連錢草總黃酮提取條件優(yōu)化

連錢草總黃酮提取條件優(yōu)化

連草是嘴唇科植物的活血丹glechoma（nakai）kubre，干燥的土壤。具有潤水、通粘液、清熱解毒、祛瘀、消腫等功效。臨床上用于治療熱淋、石淋、濕熱黃疸等疾病。連錢草莖葉含揮發(fā)油,主要含單萜烯類成分,還含有熊果酸、棕櫚酸、琥珀酸、咖啡酸、阿魏酸等。對其非揮發(fā)性成分研究很少。在我國連錢草資源十分豐富,幾乎分布于全國各省,具有極大的開發(fā)價值。目前也有超聲和加熱回流提取連錢草中總黃酮的報道,但未將超聲、加熱、循環(huán)同時應用于提取過程。本研究采用超聲循環(huán)技術對連錢草中總黃酮進行提取,確定影響效果的主要因素和超聲提取黃酮的優(yōu)化工藝條件,為有效的提取連錢草中的總黃酮開辟了新途徑。1藥品、化學品試劑721紫外分光光度計(山東高密分析儀器廠),“弘祥隆”HF-2.0B超聲循環(huán)提取機(北京弘祥隆生物技術開發(fā)有限公司),旋轉蒸發(fā)器RE-52(上海精宏實驗設備有限公司),LD4-2A型低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠),TD系列電子天平(天津市天平電子儀器有限公司)。連錢草(安徽亳州藥材公司,由遼寧中醫(yī)藥大學生藥學賈天柱教授鑒定)粉碎,過80目篩;蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號0080-9705)。乙醇(AR,天津市北方天醫(yī)化學試劑廠),亞硝酸鈉(AR,天津市泰興試劑廠),硝酸鋁(AR,天津市泰興試劑廠),氫氧化鈉(AR,天津市標準科技有限公司)。2方法和結果2.1對照品溶液的制備精密稱取120℃常壓干燥至恒重的蘆丁對照品25.0mg,置于100mL的量瓶中,加60%乙醇約60mL,密塞,超聲使其溶解,放冷,加60%乙醇至刻度,搖勻,得蘆丁對照品溶液(0.25mg·mL-1)。2.2亞硝酸鈉溶液精密量取蘆丁對照品溶液0,1,2,3,4,5mL,分別置于25mL的量瓶中,分別加水5,4,3,2,1,0mL,加5%亞硝酸鈉溶液1mL,搖勻,放置6min,加10%三氯化鋁試液1mL。搖勻,放置6min,再加5%的氫氧化鈉溶液10mL,加水至刻度,搖勻,放置15min后以第1管作空白對照,在510nm測定吸光度,以吸光度值對蘆丁對照品含量繪制標準曲線,回歸方程Y=6.7371X-0.0001,線性范圍0.01~0.05mg·mL-1,r=0.9999。2.3重復試驗取5份供試品溶液0.1mL,按標準曲線繪制項下的方法測定總黃酮含量,結果RSD為0.9%。2.4測定一次吸光度取供試品溶液0.1mL,按標準曲線項下方法操作,并每隔5min測定一次吸光度。結果表明,20min以內(nèi)測定吸光度RSD<2%,建議定容后立即測定。2.5加樣回收試驗取供試品溶液5份,分別加入蘆丁對照品溶液適量,按標準曲線繪制項下的方法測定總黃酮含量,平均回收率101.38%,RSD1.13%,結果表明加樣回收良好。2.6總黃酮含量的測定吸取1mL供試品溶液,然后按標準曲線制備項下方法測定吸光度值,帶入蘆丁標準曲線方程得出質(zhì)量濃度,然后計算各提取液中總黃酮的含量(以蘆丁計),即為得率。公式如下:總黃酮(%)=CV1V21000WV3×100%(%)=CV1V21000WV3×100%C:測定液黃酮質(zhì)量濃度(mg·mL-1);W:藥品量(g);V1:提取定容體積(mL);V2:顯色反應定容體積(mL);V3:顯色反應取樣液體積(mL)。2.7連錢草總黃酮含量的測定按照黃齊慧等在不同采收期對連錢草中總黃酮的影響中采用的提取方法:精密稱取60℃干燥至恒重的樣品粗粉1.0g,置玻璃燒瓶中,加入60%乙醇100mL,水浴加熱回流提取60min,提取2次,過濾,合并濾液,放置24h后,過濾,減壓回收乙醇,加蒸餾水定容至100mL,測定吸光度,計算總黃酮質(zhì)量分數(shù)為5.168%。按照祝德秋等在連錢草中總黃酮的含量測定中采用的提取方法:取連錢草粉末約0.5g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加60%乙醇60mL,密塞,稱定重量,超聲50min。放冷,密塞,再稱定重量,用60%乙醇補足減失的重量,搖勻,過濾,測定吸光度,計算總黃酮質(zhì)量分數(shù)為4.027%。2.8單因素分析2.8.1提取總黃酮含量分別按照固液比1∶100;1∶50;1∶10加入相應的連錢草和60%乙醇,在400W,1000r·min-1,室溫下進行超聲循環(huán)提取20min,測定黃酮吸光度,并算出含量。結果總黃酮質(zhì)量分數(shù)依次為4.425%,3.470%,3.207%。從實驗結果可以得出,固液比為1∶100時提取效率最高,因此以下的單因素分析及正交實驗均采用固液比為1∶100。2.8.2提取溶劑濃度篩選取連錢草24g,分別用梯度乙醇(95%,80%,60%,40%,20%,0%)2400mL,在400W,1000r·min-1,室溫下進行超聲循環(huán)提取20min,測定黃酮吸光度,并算出含量。結果總黃酮質(zhì)量分數(shù)依次為0.714%,2.644%,3.772%,3.890%,3.594%,2.733%。從實驗結果可以得出,從既節(jié)省溶劑又高效的角度可以考慮40%乙醇,但是溶劑濃度降低大量水溶性雜質(zhì)給后續(xù)工作帶來大量麻煩。60%乙醇中黃酮含量較高,因此選擇60%乙醇進行正交實驗。2.8.3測定總黃酮含量取連錢草24g,60%乙醇2400mL,在400W,1000r·min-1,室溫下進行超聲循環(huán)提取,每10min取樣1次,測定黃酮吸光度,并算出含量。即在超聲時間為10,20,30,40,50,60min時,黃酮質(zhì)量分數(shù)依次為2.614%,4.306%,4.380%,4.692%,4.870%,4.900%。從實驗可以看出,隨著時間的增加黃酮質(zhì)量分數(shù)也在增加,但50min以后增長趨緩,因此選擇50min左右進行正交試驗。2.8.4超聲循環(huán)提取總黃酮含量的測定取連錢草24g,60%乙醇2400mL,在400W,1000r·min-1,室溫下進行超聲循環(huán)提取,每次20min,測定黃酮吸光度,并算出含量。提取次數(shù)分別為1,2,3,4次時,總黃酮質(zhì)量分數(shù)依次為4.128%,4.634%,4.635%,4.651%?？梢钥闯?隨著提取次數(shù)的增加黃酮質(zhì)量分數(shù)也隨著增加,但是2次以后含量增長緩慢,因此提取2次即可。2.8.5提取溫度溫度過高乙醇揮發(fā)嚴重,而且雜質(zhì)溶出增加;溫度過低,影響黃酮在乙醇中的溶出。因此,綜合考慮,選取20,30,40℃進行正交實驗。2.9連錢草中總黃酮最佳提取條件的確定選取超聲功率(A)、超聲時間(B)、提取溫度(C)、溶劑體積分數(shù)(D)為主要考察因素,各因素及水平設置如表1所示。正交實驗采用4因素3水平正交表,即L9(34)正交表進行實驗,見表2。且在正交表安排的每個實驗號條件下進行3次重復實驗。采用極差法對正交試驗結果進行差異分析,由表2可以看出連錢草中總黃酮的最佳提取條件為A3B2C3D2,即超聲功率800W,超聲時間90(45,45)min,提取溫度40℃,溶劑濃度65%。由表2中R值可以看出,4種因素對連錢草中總黃酮提取效果的影響程度依次為:提取溫度>溶劑濃度>超聲時間>超聲功率。該提取工藝最大的影響因素是提取溫度,最小的是超聲功率。2.10分散分析對表2的試驗結果進行方差分析和F檢驗結果見表3。F檢驗結果表明,提取溫度、溶劑濃度對黃酮提取率都具有顯著的影響。2.11黃酮質(zhì)量分數(shù)在最佳提取條件下進行3次重復實驗,所提取的總黃酮質(zhì)量分數(shù)平均值為5.228%,大于正交設計中的含量,所得結果正確。且所得總黃酮含量高于2.7傳統(tǒng)總黃酮提取方法及含量測定中的結果。3提取溫度和溶劑濃度對提取效果的影響本實驗在最大吸收波長的選擇上,是將蘆丁對照品、供試品溶液分別按標準品溶液的制備和標準曲線繪制項下的方法制得后,于波長200~800nm掃描,均可見在510nm處有最大吸收,因此選擇510nm作為蘆丁和供試液測定的最大吸收波長。結果表明提取溫度和溶劑濃度對提取效果有極顯著的影響。分析原因認為適度增加溫度有利于提高溶劑的溶解度,但溫度過