四氯化碳、酒精致sd大鼠肝纖維化模型病理學(xué)改變

四氯化碳、酒精致sd大鼠肝纖維化模型病理學(xué)改變

肝纖維是指肝臟內(nèi)彌射細(xì)胞（尤其是膠原）的過度沉積。它不是一個(gè)獨(dú)立的疾病,而是許多慢性肝病的共同病理過程。幾乎各種慢性肝臟疾病均可引起肝纖維化,其病因大致可分為感染性(慢性乙型、丙型和丁型病毒性肝炎,血吸蟲病等),先天性代謝缺陷(肝豆?fàn)詈俗冃?、血色病、?-抗胰蛋白酶缺乏癥等)及化學(xué)毒物性(慢性酒精性肝病、慢性藥物性肝病)及自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化和原發(fā)性硬化性膽管炎等。本實(shí)驗(yàn)采用3種不同方法分別建立四氯化碳、酒精與四氯化碳聯(lián)合、膽管結(jié)扎致SD大鼠肝纖維化模型,并對(duì)3種肝纖維化模型大鼠肝臟病理學(xué)改變進(jìn)行比較,初步探討肝纖維化病變發(fā)生機(jī)制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動(dòng)物監(jiān)測(cè)編碼SPF級(jí)SD大鼠,34只,雄性,4周齡,體重180~220g,由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證粵監(jiān)證字號(hào):SCXK(粵)2008-0002,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):0056726。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過。1.1.2境設(shè)施合格號(hào)SD大鼠飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境設(shè)施合格證號(hào):0028828,室內(nèi)溫度20~25℃,相對(duì)濕度40~70%,換氣量10~12次/h,照明12h明暗交替;用標(biāo)準(zhǔn)大鼠箱飼養(yǎng),每箱5只,水料充足,SPF級(jí)飼料產(chǎn)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.1.3試劑與標(biāo)準(zhǔn)品四氯化碳:廣州市中南化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):060213;橄欖油:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):F20040614;戊巴比妥鈉:北京化學(xué)試劑公司,規(guī)格:25g,批號(hào):061222;酒精:北京紅星股份有限公司,規(guī)格:2L,純度:60%;吡唑:上海晶純?cè)噭┯邢薰?規(guī)格:25g,純度:98%,批號(hào):11169;玉米油:益海嘉里食品營(yíng)銷有限公司,規(guī)格:900mL。病理檢測(cè)試劑:乙醇、二甲苯、甲醛、蘇木素、伊紅等。1.1.4實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備YP3001N電子d平:上海精密科學(xué)儀器有限公司;PB203-N電子分析d平:梅特勒-托利多公司產(chǎn)品;全自動(dòng)生物組織脫水機(jī),湖北宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司,型號(hào):TS-12N;輪轉(zhuǎn)切片機(jī),德國(guó)徠卡,型號(hào):RM2135;全自動(dòng)生物組織染色機(jī),湖北宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司,型號(hào):RS-18Ⅱ;熒光病理圖像分析系統(tǒng),型號(hào):OLYMPUSBX41。1.2方法1.2.1酒精與四氯化碳聯(lián)合組5.SD大鼠隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組8只,四氯化碳組8只,酒精與四氯化碳聯(lián)合組9只,膽管結(jié)扎組9只。四氯化碳組以3mg/kg的劑量(首次劑量加倍)皮下注射50%四氯化碳(四氯化碳∶橄欖油=1∶1),每周2次,連續(xù)注射6周;酒精與四氯化碳聯(lián)合組每日按照10mL/kg劑量灌服酒精混合物(酒精∶吡唑∶玉米油=10mL∶25mg∶2mL),同時(shí)每周2次按0.3mL/kg劑量給予腹腔注射四氯化碳:橄欖油(1∶3),連續(xù)造模60d;膽管結(jié)扎組大鼠按10mg/kg體重腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,腹部皮膚消毒,無菌操作沿腹部正中線剪開腹腔,分離出膽管,在膽管近端和遠(yuǎn)端2處結(jié)扎膽管,28d后結(jié)束造模。1.2.2石蠟切片的制備實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將大鼠用乙醚麻醉后處死,解剖觀察肝臟病變,并采取肝臟組織用10%福爾馬林固定48h,按常規(guī)程序制作石蠟切片,切片厚度4μm,HE染色,masson三色染色顯微鏡下觀察并拍照。觀察肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)是否紊亂,小葉內(nèi)肝細(xì)胞是否變性、壞死,匯管區(qū)有無纖維組織增生、小膽管增生和炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。1.2.3纖維間隔形成肝纖維化分期半定量評(píng)估采用Scheuer評(píng)分系統(tǒng):0分:無纖維化;1分:匯管區(qū)擴(kuò)大;2分:匯管區(qū)纖維化,少量間隔形成;3分:纖維間隔形成明顯伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂;4分:可能或肯定的肝硬化。肝纖維化病變定量分析:每份標(biāo)本在低倍視野(10×10)下依次選取左上、右上、左下、右下、中間5個(gè)視野(共1.5mm2),采用Image-ProPlus6.0軟件測(cè)定視野內(nèi)肝纖維化病變總面積。1.2.4統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件,組間比較采用One-WayANOVA比較。2結(jié)果2.1大鼠肝臟變化正常對(duì)照組大鼠肝臟表面暗紅,邊沿銳利,質(zhì)地軟;四氯化碳組大鼠肝臟呈灰黃色,飽滿粗糙,表面有大小不等的結(jié)節(jié),質(zhì)硬,韌性大;膽管結(jié)扎組大鼠肝臟腫大,呈黃綠色,質(zhì)地中等硬,膽總管自結(jié)扎處以上明顯擴(kuò)張;酒精與四氯化碳聯(lián)合組大鼠肝臟較正常肝臟暗淡,質(zhì)地偏硬,部分表面凹凸不平。2.2大鼠肝臟肝心功能損害情況正常對(duì)照組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,小葉內(nèi)肝細(xì)胞索排列較整齊,肝細(xì)胞大小均勻,無變性、壞死,匯管區(qū)未見纖維組織增生和小膽管增生。四氯化碳組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)不清甚至被破壞,肝細(xì)胞彌漫脂肪變性,匯管區(qū)及中央靜脈周圍見少量至中量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),纖維組織增生較明顯。酒精與四氯化碳聯(lián)合組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)不清甚至被破壞,局灶至彌漫肝細(xì)胞水腫伴脂肪變性,匯管區(qū)及中央靜脈周圍見少量至中量炎細(xì)胞浸潤(rùn),纖維組織增生明顯。膽管結(jié)扎組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)不清甚至被破壞,肝細(xì)胞未見變性,小葉內(nèi)及匯管區(qū)見少量至中量炎細(xì)胞浸潤(rùn),小膽管伴纖維組織增生明顯。參見彩插4圖1。2.3肝纖維化模型四氯化碳組、酒精與四氯化碳聯(lián)合組、膽管結(jié)扎組大鼠肝纖維化程度與正常對(duì)照組比較顯著增加(P<0.01)。結(jié)果提示四氯化碳、酒精與四氯化碳聯(lián)合、膽管結(jié)扎致SD大鼠肝纖維化模型造?；境晒ΑＤ懝芙Y(jié)扎組大鼠肝纖維化程度較四氯化碳組、酒精與四氯化碳聯(lián)合組加重。參見表1。3氯化碳模型、酒精、肝臟疾病模型及常見膠原纖維病變本實(shí)驗(yàn)分別采用多次皮下注射50%四氯化碳、膽管近端和遠(yuǎn)端2處結(jié)扎膽管、酒精混合液灌胃結(jié)合微量四氯化碳腹腔注射復(fù)合因素等方法成功建立肝纖維化大鼠模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,四氯化碳、酒精與四氯化碳聯(lián)合、膽管結(jié)扎均可誘發(fā)SD大鼠肝纖維化的形成,四氯化碳組大鼠可見肝細(xì)胞的彌漫性脂肪變性和炎細(xì)胞浸潤(rùn),酒精與四氯化碳聯(lián)合組大鼠可見肝細(xì)胞的酒精性水腫伴脂肪變性和炎細(xì)胞浸潤(rùn),膽管結(jié)扎組大鼠可見小膽管的明顯增生和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。其中,膽管結(jié)扎模型屬于膽汁性肝硬化,適合于模擬臨床膽汁性肝硬化(由膽管堵塞、膽道先d畸形、寄生蟲等因素引起膽汁淤積所致肝硬化),其病變以間質(zhì)、膽管增生為主,早期肝細(xì)胞正常,晚期才出現(xiàn)肝細(xì)胞的變性、壞死。四氯化碳模型屬于化學(xué)毒物性肝硬化,適合于模擬臨床化學(xué)藥物性肝硬化(由長(zhǎng)期、慢性化學(xué)藥物中毒引起),其病變以肝細(xì)胞變性、壞死以及肝小葉改建為假小葉為主。酒精與四氯化碳聯(lián)合模型屬于酒精性肝硬化,適合于模擬臨床酒精性肝硬化(由長(zhǎng)期、慢性酒精中毒引起),其病變與其它化學(xué)藥物以及各種病毒性肝炎引起肝硬化的病變相類似,均以肝細(xì)胞變性、壞死以及肝小葉改建為假小葉為主。肝纖維化的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,多項(xiàng)研究表明,很多不同的因素(病毒性肝炎、慢性酒精中毒、營(yíng)養(yǎng)不良、有毒物質(zhì)的損傷作用等)均可引起肝細(xì)胞的損害,如長(zhǎng)期作用,反復(fù)發(fā)作,可導(dǎo)致肝內(nèi)廣泛的膠原纖維增生,增多的膠原纖維來源有兩種:其一為肝細(xì)胞壞死后,肝小葉內(nèi)原有的網(wǎng)狀支架塌陷、聚積、膠原化或由肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生膠原纖維;其二為匯管區(qū)的成纖維細(xì)胞增生并分泌產(chǎn)生,廣泛增生的膠原纖維向肝小葉內(nèi)延伸,分割肝小葉,嚴(yán)重時(shí)肝小葉內(nèi)的膠原纖維連接成纖維間隔包繞原有的或再生的肝細(xì)胞團(tuán),形成假小葉,這些病變隨著肝細(xì)胞不斷壞死與再生而反復(fù)進(jìn)行,最終形成彌漫全肝的假小葉,并導(dǎo)致肝內(nèi)血液循環(huán)改建和肝功能障礙而形成肝硬化。四氯化碳、酒精、膽管結(jié)扎這三種因素可引起肝細(xì)胞變性、小膽管增生、肝炎等肝臟損傷,后經(jīng)反復(fù)作用,從而進(jìn)一步導(dǎo)致肝內(nèi)廣泛的膠原纖維增生。目前,針對(duì)肝纖維