弟即以血小板減少為主要表現,其余2例之同胞無FA的臨床表現,因未作染色體檢查,尚不能排除本病。本組3例的父母均為非近親婚配,其雙親(除例2的母親未作檢查外)之MMC誘導染色體斷裂率未見異常增高,可排除本病。二、fa細胞基因突變由于FA患者的細胞對某些DNA交鏈劑,如MMC、二環(huán)氧丁烷(diepoxybutane,DEB)異常敏感,在低濃度的MMC/DEB誘導下,FA患者的染色體斷裂率即明顯增高,是診斷本病的主要依據。本組3例FA外周血淋巴細胞經MMC誘導后染色體斷裂率均明顯增高,在較低濃度MMC(12.5ng/ml和50ng/ml)誘導下即出現較多高斷裂數的分裂像;高濃度(100ng/ml)MMC作用下幾乎全部都發(fā)生染色體斷裂。而我們在另外的試驗中觀察到正常人和其他再障患者僅在高濃度的MMC作用下才偶爾出現高斷裂數的細胞,且仍有多數細胞無染色體斷裂。FA患者染色體高畸變率表明,其發(fā)病機理可能為DNA損傷,最終導致造血干細胞功能缺陷和多發(fā)性畸形。近年來,利用體細胞融合雜交技術和FA細胞對DNA交鏈劑異常敏感的基因缺陷進行互補分析,顯示FA至少有8組互補群(A、B、C、D、E、F、G、H),即可能有至少8種基因缺陷可導致FA。這些基因被命名為“FANCA”～“FANCH”。其中以FANCA組最為常見,占全部FA的60%～65%,基因定位于16q24.3,其4.3kb的編碼序列含43個外顯子,因此對FANCA基因的突變篩查十分困難,目前已知其基因突變檢出率為30%～70%。FANCA、FANCC和FANCG基因已被克隆,FANCD和FANCE基因已分別定位于染色體3P和6P。本組報告的3例FA基因缺陷均為FA-A亞型。三、fa的臨床療效如前所述,FA至少有8種基因亞型,這種遺傳的異質性可能影響臨床和血液學的異質性,根據患者骨髓單個核細胞體外培養(yǎng)生成早期紅系祖細胞(BFU-E)和晚期紅系祖細胞(CFU-E)的情況,可將FA分為6種情況:(1)無任何紅系祖細胞生長,骨髓增生重度減低,雄激素治療無效,需要輸血維持生活;(2)與上組相似,無BFU-E生長;(3)BFU-E減少,骨髓增生減低或重度減低,雄激素治療有效,不需輸血;(4)CFU-E與BFU-E低于正常,骨髓增生減低,不需雄激素治療及輸血;(5)BFU-E稍減少,輕度貧血和(或)血小板減少和(或)大紅細胞增多;(6)BFU-E和CFU-E正?；蛏詼p少,血象基本正常,不需治療。本組3例FA的治療均采用康力龍和潑尼松合用,并加免疫調節(jié)劑(左旋咪唑),支持治療,輔以中藥口服,使其臨床癥狀和血液學異常表現得到改善,但例3療效較差,加用環(huán)孢菌素A(CSA)治療3個月后仍無好轉。例2因伴內分泌改變而使用相應藥物,臨床表現改善。本組3例患兒基因亞型相同,但其臨床表現與治療效果不盡相同,反映了臨床和血液學的高度異質性。造血干細胞移植是迄今治愈本病