比較雷米普利與卡托普利對(duì)糖尿病大鼠心肌間質(zhì)重構(gòu)的影響

比較雷米普利與卡托普利對(duì)糖尿病大鼠心肌間質(zhì)重構(gòu)的影響【摘要】目的：通過(guò)觀察雷米普利與卡托普利對(duì)糖尿病大鼠心臟指數(shù)、心肌局部血管緊張素Ⅱ、Caspase3蛋白陽(yáng)性染色指數(shù)、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響，探討兩者對(duì)糖尿病大鼠心肌病的可能保護(hù)機(jī)制。方法：40只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為10只正常對(duì)照組和30只糖尿病組，糖尿病組用鏈脲佐菌素注射建模，成功后隨機(jī)分為糖尿病未治療組、雷米普利治療組和卡托普利治療組，每組10只。治療組按藥品說(shuō)明書(shū)的推薦以雷米普利/()水溶液灌胃，卡托普利50mg/水溶液灌胃，正常對(duì)照組和糖尿病對(duì)照組每天以同等體積生理鹽水灌胃。給藥9周后，麻醉處死動(dòng)物，放射免疫法測(cè)定心肌局部AngⅡ的含量，ABC免疫組化法檢測(cè)Caspase3蛋白陽(yáng)性染色指數(shù)，免疫組化法檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量。結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，糖尿病對(duì)照組與治療組心臟指數(shù)均增大，AngⅡ含量顯著升高,心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增高,Caspase3蛋白陽(yáng)性染色指數(shù)也增高；用雷米普利和卡托普利治療后，上述指標(biāo)均有顯著改善，雷米普利組較卡托普利組心臟指數(shù)、Ⅰ、Ⅲ型膠原含量改善不明顯,其余指標(biāo)兩組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。結(jié)論：糖尿病心肌病中心肌間質(zhì)有重構(gòu)現(xiàn)象發(fā)生，雷米普利與卡托普利均可以通過(guò)降低AngⅡ、Caspase3陽(yáng)性蛋白指數(shù)來(lái)改善心臟的功能，而且兩組相比稍有差別。

【關(guān)鍵詞】糖尿病心肌??；間質(zhì)重構(gòu)；雷米普利；卡托普利；AngⅡ；Caspase3

糖尿病心肌病這個(gè)觀點(diǎn)已經(jīng)得到實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，但對(duì)于糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制并不完全明了。本研究使用非降糖藥血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑雷米普利、卡托普利對(duì)糖尿病性心肌病進(jìn)行干預(yù)，比較兩藥對(duì)糖尿病心肌病心肌間質(zhì)的保護(hù)作用，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

材料

主要試劑鏈脲佐菌素(STZ)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，免疫組化抗體購(gòu)自晶美生物技術(shù)公司,AngⅡ放射免疫分析試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所。

動(dòng)物分組健康雄性SD大鼠36只，體重210～250g,平均g,購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。隨機(jī)分為正常對(duì)照組和糖尿病組，喂養(yǎng)一周后，糖尿病組禁食10h,一次性腹腔注射STZ(用枸櫞酸鈉緩沖液溶解，pH=4．5)50mg/kg，正常對(duì)照組注射同等劑量的枸櫞酸鈉緩沖液，72小時(shí)斷尾后測(cè)血糖值及尿糖定性，尿糖定性≥+++，空腹血糖持續(xù)3天≥／L(250mg／d1)，動(dòng)物進(jìn)食、進(jìn)水、尿量增加，為糖尿病大鼠模型。然后再隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組、雷米普利治療組、卡托普利治療組，每組9只，4組大鼠繼續(xù)以原飼料喂養(yǎng)8周，每周測(cè)空腹血糖一次，監(jiān)測(cè)血糖的變化。

方法

取材禁食10h,每只動(dòng)物稱取體重后,乙醚麻醉,解剖后迅速取出心臟,稱心臟(HW)和左心室(含室間隔LVW)重量。以HW/BW為心臟指數(shù),取部分左室心肌組織甲醛固定，免疫組化法測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)。

放射免疫法檢測(cè)AngⅡ含量取新鮮標(biāo)本100mg,采用AngⅡ放射免疫試劑盒，按照說(shuō)明測(cè)定AngⅡ的含量。

心肌組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)用于Ⅰ型、Ⅲ型膠原的檢測(cè)。采用石蠟切片,切片厚4μm抗原染色,按染色試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,于顯微鏡下觀察。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,采用高清晰彩色圖文報(bào)告分析系統(tǒng)分析,以5個(gè)光密度值(OD值)的平均值作為各標(biāo)本的蛋白表達(dá)。

原位心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)左心室前壁心肌常規(guī)制作組織切片，每張玻片上攤5個(gè)組織片，然后按原位細(xì)胞凋亡試劑盒的說(shuō)明，檢測(cè)凋亡細(xì)胞切片。常規(guī)二甲苯脫蠟、下行梯度酒精脫水，蛋白酶K消化，37℃濕盒內(nèi)孵育，PBS洗3次，37℃濕盒內(nèi)4%小牛血清封阻非特異性反應(yīng)，滴加POD置37℃濕盒內(nèi)孵育，PBS洗3次，DAB染色，自來(lái)水終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。

凋亡細(xì)胞陽(yáng)性指數(shù)：根據(jù)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的分布情況，每張切片于光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)無(wú)重疊視野，每視野計(jì)數(shù)300個(gè)心肌細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)，以平均計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)所占的百分比作為凋亡細(xì)胞陽(yáng)性指數(shù)(apoptosisindex,AI)。

Caspase3陽(yáng)性蛋白表達(dá)率檢測(cè)石蠟包埋切片后按ABC試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。免疫組化染色胞漿或胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，以平均計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)所占的百分比作為caspases3陽(yáng)性蛋白表達(dá)率。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各參數(shù)均以±s表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,組間參數(shù)比較采用方差分析，規(guī)定說(shuō)明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

27只糖尿病大鼠均建模成功，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中糖尿病大鼠與正常對(duì)照組相比，活動(dòng)明顯減少，多飲、多尿、多食，血糖值穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因感染，糖尿病對(duì)照組、雷米普利組各死亡1只。死亡動(dòng)物未納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

4組大鼠心臟指數(shù)、體重、膠原含量的比較

與正常對(duì)照組相比，糖尿病未治療組、雷米普利組、卡托普利組試驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重明顯減輕,Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達(dá)增多,說(shuō)明存在心肌間質(zhì)重構(gòu)。糖尿病未治療組、雷米普利組心臟指數(shù)升高；與糖尿病對(duì)照組相比較，卡托普利組體重減輕明顯,雷米普利組與卡托普利組的心臟指數(shù)、Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達(dá)均有明顯變化。見(jiàn)表1。表14組體重、心臟指數(shù)、膠原含量比較注：*表示與N相比，差異有顯著性；#表示與DM相比，差異有顯著性。

治療后卡托普利組較糖尿病對(duì)照組體重?zé)o顯著性增加,輕于雷米普利組?？ㄍ衅绽M心臟指數(shù)高于雷米普利組。卡托普利組較雷米普利組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的含量增高。

4組血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、AI、Caspase3蛋白陽(yáng)性染色指數(shù)的比較

與正常對(duì)照組相比，糖尿病未治療組、雷米普利組、卡托普利組AngⅡ、AI、Caspase3蛋白陽(yáng)性染色指數(shù)均增加明顯；與糖尿病組相比，雷米普利組和卡托普利組AngⅡ、AI、Caspase3蛋白陽(yáng)性染色指數(shù)均降低。見(jiàn)表2。表2四組AngⅡ含量、AI和Caspase3蛋白陽(yáng)性染色指數(shù)比較注：*與N相比，差異有顯著性；與DM相比，差異有顯著性。

治療后組間比較：雷米普利組與卡托普利組之間在AngⅡ含量、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、Caspase3蛋白陽(yáng)性染色指數(shù)方面差別不明顯，都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

糖尿病心肌病是指由糖尿病引起心臟微血管病變和心肌代謝紊亂所致的心肌廣泛局灶性壞死等損害。糖尿病心肌病通常表現(xiàn)為心肌順應(yīng)性降低和舒張期充盈受阻為主的心室功能異常,可誘發(fā)心力衰竭、心律失常、心源性休克和猝死［1］。最近的研究表明，糖尿病心肌病存在心肌間質(zhì)重構(gòu)現(xiàn)象，是由于心臟成纖維細(xì)胞的過(guò)度增生，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)質(zhì)和量的變化［2］。曹萍等的研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌組織中不僅LN、FN含量增加，而且CL含量也增加明顯，證明在糖尿病心肌組織中確實(shí)存在ECM的積聚［3］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，作為細(xì)胞外基質(zhì)重要組分的Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量也明顯增多，說(shuō)明在糖尿病心肌病的病變過(guò)程中有間質(zhì)重構(gòu)現(xiàn)象的發(fā)生。

在糖尿病早期已增高的AngⅡ即可通過(guò)下調(diào)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p27，影響細(xì)胞周期，直接刺激心肌成纖維細(xì)胞的增值，使成纖維細(xì)胞DNA和蛋白的合成增加而導(dǎo)致心肌纖維化［4］。Frustaci［5］等對(duì)糖尿病合并有高血壓的患者的心肌進(jìn)行了活檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病可上調(diào)RAS，AngⅡ可引起心肌氧化性損傷，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和壞死。這說(shuō)明心肌細(xì)胞的凋亡也參與了糖尿病心肌病的病變過(guò)程之中。而在心肌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，Caspase3蛋白被認(rèn)為是凋亡過(guò)程的主要執(zhí)行者，是凋亡過(guò)程的關(guān)鍵部分［6］。但是關(guān)于凋亡在間質(zhì)重構(gòu)中的作用的研究還比較少，我們的實(shí)驗(yàn)在成功建立了糖尿病模型后，目的就是探討凋亡過(guò)程在心肌間質(zhì)重構(gòu)中的可能作用以及兩類(lèi)ACEI類(lèi)藥物對(duì)其的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在糖尿病組中，AI、Caspase3蛋白陽(yáng)性染色指數(shù)以及AngⅡ的含量均增多，提示凋亡過(guò)程參與了心肌間質(zhì)的重構(gòu)過(guò)程，而且可能與AngⅡ的含量有關(guān)，AngⅡ可能直接或者間接影響了凋亡過(guò)程，從而導(dǎo)致了心肌間質(zhì)重構(gòu)的發(fā)生，為糖尿病心肌病的治療提供了一條嶄新的方向，為臨床治療提供了理論上的支持。

非降糖藥血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑雷米普利與卡托普利治療后，心臟指數(shù)、AngⅡ含量、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)以及Caspase3蛋白陽(yáng)性染色指數(shù)均降低，表明雷米普利和卡托普利均可以通過(guò)抑制AngⅡ來(lái)抑制細(xì)胞凋亡在糖尿病心肌間質(zhì)重構(gòu)中的作用；但是，卡托普利組在減少膠原表達(dá)方面與雷米普利組相比，效果稍差些，這可能與不同類(lèi)別的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑對(duì)ACE的抑制作用強(qiáng)弱不同強(qiáng)弱不同有關(guān)。

【參考文獻(xiàn)】

1張寶生,張宏.糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展.臨床薈萃，2006，13：968～970.

2SearlsYM,SmirnovaIV,FegleyBR,etSelSportsExere,2004，36(11)：1863～1870.

3曹萍,劉銘球,熊世熙，等.福辛普利對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠心肌細(xì)胞外基質(zhì)的影響.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002;23(9):619～622.

4周艷芳，黃培春，鮑波.血管緊張素Ⅱ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞增殖及p21，p2表達(dá)的影響.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2005，21：1129～1131.

5FrustaciA,KajsturaJ,Chi