木本觀賞植物組培快繁技術(shù)

木本觀賞植物組培快繁技術(shù)

1植物細(xì)胞的全能性及再生作用的相關(guān)研究植物組織培養(yǎng)是指對(duì)植物器官（根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等）進(jìn)行人工制備的培養(yǎng)基，并給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，以完成完整植物的過(guò)程。由于培養(yǎng)的是脫離植物母體的培養(yǎng)物,所以也叫植物離體培養(yǎng)或植物試管培養(yǎng)。植物組織細(xì)胞培養(yǎng)的依據(jù)是植物細(xì)胞“全能性”及植物的“再生作用”。1902年德國(guó)著名植物學(xué)家G.Haberlandt根據(jù)細(xì)胞學(xué)理論,大膽地提出了高等植物的器官和組織可以不斷分割,直到單個(gè)細(xì)胞,即植物體細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下,具有不斷分裂和繁殖、發(fā)育成完整植株的潛力的觀點(diǎn)。他曾用植物葉片細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),但未能成功。這是因?yàn)?0世紀(jì)初期,細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)等生物學(xué)的基礎(chǔ)學(xué)科都處于襁褓之中。在之后的近半個(gè)世紀(jì),人們雖然對(duì)培養(yǎng)基成分、植物激素等培養(yǎng)條件有不少重要發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí),然而一直未能由單個(gè)細(xì)胞或組織再生出完整植株。直到20世紀(jì)40年代末50年代初,Skoog和崔徽等用煙草髓組織培養(yǎng)誘導(dǎo)根、芽器官形成獲得成功。隨后,Reinert和Steward等分別報(bào)道在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中形成了體細(xì)胞胚,并發(fā)育成完整小植株,從而證實(shí)了植物細(xì)胞的全能性。1960年英國(guó)學(xué)者Cocking用酶法首次從番茄根尖分離出大量有活性的原生質(zhì)體,并通過(guò)培養(yǎng)再生出細(xì)胞壁。1971年Nagata首次通過(guò)煙草葉肉原生質(zhì)體的培養(yǎng)獲得了再生植株。之后,多種植物的原生質(zhì)體再生植株都相繼取得了成功,由此開(kāi)創(chuàng)了植物組織培養(yǎng)研究的新局面。2植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用2.1花鏡rosachinenus目前用于快速繁殖的植物1000余種,并且還不斷有新的報(bào)道。市場(chǎng)上出售的組培苗主要是花卉、果木及經(jīng)濟(jì)作物。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),僅觀賞花卉而言,一般認(rèn)為重要的包括60余科,近1000種,如月季(Rosachinensis)、菊花(Dendranthemamorifolium)、牡丹(Paeoniasuffruticosa)、花葉芋(Caladiumbicolor)、龜背竹(Monsteradeliciosa)、各類(lèi)蘭花等。其他植物如柑桔屬(Citrus)、按樹(shù)(Eucalyptusrobusta)、槭樹(shù)屬(Acer)和珍貴的針葉樹(shù)等也都應(yīng)用組織培養(yǎng)快速繁殖。2.2植物脫毒苗的制備脫毒苗培育主要集中于觀賞植物。觀賞植物受到病毒侵染后,品質(zhì)下降,產(chǎn)量降低。長(zhǎng)期無(wú)性繁殖的植物,在繁殖過(guò)程中病毒可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)體進(jìn)行傳遞,逐代累積,使病毒病的為害更為嚴(yán)重。為消除病毒的為害,20世紀(jì)80年代人們就廣泛采用了莖尖組培脫毒的方法。莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)通常沒(méi)有或只有很少病毒,以莖尖為材料或加以適當(dāng)?shù)臒崽幚?在無(wú)菌條件下培養(yǎng)即可獲得脫毒植株,然后通過(guò)快繁得到大量無(wú)毒苗。脫毒后的植株生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng),品質(zhì)提高,產(chǎn)量增加,且能夠保持品種的優(yōu)良特性。目前,利用生物技術(shù)方法對(duì)植物脫毒苗進(jìn)行組織培養(yǎng)和擴(kuò)大繁殖,已被各國(guó)園藝界廣泛應(yīng)用。如張丕方針對(duì)香石竹(Dianthuscaryophyllus)、球根花卉、蘭花(Cymbidium)等比較容易感染病毒病的問(wèn)題,進(jìn)行香石竹莖尖培養(yǎng)研究,使香石竹脫毒苗單位面積內(nèi)平均花數(shù)增多,裂苞率減少,在提高切花質(zhì)量的同時(shí)也提高了切花產(chǎn)量,解決了退化問(wèn)題。袁梅芳等利用鳶尾(Iristectorum)莖尖(<1mm)進(jìn)行組培,試管苗脫去了鳶尾重花葉病毒、鳶尾輕花葉病毒和水仙潛隱病毒。李昌禹等在MS培養(yǎng)基上附加5mg/L病毒唑培養(yǎng)唐菖蒲(Gladiolushybridus),再經(jīng)38~40℃熱處理,切取微莖尖2次,去除了為害唐菖蒲的3種主要病毒TMV、CMV和TVY。趙蘭勇等利用莖尖培養(yǎng)有效脫除為害6個(gè)品種切花菊(Dendranthema)種苗的番茄不孕病毒(TAV)、菊花B病毒(CBV)、菊花花葉病毒(CHMV)?？梢?jiàn)我國(guó)的脫毒技術(shù)已取得了很大成就。2.3葡萄種的誘導(dǎo)誘導(dǎo)通過(guò)組織培養(yǎng)產(chǎn)生的體細(xì)胞無(wú)性系變異(常規(guī)育種中不可能出現(xiàn)的變異),為植物的品種改良和新品種的選育提供了新的途徑。20世紀(jì)80年代以來(lái),我國(guó)在作物無(wú)性系變異育種方面取得了令人鼓舞的進(jìn)展,已培育出了一大批優(yōu)良新品種。利用胚培養(yǎng)技術(shù)是育種研究中克服胚敗育或發(fā)育不良,提高萌發(fā)率以及提早萌發(fā),縮短童期的有效手段。Ramming提出把葡萄(Vtisvinifera)種子播在培養(yǎng)基上,置于1℃下冷藏45d,比切割胚更能促進(jìn)發(fā)芽。李世誠(chéng)提出了從未熟胚誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體的葡萄胚培養(yǎng)新途徑。多倍體育種方面,王錦秀研究證明,利用愈傷組織進(jìn)行枸杞(Lyciumchinensis)同源四倍體的誘導(dǎo)方法簡(jiǎn)便可靠、誘變頻率高、效果好,是創(chuàng)造枸杞新種質(zhì)、培育枸杞新品種的有效途徑。曹孜義等將葡萄二倍體歐亞種‘Grenach’的花藥接種在B5附加激素的培養(yǎng)基上,通過(guò)提高糖濃度和加倍鹽濃度,首次從葡萄組培中獲得三倍體葡萄等。原生質(zhì)體培養(yǎng)在體細(xì)胞遺傳的研究及育種上的應(yīng)用都是十分有意義的,連勇等應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得了茄子種間體細(xì)胞雜種等。此外,組織培養(yǎng)可為植物遺傳轉(zhuǎn)化提供理想的受體材料,是植物基因工程研究的基本條件和重要手段,在植物基因工程改良中發(fā)揮著重要作用。2.4種子工程利用營(yíng)養(yǎng)地球上存在著豐富的植物種質(zhì)資源庫(kù),對(duì)植物育種、生態(tài)系統(tǒng)的豐富穩(wěn)定以及人類(lèi)的可持續(xù)發(fā)展都是無(wú)價(jià)之寶。但是,這些物種的存在正受到越來(lái)越嚴(yán)重的多種威脅,許多瀕臨滅絕。而傳統(tǒng)的種子保存,隨著時(shí)間的推移,生活力下降,并常常受到病蟲(chóng)害的侵染。實(shí)地保存不但成本高,而且受到天災(zāi)毀滅的危險(xiǎn)。而植物組織培養(yǎng)的成功,就可以將少量的芽、胚或莖尖保存在試管中,不僅節(jié)省成本,利用很小的空間就能安全地保存大量的物種基因,需要時(shí)隨時(shí)取出大量繁殖,并且因?yàn)椴粠Р《竞筒≡?可以將其在國(guó)際間進(jìn)行交換,達(dá)到資源共享。陳維倫等研究了獼猴桃屬(Actinidia)植物通過(guò)莖尖離體培養(yǎng)方法保存了10多個(gè)種,40多個(gè)獼猴桃品種的離體種質(zhì)。劉翠云等用山梨醇(5~30mg/L)、甘露醇(5~30mg/L)和矮壯素(0.01~0.1mg/L)3種生長(zhǎng)延緩劑加入到1/2B5+IAA0.2mg/L培養(yǎng)基中,進(jìn)行葡萄種質(zhì)離體保存,1a只繼代轉(zhuǎn)移2~3次即可。馬鋒旺等將杏(Prunusarmeniaca)莖段在附加2,4-D1.0mg/L和BA0.1mg/L的改良MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出愈傷組織,放入DMSO10%+山梨醇或葡萄糖0.5mol/L的冰凍保護(hù)劑中,以1℃/min的降溫速度降至-40℃,停留2h后可以較長(zhǎng)期保存在-186℃的液態(tài)氮中?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外正在研究冷凍貯藏植物細(xì)胞、組織、器官等。2.5組織培養(yǎng)藥用植物高等植物中含有的藥物、調(diào)味品及香料等天然成分,一直是人類(lèi)生活不可缺少的,但很多的復(fù)合物人工還無(wú)法合成。隨著生活水平的提高和疾病的復(fù)雜化,人們對(duì)這一類(lèi)生物產(chǎn)品的需求越來(lái)越多;相反,由于野生資源的減少,環(huán)境的惡化,來(lái)自于高等植物的一些藥物越來(lái)越不能滿足需求,而組織培養(yǎng)過(guò)程中可產(chǎn)生這些有用的次生物。利用該特點(diǎn),可以利用組織培養(yǎng),用工廠化生產(chǎn)的方式,不受季節(jié)和地區(qū)限制地進(jìn)行生產(chǎn)。如銀杏(Ginkgobiloba)是原產(chǎn)我國(guó)的重要藥用植物,主要含黃酮類(lèi)和銀杏內(nèi)醋類(lèi)等藥用成分,由葉片提取藥用成分受到含量低、提取工藝復(fù)雜、成本高等問(wèn)題的限制,通過(guò)離體培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮和銀杏內(nèi)脂近年取得了一定進(jìn)展。刺果番荔枝中含有抗腫瘤活性的番荔素,并被證明還具有殺蟲(chóng)活性、細(xì)胞毒性、抗瘧活性。趙沛基等進(jìn)行了刺果番荔枝(Annonammuricata)的組織培養(yǎng),為解決其快速繁殖以及為下一步開(kāi)展次生代謝產(chǎn)物生物合成的研究提供了基礎(chǔ)性資料。3木本觀賞植物群的培育3.1木本觀賞植物的離體培養(yǎng)木本觀賞植物的組織培養(yǎng)始于60a前,法國(guó)學(xué)者Gautherct在1934年曾就樹(shù)木組織培養(yǎng)進(jìn)行過(guò)最早的研究。從20世紀(jì)80年代起,國(guó)外開(kāi)始對(duì)木本觀賞植物的組織培養(yǎng)進(jìn)行了大量研究。Mathes利用三倍體美洲山楊(Populustremuloides)的莖作外植體培養(yǎng)出愈傷組織,并誘導(dǎo)出根和莖。木本觀賞植物花藥培養(yǎng)最早是波蘭學(xué)者Zenkteler在灌木茄科植物濱藜葉枸杞(Lyciumhalimifolum)中獲得成功的。我國(guó)對(duì)木本觀賞植物離體培養(yǎng)工作始于20世紀(jì)70年代,最初集中在花藥培養(yǎng)上,后來(lái)才發(fā)展到以體細(xì)胞組織為材料的離體培養(yǎng)。近年來(lái),木本觀賞植物原生質(zhì)體游離、培養(yǎng)及融合的研究已涉及到近30個(gè)屬。在這些研究絕大部分局限于原生質(zhì)體游離的研究。在胚乳培養(yǎng)方面,迄今為止已有10多種木本觀賞植物先后獲得了胚乳植株,但均停留在愈傷組織、胚狀體或只分化出根等階段。以體細(xì)胞組織為材料的離體培養(yǎng)也取得了較大進(jìn)展,對(duì)外植體的選用和高效培養(yǎng)基的改良應(yīng)用都已達(dá)到一定水平。植物幼株的誘導(dǎo)也已在許多木本觀賞植物上獲得了成功。20世紀(jì)90年代應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行離體快繁的木本觀賞植物,主要分布在薔薇科、豆科、木犀科、?？?、松科、杉科、牡丹科、鼠李科、大戟科、紫茉莉科和棕櫚科等,近100種。常見(jiàn)的木本觀賞植物大約有1000種,能通過(guò)組培快繁的種類(lèi)約占總數(shù)的10%?？梢?jiàn),能通過(guò)組培快繁的樹(shù)木種類(lèi)還只有很少一部分。到目前為止,木本觀賞植物的組織培養(yǎng)已經(jīng)取得了重大進(jìn)展。從裸子植物的蘇鐵、銀杏、華北落葉松、西加云杉、側(cè)柏等,到被子植物的桉樹(shù)、連翹、廣玉蘭、金花茶、榆葉梅、合歡等,乃至禾本科唯一可以作為木本植物的竹子都有研究報(bào)道。許多稀有的植物種類(lèi),如阿月渾子、華腺萼木、四合木等也有研究。而且,一些優(yōu)良樹(shù)種如桉樹(shù)、火炬樹(shù)、櫻花的離體快繁體系已經(jīng)相當(dāng)完善,已應(yīng)用于苗木大規(guī)模生產(chǎn)中。3.2木本觀賞植物植物再生體系的研究木本觀賞植物的植株再生的研究通常包括外植體、培養(yǎng)基的選擇和改進(jìn)、激素和其他培養(yǎng)物的添加、植株再生及其他條件等方面。3.2.1采用外植體培養(yǎng)外植體的選擇是組織培養(yǎng)中1個(gè)非常重要的問(wèn)題。從理論上講,植物細(xì)胞具有全能性,所以無(wú)論選用植物的哪一部分作外植體都能誘導(dǎo)成株。但是研究表明,1株樹(shù)木的不同組織或部位在器官發(fā)生能力上有相當(dāng)大的差別。木本觀賞植物組培所用的外植體,通常是樹(shù)木的幼年組織,如胚、子葉、實(shí)生苗嫩莖等。楊樹(shù)的組織培養(yǎng),多數(shù)是選用芽作外植體。Whitehead和Giles曾利用腋芽作為外植體培養(yǎng)3種楊樹(shù)。Christie也應(yīng)用大致同樣的方法,成功地繁殖了銀白楊、歐洲山楊、美洲山楊、灰楊及銀白楊與腺楊的雜種。木本觀賞植物的外植體初分化率一般較低,需要選擇在生理活性旺盛的春季進(jìn)行培養(yǎng)。傅萼輝等以梅花早春萌動(dòng)的腋芽為外植體,在自制的WB培養(yǎng)基上,實(shí)現(xiàn)了梅花的離體快速繁殖。Fontanel等從銀杏雌配子體中誘導(dǎo)胚狀體的發(fā)生,指出誘導(dǎo)的最佳時(shí)期是授粉后8~10周。段祖安等用金脈連翹的母樹(shù)嫩莖段作外植體誘導(dǎo)率高,分化增殖系數(shù)大。張進(jìn)獻(xiàn)等利用細(xì)葉連翹的莖和莖尖,成功地實(shí)現(xiàn)了細(xì)葉連翹的組織培養(yǎng)和快速繁殖。3.2.2采用不同的培養(yǎng)基選用適宜的培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵問(wèn)題之一。根據(jù)不同的培養(yǎng)目的(誘導(dǎo)愈傷組織、不定芽、分化、生根),所選用的培養(yǎng)基亦應(yīng)有所不同。用于木本觀賞植物組培快繁的培養(yǎng)基有MS、WPM、SH、CM、改良的Nitsch等基本培養(yǎng)基,其中大多數(shù)采用的是經(jīng)過(guò)改良的MS培養(yǎng)基。英國(guó)人Wolter改良了基本培養(yǎng)基,成功地誘導(dǎo)出美洲山楊的莖。Lioyp和Mccown在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,針對(duì)木本植物的特點(diǎn),曾創(chuàng)出一種專(zhuān)門(mén)用于木本植物的培養(yǎng)基WPM(WoodyPlantMedium),其中許多成分較MS有一定的改變。Arrillaga等把刺槐子葉接種在木本培養(yǎng)基上,不僅芽長(zhǎng)高,而且誘導(dǎo)出新芽。鄭均寶等采用松科植物專(zhuān)用的NH培養(yǎng)基進(jìn)行臘梅嫩莖段的離體快繁,獲得成功。杜盛等在脫皮榆離體培養(yǎng)中,采用全量和大量減半的MS培養(yǎng)基2種無(wú)機(jī)鹽濃度進(jìn)行不定根誘導(dǎo),結(jié)果表明,在叢生芽誘導(dǎo)時(shí)期全量MS培養(yǎng)基優(yōu)于大量減半的MS培養(yǎng)基,但大量減半的MS培養(yǎng)基卻利于不定根的誘導(dǎo)。3.2.3生長(zhǎng)素的應(yīng)用木本觀賞植物組織培養(yǎng)中常用的植物激素有IAA、NAA、2,4-D等生長(zhǎng)素,赤霉素GA,以及BA、KT、ZT等細(xì)胞分裂素。其中,BA、ZT和2,4-D多用于叢生芽或愈傷組織的增殖過(guò)程,IAA、NAA和IBA等多用于生根培養(yǎng)。有時(shí)還添加肌醇、環(huán)烷酸鈉、LH、Vc、ABT等其他物質(zhì),以促進(jìn)離體培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)發(fā)育。木本觀賞植物組織培養(yǎng)中外植體的誘導(dǎo)及增殖不僅與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)有關(guān),而且還與它的組合及濃度有關(guān)。在觀賞植物組培中,為避免發(fā)生變異,大多希望較少產(chǎn)生愈傷組織,能盡快出苗。因此,生長(zhǎng)素用量宜適當(dāng)控制。吳麗圓等以藍(lán)桉的芽器官作為外植體,在2,4-D的作用下,經(jīng)過(guò)脫分化過(guò)程較易引起染色體變異,而且愈傷組織多次繼代培養(yǎng)后易喪失分化能力。田英翠等利用大葉惠蘭的原球莖進(jìn)行不同濃度激素和復(fù)合添加物對(duì)其影響的試驗(yàn),結(jié)果表明,適當(dāng)濃度的激素可以控制原球莖的發(fā)育方向,適當(dāng)濃度的復(fù)合添加物可促其快速增殖。生長(zhǎng)素對(duì)組培中外植體不定根的誘導(dǎo)有較顯著的作用。通過(guò)對(duì)不同生長(zhǎng)素作用效果差異的研究發(fā)現(xiàn),多數(shù)種類(lèi)中IBA不僅促進(jìn)生根效果好,而且根的進(jìn)一步生長(zhǎng)較正常。在一些種類(lèi)中,IAA和NAA也被廣泛應(yīng)用。一般認(rèn)為,生長(zhǎng)素在較低濃度對(duì)發(fā)根有利。細(xì)胞分裂素對(duì)組培中不定芽的分化及增殖有著顯著作用,不同種類(lèi)的細(xì)胞分裂素對(duì)不同的材料作用差異較大,但大多數(shù)種類(lèi)以BA最為有效。汪景山等在山楂的組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),低濃度的BA可促進(jìn)不定芽的分化,提高濃度則產(chǎn)生叢生芽,并抑制節(jié)間生長(zhǎng);低濃度的ZT可促進(jìn)芽的分化,但不及BA產(chǎn)生的芽多。細(xì)胞分類(lèi)素對(duì)愈傷組織的形成也有明顯作用。WooJH等認(rèn)為在含有BA的MS培養(yǎng)基上,莖培養(yǎng)比其它器官培養(yǎng)產(chǎn)生較多的愈傷組織。劉鵬等在研究外源激素對(duì)七子花幼葉愈傷組織影響時(shí)發(fā)現(xiàn),低濃度的ZT能有效地促進(jìn)愈傷組織的分化與生長(zhǎng)。木本觀賞植物組織培養(yǎng)中,還經(jīng)常加入其他的有機(jī)物。Civinova等在研究樹(shù)