1四氯化碳ccl4肝毒性的研究進展

1四氯化碳ccl4肝毒性的研究進展

肝臟疾病的實驗模型是實驗和臨床假設的基礎。該模型的建立有助于研究肝臟疾病的病因、病理生理和治療。藥物中毒性肝損傷模型的建立1.四氯化碳(CCl4)CCl4是最早、最廣泛應用于實驗性肝損傷動物模型的選擇性肝毒性物質(zhì),機制為:CCl4的活性代謝產(chǎn)物三氯甲基根(-CCL3)刺激產(chǎn)生活性中間產(chǎn)物(ROI),造成脂質(zhì)過氧化,引起細胞損害,結(jié)締組織產(chǎn)生過多。誘導微粒體細胞色素P450同工酶活性的物質(zhì)可增加CCl4產(chǎn)物的肝毒性,因此在制模過程中加入戊巴比妥或乙醇代替飲水是加速肝損傷進程的常用方法。急性肝功能衰竭模型:SD大鼠(體重250~320g)4ml/kg,CCl4灌胃;肝纖維化模型有單純法和復合法。單純法:采用Wistar大鼠(體重85~95g),腹腔注射CCl40.025ml(以花生油1∶6稀釋),每周3次,共4周;采用Wistar大鼠,40%CCl4石蠟油溶液第1天皮下注射0.5ml/100kg體重,以后每隔4d皮下注射0.3ml/100kg體重,共10次;SD大鼠(體重230~260g),輪替四肢皮下注射50%植物油CCl4溶液0.3ml/100kg體重,每周2次,共8周。復合法:Mclean在飲水中加入苯巴比妥(350ml/l),CCl4蒸氣吸入;Proctor讓大鼠飲用含苯巴比妥(350ml/l)的水2周肝極度腫大后,以CCl4灌胃0.2ml/kg體重,5d1次,8~10周成模;韓德五以高脂蛋白食物(玉米面)為大鼠飼料,加0.5%膽固醇,實驗第1、2周加20%豬油),以30%酒精為唯一飲料,皮下注射CCl4(第一次用0.5ml/100kg體重,以后每隔3d皮下注射40%油劑CCl40.3ml/100kg體重,共6周);孫敬方向Wistar或SD大鼠皮下注射45%~50%油溶液,0.3ml/100kg體重,每周2次,第2周開始,隔日以20%~30%乙醇1ml灌胃,飼以混有0.5%膽固醇低膽堿飼料,共8周。以上所述為幾種經(jīng)典、具有代表性的方法,其它很多方法都是在此基礎上的改良,如腹腔內(nèi)注射CCl4加飲用苯巴比妥鈉和食用酒精等。目前多選用鼠造模,因鼠繁殖力強,生命力旺盛,價格低廉,也有選用兔,因兔血容量大,肝臟大小適中,其肝損傷易于生化及影像學觀察,選用大動物模型如犬亦有成功報道。給藥途徑有多種,如皮下注射、腹腔注射、灌胃、蒸氣吸入或拌于食物中快速口服等,優(yōu)劣各家說法不一。灌胃法CCl4經(jīng)過門靜脈系統(tǒng)吸收,直接進入肝臟,模型制備理想,但操作復雜,腸道反應大;腹腔內(nèi)注射門靜脈濃度高,肝損傷形成時間短,但病死率較高(20%~35%);皮下注射較腹腔注射具有如下缺點,造模周期長,動物病死率高,相應增加了實驗經(jīng)費,因操作不當可以發(fā)生皮下滲漏,但操作簡便;蒸氣吸入需快速吸入,呼吸道刺激大,動物不耐受,中樞毒性大,易污染環(huán)境和傷害實驗人員;溶于少許食物快速口服,少吃多餐,揮發(fā)減少,濃度低胃腸刺激減小,但受動物食欲影響,劑量難以掌握,實驗終點不明確,周期長。2.D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-GalN)半乳糖胺是一種肝細胞毒性藥物,可在短時間內(nèi)引起嚴重肝損害,其作用機制是:①通過抑制肝細胞的RNA和漿膜蛋白合成造成肝細胞壞死;②肝細胞壞死與細胞外Ca2+大量進入細胞內(nèi)有關;③一些研究指出,腸外因素,包括胃腸通透性增加,細菌的移位和內(nèi)毒素等都增加了半乳糖胺的肝臟毒性。急性肝功能衰竭模型:大白豬頸外靜脈置管注射半乳糖胺(0.75g/kg體重),給藥18h,肝功能損害開始明顯,至48h達高峰,治療肝功能衰竭的各種措施可在這段時間內(nèi)進行試驗,該模型適合進行人工肝臟支持治療的研究;家豬經(jīng)門靜脈注射半乳糖胺0.5g/kg和脂多糖1μg/kg,與單用半乳糖胺(1g/kg)外周靜脈注射誘導大動物急性肝功能衰竭模型相比,半乳糖胺用量減少了一半,聯(lián)合應用脂多糖,兩藥有明顯協(xié)同作用。長期小劑量可導致肝纖維化和肝癌。半乳糖胺誘發(fā)的急性肝功能衰竭模型癥狀、生化、組織學表現(xiàn)接近人,重復性好,而且不造成環(huán)境污染及人體傷害等,對肝衰竭、肝性腦病、人工肝支持系統(tǒng)的評價研究有重要價值,缺點為半乳糖胺較昂貴。3.甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)DMN是常見的致肝癌劑,它通過微粒體代謝,其中間產(chǎn)物與細胞核酸、蛋白質(zhì)等結(jié)合致肝損傷,同時產(chǎn)生一種活性甲基化產(chǎn)物使核酸、蛋白質(zhì)甲基化導致肝壞死。急性肝損傷:單劑后12~18h出現(xiàn)肝細胞出血壞死周圍細胞脂變,24h廣泛壞死,嗜酸性變性,脂肪沉著,凋亡小體出現(xiàn),6d后壞死消失,殘留組織纖維增生,靜脈扭曲。肝纖維化模型:SD大鼠按10mg/kg體重,給予1%DMN生理鹽水稀釋液,腹腔注射10次。DMN誘發(fā)肝纖維化周期短,動物病死率低,肝纖維化形成相對穩(wěn)定,主要用于肝硬化形成和門脈高壓機制的研究,還用于肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)化機制的研究。缺點為DMN毒性大,易揮發(fā),排泄物在24h內(nèi)含毒物,易污染環(huán)境和影響周圍人群。4.對乙酰氨基酚(acetaminophen,PAPA)PAPA是一種肝毒物,是經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后形成親電子代謝物致肝損傷的樣板,PAPA常用于制作急性肝功能衰竭模型,P450誘導劑加重肝損傷,先予以P450誘導劑和GSH合成酶抑制劑,再予PAPA復制的兔急性肝功能衰竭模型與人急性肝功能衰竭臨床特點,組織學表現(xiàn)相似,是較理想的急性肝功能衰竭模型。5.其它硫代乙酰胺在實驗性肝損傷動物中致肝癌,肝細胞損傷反應好,肝纖維化組織接近人類肝硬化表現(xiàn),誘發(fā)急性肝功能衰竭可表現(xiàn)肝性腦病,常用于制作肝纖維化和急性肝功能衰竭模型。另外,乙硫氨酸(ethionine),二甲基偶氮苯及黃曲霉素也可使肝細胞發(fā)生中毒性肝損傷。酒精性肝損傷動物模型的建立酒精對肝損害的機制尚未完全闡明,可能是炎癥和免疫病理共同作用的結(jié)果,蛋白質(zhì)和各種營養(yǎng)物質(zhì)缺乏會加重酒精的肝損害。高濃度的酒精引起急性肝損傷,產(chǎn)生大量毒性代謝產(chǎn)物和乙醛,并釋放腎上腺素,引起肝臟血管收縮,肝竇內(nèi)壓升高和肝細胞缺氧,導致空泡變性,肝細胞溶解壞死。對酒精引起的慢性肝損傷研究較多。Liber-DeCarli液體食物模型:按熱量配置,蛋白質(zhì)占18%,脂肪21%,糖61%(糖熱量的50%由乙醇提供),管飼狒狒實驗1~3年,1/3狒狒發(fā)生肝硬化,液體食物可完全控制食物與酒精的攝入量,該模型與人類酒精性肝硬化極為相似,但實驗動物昂貴,實驗周期長,推廣困難。TsuKamoto-French模型:該模型采用大鼠,飼液體食物,采用植入人工胃管,酒精占攝入總熱量的47%,該模型可完全控制乙醇和營養(yǎng)物的攝入量,符合進行性酒精性肝損傷,從肝脂變、小葉中心壞死、炎癥到肝細胞周圍、靜脈周圍肝纖維化。河金福等在大鼠常規(guī)喂養(yǎng)同時灌入酒精(56%)、橄欖油等的混合液,4周后電鏡下可見肝細胞周圍膠原纖維增生。陸倫根等用60%酒精按1.5ml/100g體重的劑量,灌胃,每日2次,低脂飲食,實驗動物自由飲水,6個月后肝細胞周圍脂肪變加重,可見中央靜脈周圍和竇周纖維化,高脂飲食可加重上述表現(xiàn)。丁霞等對Wistar大鼠每日清早灌胃白酒-玉米油-吡唑混合液,間斷給予高脂飼料,其中酒精攝入量為每天8~12g/kg隨時間的延長而遞增;玉米油的攝入量為每天2g/kg,吡唑的攝入量為24mg/kg造模時間為12周,經(jīng)Masson三色染色證實肝組織中膠原纖維明顯增生。乙醇與CCl4聯(lián)合應用造模已有較多成功報道。吳孟超報道在小鼠使用該方法60d即可致肝硬化,肝硬化穩(wěn)定,分期明顯,動物病死率低。此類模型可廣泛用于酒精性肝病的研究,依其處于不同時期可作酒精性脂肪肝及肝纖維化的研究。免疫學方法誘發(fā)肝損傷模型1.異種血清異種動物血清誘導的肝損傷-肝纖維化模型產(chǎn)生機制,被認為是白蛋白免疫復合物所致的Ⅲ型變態(tài)反應。王寶恩等建立了良好的免疫性肝纖維化動物模型,采用人血清白蛋白給大鼠皮下注射,抗體產(chǎn)生后,尾靜脈注射白蛋白。小劑量組16周80%動物形成肝纖維化乃至肝硬化,病死率20%~30%;大劑量組,30d可形成肝硬化,但病死率高,加入PGE可降低病死率至5%。異種血清腹腔注射法:可選用豬、牛、羊等血清,其中以豬血清最為常用,SD或Wistar大鼠,豬血清0.5ml/次腹腔注射,每周2次,12周后肝內(nèi)廣泛纖維組織增生,假小葉形成,有典型肝硬化表現(xiàn)。2.刀豆蛋白A(conA)conA是植物凝集素,有促進有絲分裂的作用,可以引起T細胞介導的肝損傷,損傷有肝特異性和劑量依賴性。小鼠靜脈注射conA(20mg/kg體重)后6~8h可見肝細胞凋亡壞死和明顯的淋巴細胞浸潤,腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ等細胞因子血清水平升高。小鼠尾靜脈注射1mol/lconA(12.5mg/kg),每周1次,連續(xù)6周后,常規(guī)病理切片HE染色發(fā)現(xiàn)肝小葉破壞,結(jié)構(gòu)紊亂,肝壞死明顯。另外,細菌細胞壁產(chǎn)物,如大鼠腹腔內(nèi)注射由鏈球菌細胞壁提取物聚糖-多糖,亦可引起T細胞介導的肝纖維化。上述免疫性肝損傷模型與人類肝炎后肝纖維化的形成機制較一致,但仍有較大差距,因為它沒有病毒復制和肝實質(zhì)持續(xù)損傷的過程。此類模型有利于從免疫學角度探討發(fā)病機制和評價藥物療效。手術肝損傷實驗動物模型主要用于急性肝功能衰竭模型研究肝移植、細胞移植和人工肝治療效果,根據(jù)實驗動物的不同術式較多。Terblanche提出理想的暴發(fā)性肝衰竭模型應具有6個特征,即可重復性、肝衰竭致死、有治療窗、治療后可逆、大動物模型和對實驗人員危害小。部分肝切除、全肝切除術僅適合肝移植肝切除后到供肝行使功能期間的研究,亦有采用門腔端-側(cè)分流、膽總管結(jié)扎切斷術建立了較理想的犬急性肝功能衰竭模型,有望用于生物人工肝的研究。陳鐘行95%肝切除,術中經(jīng)中葉肝靜脈注入5%葡萄糖氯化鈉溶液(10ml/kg體重),建立了較理想的大鼠急性肝功能衰竭模型,并指出與傳統(tǒng)手術方法相比,經(jīng)中葉肝靜脈注入5%葡萄糖氯化鈉降低了病死率,藥物誘導肝衰竭法在肝細胞移植時藥物可對植入的肝細胞產(chǎn)生毒性損害,可能影響治療,干擾實驗結(jié)果,單純膽總管結(jié)扎、膽管內(nèi)逆行性注入N-丁基-2氰基丙烯酸鹽加膽管結(jié)扎均可建立膽管阻塞性肝纖維化模型,且具有炎癥反應輕、造模周期短、自發(fā)逆轉(zhuǎn)低,實驗指標穩(wěn)定等優(yōu)點。α-萘異硫氰酸鹽溶于油中,按50~150mg/kg體重的劑量給大鼠灌胃可誘發(fā)膽汁性肝纖維化