微透析技術(shù)在藥物-蛋白結(jié)合研究中的應(yīng)用

微透析技術(shù)在藥物-蛋白結(jié)合研究中的應(yīng)用

藥物-質(zhì)子結(jié)合是一項快速的可逆過程，在血漿中藥物的游離型和結(jié)合型之間保持動態(tài)平衡，并。結(jié)合型藥物不能透過血管壁向組織轉(zhuǎn)運,不能經(jīng)腎小球濾過,亦不能經(jīng)肝臟代謝,僅游離型藥物才能從血液向組織轉(zhuǎn)運,在靶部位發(fā)揮藥理作用,進(jìn)而進(jìn)行代謝和排泄。此外,藥物與蛋白結(jié)合絕大部分是非特異性的,不同藥物間與同一蛋白的競爭性結(jié)合可使其中某一藥物的游離濃度大大增加,引起該藥的表觀分布容積、半衰期、腎清除率等一系列參數(shù)的改變,最終導(dǎo)致藥效改變或不良反應(yīng)的產(chǎn)生。因此,研究藥物與蛋白的相互作用對藥動學(xué)、藥效學(xué)以及臨床都有重要的理論和實踐價值,且對新藥的研究和開發(fā)有著十分重要的意義。研究藥物-蛋白結(jié)合的傳統(tǒng)方法有平衡透析法、超濾法、凝膠過濾法和超速離心法等,其中以前兩種方法最為常用。但平衡透析法需要大量藥物,且到達(dá)平衡需較長時間,可能會引起藥物與蛋白的降解;超濾法亦需要大量的藥物,且在過濾和離心過程中會因樣品濃度及溫度變化而使結(jié)合平衡受到干擾。微透析(microdialysis,MD)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新型生物取樣技術(shù),其最大的優(yōu)點是可在基本不干擾生物體內(nèi)正常生命過程的情況下進(jìn)行在體、實時取樣和在線分析,特別適用于研究藥物與蛋白結(jié)合的動態(tài)變化。與傳統(tǒng)方法相比顯示了絕對的優(yōu)勢,近年來受到廣泛關(guān)注。筆者通過查閱近年來國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn),概述MD技術(shù)的基本原理、特點、探針及影響探針相對回收率的主要因素,并重點介紹其在藥物-蛋白結(jié)合研究中的應(yīng)用。1總結(jié)1.1接頭及樣品收集器或在線連接分析方法MD技術(shù)是利用物質(zhì)沿濃度梯度擴(kuò)散和半透膜對小分子化合物具有通透性的原理而設(shè)計的,主要由微量灌流泵、探針、連接管、灌流液、連接管和樣品收集器(或在線連接分析儀器)組成。具體操作如下:將探針植入于血管或組織間隙,灌流液以一定的流速流經(jīng)探針,血液或組織間液中的游離藥物會沿濃度梯度擴(kuò)散進(jìn)入探針,而與大分子蛋白結(jié)合后的藥物因受到膜屏障的阻礙作用不能通過透析膜,故采集到的樣品中只含有游離藥物。待結(jié)合平衡后,收集透析液,分析測定其中游離型藥物濃度,并結(jié)合全血樣本的采集,即可間接研究藥物與蛋白的相互作用。1.2md探針的優(yōu)點與傳統(tǒng)方法相比,MD技術(shù)在藥物-蛋白結(jié)合研究中具有以下顯著特點:(1)取樣量甚微,所帶出的藥物量較少,無體液損失,無體積遷移,使藥物和蛋白濃度基本上保持恒定,對藥物蛋白結(jié)合平衡的影響可忽略,相應(yīng)所引起的樣品損失和誤差也較小。(2)可提供不含蛋白質(zhì)、酶等大分子物質(zhì)的樣品,無需預(yù)處理便可直接進(jìn)樣分析測定游離藥物濃度,可避免酶降解,提高樣品的穩(wěn)定性,且無離心過程,可控制影響實驗變化的一個重要因素——溫度,故所得結(jié)果具有更高的可靠性。(3)MD探針活性膜表面積較小,與傳統(tǒng)分離結(jié)合型與游離型藥物的膜和裝置相比,對藥物的非特異性吸附較少,使測定結(jié)果更為準(zhǔn)確。(4)能與多種分析檢測儀器(HPLC、FIA、HPCE等)聯(lián)用,實現(xiàn)在線實時檢測,易于自動化,不僅可大大減輕工作強(qiáng)度,而且能提高實驗結(jié)果的精密度與準(zhǔn)確度。(5)探針能穩(wěn)定地植入靜脈,給藥后可在生理條件下研究體內(nèi)藥物與蛋白結(jié)合情況。(6)MD技術(shù)的采集與分析過程既可在體又可離體進(jìn)行,與微量及超微量分離、分析技術(shù)相結(jié)合,具有非常高的檢測靈敏度和選擇性,幾乎適用于所有小分子活性物質(zhì)的分析,是其他化學(xué)微環(huán)境在體檢測方法所無法比擬的。1.3小鼠體內(nèi)氟吡洛芬的檢測血液MD技術(shù)常用的探針為柔性探針,其主要結(jié)構(gòu)包括透析膜、熔融硅管、PE進(jìn)液管和出液管。該類型探針具有足夠的柔性,能固定在清醒動物的血管和內(nèi)部器官柔軟組織上,動物的移動對透析膜或血管壁的損傷很小,為體內(nèi)藥物與蛋白的結(jié)合研究創(chuàng)造了條件。1996年,Evrard等自制了一種靜脈微透析用的柔性探針,于大鼠單劑量靜脈注射氟吡洛芬20mg·kg-1后,以該探針為取樣手段,在6h內(nèi)持續(xù)取樣10次,每次250μL,研究氟吡洛芬與血漿蛋白的結(jié)合情況。結(jié)果顯示:氟吡洛芬的血漿蛋白結(jié)合率為98.0~99.5%,平衡時的結(jié)合參數(shù)為(0.194±0.162)mg·L-1,蛋白結(jié)合程度表現(xiàn)出濃度依賴性。1.4透析液中待測化合物的檢測應(yīng)用MD技術(shù)研究藥物-蛋白結(jié)合的實驗過程中,探針的相對回收率(relativerecovery,RR)是影響實驗結(jié)果最重要的參數(shù),反映透析液中待測化合物的濃度與其在樣品基質(zhì)中濃度比例關(guān)系。RR的測定方法有多種,常用的有零凈通量法、反透析法和外推至零流速法等,其中以零凈通量法應(yīng)用較多。RR的影響因素主要有以下幾個方面。1.4.1探針rr比較Wang等在利用MD技術(shù)研究硫酸叔丁腎上腺素與牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)結(jié)合情況的實驗中,考察了溫度(23℃,37℃和40℃)對探針RR的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),RR隨溫度升高而增大。由于37℃灌流液有利于機(jī)體組織處于正常生理狀態(tài),故目前大多數(shù)藥物-蛋白結(jié)合實驗均在37℃條件下進(jìn)行。1.4.2rr檢測能力Huang等研究發(fā)現(xiàn)RR隨著灌流速度的改變而呈反相變化,流速越低,藥物在MD探針內(nèi)外越易接近達(dá)到平衡,RR越大。當(dāng)流速為1μL·min-1時,RR可達(dá)52.8%,但樣本采集耗時,量甚少;當(dāng)流速為10μL·min-1時,RR僅有12.5%,無法檢測到藥物。故流速的選擇不僅要盡可能使RR大小適宜,而且要保證在取樣時間間隔中收集足夠體積的透析液用于藥物濃度的測定。1.4.3內(nèi)環(huán)境的變化MD探針灌流液主要為水性灌流液,常用的有磷酸鹽緩沖液(PBS)、林格氏液(Ringer’s液)和檸檬酸葡萄糖抗凝溶液(ACD溶液),其組成、pH值、滲透壓、離子強(qiáng)度與采樣部位的內(nèi)環(huán)境越接近越好。因灌流液水性組成的特性,故MD技術(shù)比較適宜于極性成分的取樣,而對高脂溶性藥物和高蛋白結(jié)合率藥物的取樣較困難。目前,研究者通過在灌流液中加入灌流液改性劑(如BSA、甘油、環(huán)糊精等)可增加高脂溶性藥物的RR,有效解決了高脂溶性藥物不適于MD取樣的問題。Ao等通過在灌流液中加入β-環(huán)糊精的方法大大提高親脂性藥物及其代謝產(chǎn)物在MD取樣中的RR。Wang等采用MD技術(shù)研究酮基布洛芬與人血清白蛋白(humanserumalbumin,HSA)結(jié)合動力學(xué)的實驗中,在灌流液中加入HSA,使RR提高到原來的5倍。2sd技術(shù)在藥物-質(zhì)子結(jié)合研究中的應(yīng)用2.1藥物配合的作用建立藥物-蛋白結(jié)合的體外模型,測定藥物血漿蛋白結(jié)合率,了解其結(jié)合的緊密程度、結(jié)合部位、結(jié)合位點數(shù)等問題,不僅對于揭示藥物代謝動力學(xué)問題,指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要的理論和實際價值,同時對于進(jìn)行藥物分子設(shè)計、開發(fā)新藥具有重要的指導(dǎo)意義。2.1.1透析液灌流,疾病控制藥物與大分子蛋白結(jié)合后直接影響藥物在體內(nèi)的分布及其藥理作用的強(qiáng)弱,故測定藥物血漿蛋白結(jié)合率很有必要。Le等以褪黑激素類似物S20098為模型藥物,選擇高低(2000ng·mL-1、10ng·mL-1)兩個濃度,取家兔、大鼠、猴與人的血漿,研究藥物-蛋白結(jié)合情況。將經(jīng)零凈通量法校正過的同心柔性探針(外徑235μm,膜長25mm,截留分子量6000Da)放入20mL藥物-血漿混合溶液中,以Ringer’s液灌流,灌流速度為1μL·min-1,待結(jié)合平衡后收集透析液測定游離藥物濃度,結(jié)合對應(yīng)透析介質(zhì)中總的血漿藥物濃度計算血漿蛋白結(jié)合率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),S20098與家兔、大鼠、猴、人的血漿蛋白都有明顯結(jié)合,其中與人、家兔的血漿蛋白結(jié)合率不存在濃度依賴性,與大鼠、猴的血漿蛋白結(jié)合率卻具有濃度依賴性,提示藥物與蛋白的結(jié)合特性與血漿來源有關(guān)。由于BSA與HSA的結(jié)構(gòu)相似,二者的氨基酸序列高度相似,不同氨基酸均為保守性替換,且BSA價廉易得,故目前人們常研究藥物-BSA的結(jié)合情況,作為對藥物-HSA結(jié)合情況的參考。隨后,Gao等采用MD技術(shù)測定平陽霉素(PYM)與犬血漿蛋白的結(jié)合率,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PYM的血漿蛋白結(jié)合率隨著PYM濃度的增加而降低。張英豐等以MD技術(shù)測定藥物血漿蛋白結(jié)合率來評價體內(nèi)MD取樣的可行性。藥物濃度分別為72μg·mL-1、132μg·mL-1和180μg·mL-1時,探針RR分別為26.26%、26.44%和26.22%;藥物血漿蛋白結(jié)合率分別為16.43%、17.22%和15.80%。結(jié)果表明探針RR在所研究的藥物濃度范圍內(nèi)及取樣周期內(nèi)保持了相對穩(wěn)定,不同濃度青藤堿大鼠體外血漿蛋白結(jié)合率變化不大,說明采用MD技術(shù)研究青藤堿在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)過程是可行的。2.1.2mtz-hsa的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點結(jié)合常數(shù)的測定可了解藥物與蛋白結(jié)合強(qiáng)度大小,結(jié)合位點數(shù)的測定有助于了解藥物與蛋白結(jié)合機(jī)制以及藥物間相互取代的機(jī)制,可預(yù)測藥物間競爭結(jié)合的可能性。Cao等將MD技術(shù)與HPLC-ECD(ECD的檢測限為2.0×10-7)聯(lián)用,研究了6-巰基嘌呤(6-MP)與BSA的相互作用。當(dāng)灌流速度>5.0μL·min-1時,RR太低以致無法檢測到6-MP的含量;選用灌流速度為1.0μL·min-1時,6-MP的RR為34.5%。利用Scatchard方程處理數(shù)據(jù),得到6-MP-BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)分別為3.97×103M-1和1.51。結(jié)果表明,6-MP與BSA結(jié)合強(qiáng)度較弱且僅有一類結(jié)合位點,MD-HPLC組合技術(shù)用于研究藥物與蛋白的相互作用是可行的,具有簡單、快速、易于自動化的優(yōu)點,特別適應(yīng)當(dāng)今技術(shù)微型化的發(fā)展趨勢,為藥物-蛋白結(jié)合研究提供了一種簡單且可靠的新方法。Chen等將MD技術(shù)與流動注射化學(xué)發(fā)光法(MD-FIA-CL)聯(lián)用,成功測定了甲硝唑(MTZ)-HSA的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)和結(jié)合率,建立了可靠的體外結(jié)合模型。先將MTZ-HSA以不同摩爾比(0.4∶1,0.6∶1,0.8∶1,1∶1,1.2∶1)混合,用0.067mol·L-1,pH7.4的PBS緩沖液溶解,于37℃恒溫水浴至少10min,為了保護(hù)透析膜,在探針放入混合溶液前,要用灌流液清洗探針幾分鐘,以除去探針中的空氣和有機(jī)溶劑。然后將經(jīng)校正的探針放入MTZ-HSA混合溶液中,以PBS緩沖液灌流,灌流速度5μL·min-1,待結(jié)合平衡30min后開始收集透析液,直接進(jìn)樣分析,利用Scatchard方程處理數(shù)據(jù)得到MTZ-HSA的結(jié)合常數(shù)K為1.5×103M-1,結(jié)合位點數(shù)為1.89,結(jié)合率為20%。結(jié)果表明,MTZ與HSA結(jié)合屬輕度結(jié)合,MD-FIA-CL在線定量分析能彌補(bǔ)離線分析的不足,使小容量樣品的收集、分析同步進(jìn)行,消除操作過程中樣品的揮發(fā)所帶來的誤差,使測定結(jié)果更為準(zhǔn)確、真實。2.1.3布洛芬與kp的同時點流程比對研究體外藥物間與蛋白的競爭作用,為預(yù)測藥物間在體內(nèi)與蛋白的相互作用提供了理論依據(jù),對調(diào)整藥物劑量,預(yù)測毒性,并最終防止毒性的產(chǎn)生等均具有重大意義。汪海林等以酮基布洛芬(KP)為模型藥物,采用MD技術(shù)考察了KP與布洛芬、華法林兩種藥物間與HSA結(jié)合的置換效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),KP-HSA的結(jié)合率隨布洛芬濃度的增加而降低,較低濃度(50μmol·L-1)的布洛芬即可使酮基布洛芬的血漿蛋白結(jié)合率降低8個百分點,而與華法令濃度變化關(guān)系不顯著。相反,當(dāng)華法令濃度為50μmol·L-1時,KP-HSA的結(jié)合率稍有增加,表明布洛芬與KP的一級結(jié)合位點相同,兩者存在很強(qiáng)的競爭作用;而華法令與KP的一級結(jié)合位點不同,彼此沒有明顯的置換效應(yīng),在一定濃度區(qū)間甚至可能存在協(xié)同作用。2.2滿足大鼠頸動脈和大鼠血漿蛋白結(jié)合率的測定采用MD技術(shù)研究藥物在體內(nèi)與蛋白的結(jié)合情況,能考慮藥物與其代謝物的相互作用、血細(xì)胞對藥物的攝取等因素,故能更真實地評價藥物的體內(nèi)過程,這是傳統(tǒng)方法所做不到的。Le等以自由、清醒的Wistar大鼠為實驗動物模型,利用MD技術(shù)對褪黑激素S20098與大鼠血漿蛋白的結(jié)合情況進(jìn)行了在體和離體實驗。先將Wistar大鼠麻醉,將一套管插入大鼠左頸靜脈用于給藥,另一套管插入左頸動脈用于收集全血樣品,MD探針埋植入右頸靜脈用于收集透析液。待大鼠術(shù)后24h,以恒定速度靜脈給藥使其維持穩(wěn)態(tài)血藥濃度為30ng·mL-1,以Ringer’s液灌流,灌流速度1μL·min-1,達(dá)到結(jié)合平衡后收集20μL透析液用于測定游離藥物濃度,靜脈給藥后1h,2h,6h收集三個全血樣品用于測定總血漿藥物濃度,在體和離體實驗藥物的血漿蛋白結(jié)合率分別為74.0%和75.6%,探針RR分別為(91.3±5.6)%和(100.5±2.6)%,只有用在體RR來校正藥物濃度才能得到真實的體內(nèi)藥物濃度,進(jìn)而真實反映藥物在體內(nèi)與蛋白的結(jié)合情況。Tsai等以雄性SD大鼠為實驗動物模型,利用在體MD技術(shù)研究環(huán)丙沙星、環(huán)孢菌素A與蛋白結(jié)合的競爭作用。單劑量靜脈注射20mg·kg-1環(huán)孢菌素A后,再分別靜脈注射高低兩個劑量的環(huán)丙沙星(50mg·kg-1、20mg·kg-1),將MD探針(外徑150μm,半透膜長10mm,截留分子量13000Da)插入大鼠頸靜脈,以ACD液灌流,灌流速度2μL·min-1,每隔10min收集透析液,測定游離藥物濃度。結(jié)果表明,同時用藥時血漿中高低兩個劑量環(huán)丙沙星的濃度與單獨用藥時相比都有顯著增加,環(huán)孢菌素A對環(huán)丙沙星的蛋白結(jié)合具有顯著競爭抑制作用。2.3不同組分活性成分的聯(lián)合應(yīng)用MD取樣可提供不含蛋白質(zhì)、酶等大分子物質(zhì)的樣品,無需提純樣品便可直接進(jìn)樣分析測定游離藥物濃度,為中藥多組分體系-蛋白相互作用研究提供了可能,同時對中藥活性成分的體外篩選有很好的指導(dǎo)作用。Qian等采用MD技術(shù)與高效液相色譜-二極管陣列檢測/質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-DAD/MS)的方法,成功地從金銀花中同時測得多種組分共存時與BSA的結(jié)合度,并與組分單獨存在時的結(jié)合度進(jìn)行了比較。結(jié)果綠原酸、木犀草素-3-O-α-D葡萄糖苷和4,5-二咖啡?？崴崤cBSA的結(jié)合度低于單個組分時的結(jié)合度,而咖啡酸和紫槲皮苷與BSA的結(jié)合度高于單個組分時的結(jié)合度。表明:中藥多組分藥物間與BSA結(jié)合具有競爭抑制或協(xié)同促進(jìn)作用