組織培養(yǎng)結合秋水仙堿誘導植物多倍體的研究進展

組織培養(yǎng)結合秋水仙堿誘導植物多倍體的研究進展

該技術是在傳統(tǒng)的化學誘導基礎上發(fā)展起來的，并隨著植物組織培養(yǎng)技術的發(fā)展而成熟。目前該項技術在國內外被育種學家廣泛用于培育多倍體，以求達到改良植物品種和豐富種質資源的目的。1優(yōu)勢和劣勢1.1組織培養(yǎng)、誘導培育植物多倍體的傳統(tǒng)誘導法是以植株生長點、葉芽或種子等為誘導對象，由多細胞構成的芽發(fā)育成植株，因細胞分裂不同步，容易形成嵌合體，難于獲得同質的多倍體，誘導率也較低。隨著生物技術的發(fā)展，通過對材料進行組織培養(yǎng)然后再作誘導處理，能使誘導加倍的多倍體單細胞分化出不定芽，并發(fā)育成單株，形成同質多倍體，提高誘導率，有效排除嵌合體的干擾，并且縮短多倍體培育時間。曾憲松等用0.5%秋水仙堿處理橡膠樹(Heveabrasiliensis)二倍體花藥體細胞愈傷組織1d，可有效地從多倍性的細胞再分化成多倍性胚狀體，并再生為純合的四倍體植株，克服了常規(guī)誘導法造成的嵌合體現(xiàn)象及其所存在的多種弊端，且大大縮短了培育純合四倍體的時間。1.2養(yǎng)結合秋水仙堿誘導培育植物的培養(yǎng)模式常規(guī)的多倍體誘導試驗常在室外進行，室外的溫度、光照等試驗條件難于控制，而組織培養(yǎng)結合秋水仙堿誘導培育植物多倍體是在室內進行，室內試驗條件容易控制，且易于重復試驗結果，提高工作效率。目前隨著組織培養(yǎng)技術的發(fā)展與成熟，越來越多植物的快繁體系已被建立，這也為利用組織培養(yǎng)與秋水仙堿誘導相結合培育植物多倍體提供了良好的基礎。2仙堿對外植體的作用較常用的誘導方法有滴液法、浸漬法、混培法。由于秋水仙堿對外植體有一定的傷害作用，因而有學者認為，在暗條件或弱光條件下誘導可減輕對外植體的傷害，同時處理后的外植體在這種條件下培養(yǎng)一段時間可起到恢復的效果。2.1外植體的誘導用無菌的脫脂棉包裹外植體，滴加藥液，保持棉花濕潤，藥液濃度一般為0.1%～0.5%，處理時間一般為1～3d，常在藥液中加入2%～3%的二甲基亞砜（DMSO）提高誘導率；處理完畢后充分清洗外植體，再接入新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。周樸華等在弱光條件下用浸有0.02%～0.05%秋水仙堿的棉花包裹黃花菜(Hemerocalliscitrina)的愈傷組織24h后，反復水洗，再轉入芽分化培養(yǎng)基中，獲得同源四倍體黃花菜，同時發(fā)現(xiàn)藥液中加入2%DMSO，誘導變異的頻率可提高10%左右。2.2外植體的處理秋水仙堿常用的濃度為0.1%～1%，具體濃度視植物對秋水仙堿的敏感程度而定。操作方法是將外植體浸漬在已過濾無菌的秋水仙堿溶液中，處理時間一般是2h至2d，處理完畢后充分清洗外植體，再接入新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。張興翠等將蘆薈(Aole)的叢生芽浸入0.02%～1%秋水仙堿溶液中浸漬24h，充分水洗后轉入分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40～60d得到純合的四倍體。有學者認為在振蕩條件下浸漬外植體誘導效果更好。郭啟高等將剝去芽鞘的姜(Zingiberofficinale)芽浸泡于0.05%～0.4%的秋水仙堿溶液中，150r/min振蕩48h，清洗后轉入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能夠獲得較高的誘導率。2.3不同的誘導方法直接在培養(yǎng)基中加入無菌的藥液，藥液的濃度不宜太高，一般為10～300mg/L，外植體處理時間為幾天至一個月，處理完畢后直接轉入新鮮培養(yǎng)基中，不用清洗外植體。郭啟高等將秋水仙堿滅菌后按5、10、20、30和40mg/L的濃度分別加入姜的分化培養(yǎng)基中，然后接入剝去芽鞘的姜芽，處理5或10d后再轉到不含藥液的新鮮培養(yǎng)基中，獲得四倍體姜的植株。上述誘導方法各有長短，浸漬法省藥、省工，并且藥液還可以回收利用；滴液法、混培法耗藥、費時。對于不同植物，不同的誘導方法有著不同的誘導效果。陳柏君在誘導黃岑(Scutellariabaicalensis)多倍體時發(fā)現(xiàn)浸漬法優(yōu)于混培法，而周嘉裕等在誘導辣椒(Capsicumannuum)多倍體時認為混培法優(yōu)于浸漬法。3濃度和時間組合對誘導的影響經秋水仙堿處理的外植體前期生長緩慢，這是由于秋水仙堿對外植體細胞的毒害作用所致。這種毒害作用隨著處理濃度的增加或時間的延長而加劇，從而使外植體死亡率增加，因此，要掌握合適的處理濃度和時間才能獲得最好的加倍效果。在離體材料的誘導中，秋水仙堿濃度高，處理時間長，導致材料死亡率高，但多倍體誘變率并不一定提高；而濃度低，處理時間短，則不易得到加倍的植株；只有較佳的處理濃度和時間的組合才能獲得較高的誘導率，如在苧麻、蘋果等植物離體組織的多倍體誘導。但也有人認為，用高濃度的秋水仙堿進行短時間處理效果較好，如張俊蓮對當歸的愈傷組織進行誘導時發(fā)現(xiàn)最佳處理為高秋水仙堿濃度與較短的時間相結合。不同植物的離體材料對秋水仙堿的敏感程度有較大差異，有些對秋水仙堿極其敏感，故只能用較低的濃度進行，處理時間也相對短些，如誘導庫拉索蘆薈多倍體時，用0.06%秋水仙堿浸泡叢生芽12h后，誘變頻率達50%；有些植物的離體材料對秋水仙堿不太敏感，則可用較高的秋水仙堿濃度進行誘導，處理時間也相對長些，如巴西橡膠樹在多倍體誘導中，用0.5%秋水仙堿浸泡花藥愈傷組織1d，能得到最高的誘變率。處理溫度對秋水仙堿的作用有一定影響，過高或過低的溫度均不利于多倍體細胞的發(fā)生。一般認為最適合的溫度為15℃左右，同時綜合藥液濃度與處理時間考慮，認為溫度低時藥液濃度可稍大，處理時間可稍長些，溫度高時則降低藥液濃度，縮短處理時間。4選取的誘導材料由于秋水仙堿只能影響正在分裂的細胞，對處于靜止狀態(tài)的細胞不起作用，因此，選取的誘導材料原則上必須是幼嫩、分化力較強的組織。目前報道最多是用愈傷組織和叢生芽作為誘導材料，也有個別報道用種子、莖段、離體植株的組織。4.1細胞再分化培養(yǎng)用秋水仙堿處理植物的愈傷組織時，體細胞較容易加倍，加倍的體細胞再分化成植株，這樣較易獲得純合的四倍體植株。目前很多采用愈傷組織作為誘導材料，也取得較好的效果，如黃錦秀等用0.15～0.2%秋水仙堿處理枸杞愈傷組織，獲得同源四倍體枸杞。4.2附加四倍體叢生芽比較幼嫩，是最常用的誘導材料，經秋水仙堿處理后有部分體細胞會加倍，由于叢生芽的分化力比較強，加倍后的體細胞較易分化成植株，這樣也比較容易獲得純合的四倍體植株。如鄭思鄉(xiāng)等用0.1%秋水仙堿處理苧麻(Boehmerianivea)的叢生芽，獲得94%四倍體植株。4.3多倍體再生植株秋水仙堿處理種子后，種子的部分體細胞已加倍，該種子的胚軸、子葉誘導成的愈傷組織也有部分體細胞是加倍，由此可分化成多倍體再生植株。如陳素萍等將黨參(Codonopsispilosula)種子播種于含一定濃度秋水仙堿的培養(yǎng)基中發(fā)芽，爾后進行胚軸的組織培養(yǎng)，獲得了四倍體變異植株。種子作為誘導材料要經過愈傷組織階段，而如果直接用秋水仙堿處理愈傷組織，其誘導率會更高，操作更方便，也更易獲得純合多倍體植株。因此，目前較少用秋水仙堿處理種子后再結合組織培養(yǎng)來培育多倍體。4.4多倍體植株的發(fā)育離體植株的組織比較幼嫩，分化力也較強，經秋水仙堿處理后體細胞易于加倍，加倍的體細胞發(fā)育成的植株為多倍體植株。如劉慶忠等用皇家嘎拉蘋果的離體新梢葉片作為誘導材料，葉片外植體在含有0～200mg/L秋水仙堿的液體再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d后，再轉移到不含有秋水仙堿的再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得四倍體植株。4.5．誘導材料的選擇采用莖段作為誘導材料誘導率較低，嵌合現(xiàn)象較嚴重，如韓禮星等用半木質化半剝皮的獼猴桃(Actinidchinensis)莖段作誘導材料，接入含100～500mg/L秋水仙堿的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d，獲得的多倍體植株都是嵌合體。上述五種誘導材料，誘導效果較好的是愈傷組織和叢生芽，其次為種子和離體植株的組織，較差的是莖段。但是誘導材料的選取與植物組織培養(yǎng)的過程密切相關，如蘆薈的組織培養(yǎng)過程是由莖尖直接分化叢生芽，則選取誘導蘆薈多倍體的誘導材料只能是叢生芽；黃岑的組織培養(yǎng)過程是種子莖段—愈傷組織—叢生芽，可選取愈傷組織或叢生芽作誘導材料。不同的誘導材料對誘導的效果也有所不同，如吳清在金蕎麥(Fagopyrumcymosum)的離體快繁結合秋水仙堿誘導同源四倍體的試驗中，分別選用無菌芽和愈傷組織作為誘導材料，結果發(fā)現(xiàn)在相同的處理條件下愈傷組織的誘導率、存活率都明顯高于前者。因此，在組織培養(yǎng)結合秋水仙堿誘導培育植物多倍體的過程中，應注意選取合適的誘導材料。5木本植物種間生長狀況的差異組織培養(yǎng)與秋水仙堿誘導相結合培育植物多倍體，可在短期內對那些有價值的多倍體材料進行大量的增殖，并能進一步發(fā)揮組織培養(yǎng)的優(yōu)勢進行工廠化生產，以滿足市場需求，因此，有著很好的應用前景。通過組織培養(yǎng)與秋水仙堿誘導相結合的技術途徑成功培育植物多倍體的報道有草本植物的睡蓮(Nelumbonucifera)、芋類(Xanthosomasagittifolium)、姜類、黃花菜、黃瓜(Cucumissativus)、白菜(Brassicacampestris)、萵苣(Lactucasativa)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、辣椒、重瓣大巖桐(Sinningiaspeciosa)、百合(Liliumdavidii)、苧麻、蘆薈等；木本植物的茶屬(Camellia)、蘋果、獼猴桃、柿(Diospyroskaki)、桑樹(Morusalba)、巴西橡膠樹等?？傮w而言，草本植物較多，木本植物較少，主要原因是由于草本植物離體微繁體系建立比較容易，也較成熟；而木本植物除了楊樹、桉