豬卵母細(xì)胞冷凍保存效果判定方法的研究

豬卵母細(xì)胞冷凍保存效果判定方法的研究

上述研究結(jié)果表明，通過(guò)觀察和研究冷凍后卵的發(fā)育，檢查形態(tài)的完整性，并計(jì)算形態(tài)的完整性，我們可以快速、簡(jiǎn)單地確定卵的冷凍效果，改進(jìn)的冷凍保存方法，提高豬卵的冷凍保存效果。這是目前廣泛使用的一種確定冷凍效果的方法。但是,形態(tài)完整率的統(tǒng)計(jì)只能粗略的反映冷凍效果,這種方法有它不可避免的缺點(diǎn),很多形態(tài)完整的卵母細(xì)胞可能已經(jīng)死亡,這就需要通過(guò)染色來(lái)判定其存活率。1.2冷凍對(duì)卵母細(xì)胞的影響為研究冷凍對(duì)豬卵母細(xì)胞造成的傷害,武彩紅(2006)對(duì)GV期卵母細(xì)胞和MII期卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍,解凍后染色進(jìn)行觀察,GV期卵母細(xì)胞有79.5%的染色體正常,而紡錘體的正常率GV期和MII期卵母細(xì)胞分別只有10.1%和12.9%,肌動(dòng)蛋白正常分布率分別為16.9%和37.2%,與對(duì)照組72.3%差異顯著。結(jié)果說(shuō)明冷凍對(duì)卵母細(xì)胞骨架造成的不可恢復(fù)的傷害是影響卵母細(xì)胞發(fā)育潛力的重要因素。同樣Shi(2007)為研究MII期豬卵母細(xì)胞冷凍解凍后的超微結(jié)構(gòu)變化和發(fā)育潛力,對(duì)凍后卵母細(xì)胞進(jìn)行染色觀察,結(jié)果得到紡錘體結(jié)構(gòu)正常率只有43.5%,未冷凍的卵母細(xì)胞紡錘體結(jié)構(gòu)正常率為81.0%,差異極顯著。對(duì)冷凍的和新鮮的卵母細(xì)胞分別做體外受精、孤雌激活和顯微受精,前者的卵裂率和囊胚率明顯低于后者,試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明冷凍對(duì)卵母細(xì)胞的微管和線(xiàn)粒體組織造成的不可恢復(fù)的損傷影響了卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力。師蔚群(2006)認(rèn)為冷凍前用紫杉酚(taxol)預(yù)處理可以減輕冷凍對(duì)卵母細(xì)胞造成的傷害,在冷凍豬成熟卵母細(xì)胞時(shí)用紫杉酚預(yù)處理,結(jié)果預(yù)處理的卵母細(xì)胞凍后微管結(jié)構(gòu)正常率為10.3%,而未處理的卵母細(xì)胞凍后微管結(jié)構(gòu)正常率僅為4.1%,未冷凍的卵母細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)正常率為76.8%,證明用紫杉酚預(yù)處理可以提高微管結(jié)構(gòu)正常率。對(duì)冷凍后的卵母細(xì)胞進(jìn)行染色,檢查超微結(jié)構(gòu)正常,是一種接近真實(shí)反映卵母細(xì)胞冷凍效果的判定方法。通過(guò)觀察卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)在冷凍過(guò)程中的變化,統(tǒng)計(jì)超微結(jié)構(gòu)正常率,探討細(xì)胞骨架穩(wěn)定和抗凍機(jī)理,了解卵母細(xì)胞骨架在冷凍中起的作用,以改進(jìn)冷凍保存方法,提高豬卵母細(xì)胞的冷凍效果,將是未來(lái)冷凍保存和機(jī)理研究的重點(diǎn)。這種方法同樣存在不足之處,相比形態(tài)完整率和存活率的觀察,檢查凍后卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)正常率就顯得復(fù)雜、費(fèi)時(shí);Eroglu(1998)證實(shí)冷凍解凍后的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)1h后微管、微絲形態(tài)得到了恢復(fù),紡錘體形態(tài)和染色體排列大部分恢復(fù)正常,可是卻明顯影響了有效受精。所以對(duì)凍后卵母細(xì)胞發(fā)育潛力的觀察將可以更真實(shí)的反映冷凍保存的效果,為優(yōu)化冷凍方法提供依據(jù)。2冷凍豬卵母細(xì)胞的存活率豬卵母細(xì)胞凍后存活情況通過(guò)染色后觀察,統(tǒng)計(jì)存活率來(lái)檢查。存活率是卵母細(xì)胞染色后,在顯微鏡下觀察存活卵母細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的百分比。染色方法包括臺(tái)盼藍(lán)染色和FDA染色,臺(tái)盼藍(lán)染色是將卵母細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色,然后在倒置顯微鏡下觀察是否著色,胞質(zhì)呈藍(lán)色的為死卵,未著色的為活卵;FDA染色后將卵母細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察,胞質(zhì)發(fā)出強(qiáng)熒光的卵母細(xì)胞視為存活,不發(fā)熒光或發(fā)出弱熒光的視為死亡。武彩紅(2006)認(rèn)為冷凍造成了部分卵母細(xì)胞的死亡,在分別對(duì)GV期卵母細(xì)胞和MII期卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍,解凍染色后統(tǒng)計(jì)存活率分別為56.8%和41.9%,說(shuō)明冷凍對(duì)豬卵母細(xì)胞造成了一定程度上的傷害。師蔚群(2006)稱(chēng)用紫杉酚對(duì)卵母細(xì)胞預(yù)處理可以提高凍后卵母細(xì)胞存活率,在用紫杉酚預(yù)處理的卵母細(xì)胞冷凍后經(jīng)FDA染色,存活率為62.1%,未處理的卵母細(xì)胞凍后存活率為53.8%,說(shuō)明用紫杉酚預(yù)處理有一定效果。Hara(2005)認(rèn)為采用離心去脂的方法可以提高冷凍效果,冷凍未成熟豬卵母細(xì)胞先采用離心去脂法處理,結(jié)果得到了30%的存活率,未處理的卵母細(xì)胞存活率僅為2%,說(shuō)明這種方法可以提高GV期豬卵母細(xì)胞抗凍能力。目前改進(jìn)冷凍載體以提高豬卵母細(xì)胞的冷凍效果也是研究熱門(mén)方向,朱良成(2006)用自制的玻璃微管冷凍豬卵母細(xì)胞,通過(guò)FDA染色鑒定凍后卵母細(xì)胞的存活情況,采用程序化冷凍法比較細(xì)管和玻璃微管作為載體對(duì)MII期卵母細(xì)胞冷凍效果的影響,存活率分別為34.5%和63.3%;玻璃化冷凍法比較兩種載體得到存活率分別為45.0%和65.9%;分別用常規(guī)細(xì)管程序化冷凍法和玻璃微管玻璃化冷凍法冷凍豬GV期卵母細(xì)胞,存活率分別為30.0%和59.7%,差異均顯著,結(jié)果表明,用玻璃微管作為載體可以提高卵母細(xì)胞凍后存活率。凍后卵母細(xì)胞通過(guò)染色,檢查卵母細(xì)胞存活情況是目前使用最為廣泛的判定豬卵母細(xì)胞冷凍效果的一種方法。它可以較為客觀的反映冷凍的效果,方法簡(jiǎn)單,操作方便,為大多數(shù)研究者所鐘愛(ài)。當(dāng)然它也有不能忽視的缺點(diǎn),經(jīng)染色判定為存活的卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均存在不同程度的損傷,這勢(shì)必會(huì)影響到卵母細(xì)胞的繼續(xù)發(fā)育能力。所以與超微結(jié)構(gòu)正常率相比,存活率只能作為判定卵母細(xì)胞冷凍效果的一般依據(jù)。3豬卵母細(xì)胞冷凍保存效果評(píng)價(jià)凍后卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力更客觀真實(shí)的反映了冷凍效果,通過(guò)對(duì)凍后卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟、體外受精、孤雌激活和顯微受精,統(tǒng)計(jì)成熟率、卵裂率和囊胚率。根據(jù)冷凍后卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力來(lái)判定冷凍效果,改進(jìn)冷凍保存方法,從而提高豬卵母細(xì)胞的冷凍保存效果。快速有效的豬卵母細(xì)胞冷凍保存效果評(píng)價(jià)方法的建立有助于促進(jìn)豬卵母細(xì)胞冷凍保存的研究,及時(shí)反饋冷凍保存的效果,為改進(jìn)豬卵母細(xì)胞冷凍保存方法提供可靠依據(jù),進(jìn)而提高豬卵母細(xì)胞冷凍保存的效果。眾多的研究者們通過(guò)對(duì)凍后卵母細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、體外成熟、孤雌激活、體外受精和顯微受精,直接或間接地判定豬卵母細(xì)胞冷凍保存的效果,不斷地改進(jìn)冷凍保存的方法,以?xún)?yōu)化冷凍保存程序,期望能夠提高豬卵母細(xì)胞冷凍保存的效果。以下就判定豬卵母細(xì)胞冷凍保存效果的主要方法作簡(jiǎn)要介紹。1不同冷凍保護(hù)劑對(duì)冷凍保存效果的影響形態(tài)學(xué)觀察包括檢查形態(tài)正常和超微結(jié)構(gòu)正常情況。在冷凍保存過(guò)程中,卵母細(xì)胞的外部形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)等不可避免的受到高濃度冷凍保護(hù)劑帶來(lái)的滲透壓變化和毒性作用的負(fù)面影響,通過(guò)對(duì)冷凍解凍后的卵母細(xì)胞進(jìn)行染色觀察,統(tǒng)計(jì)形態(tài)完整率、超微結(jié)構(gòu)的正常率,判定冷凍保存的效果,為及時(shí)分析、改進(jìn)冷凍保存方法提供依據(jù),進(jìn)而不斷提高和完善豬卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)。1.1冷凍對(duì)豬卵母細(xì)胞的影響形態(tài)正常是指將冷凍解凍后的卵母細(xì)胞在體外經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后,數(shù)次洗滌,置于高倍倒置顯微鏡下,進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查,其中卵母細(xì)胞形圓、對(duì)稱(chēng),胞質(zhì)飽滿(mǎn)、均勻、無(wú)擴(kuò)散、無(wú)滲漏,透明帶完整,無(wú)膜損傷;未成熟卵母細(xì)胞其卵丘細(xì)胞未發(fā)生脫落等,均視為形態(tài)正常。形態(tài)正常率是形態(tài)正常的卵母細(xì)胞數(shù)在總數(shù)中所占的百分率。在研究冷凍對(duì)豬卵母細(xì)胞造成的傷害,武彩紅(2006)分別對(duì)豬未成熟(germinalvesicle,GV)卵母細(xì)胞和成熟(Metaphase-II,MII)卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍,解凍后培養(yǎng)一段時(shí)間進(jìn)行觀察,GV期的卵母細(xì)胞形態(tài)完整率為92.4%,MII期卵母細(xì)胞形態(tài)完整率為94.2%。結(jié)果表明冷凍對(duì)豬卵母細(xì)胞的形態(tài)完整率沒(méi)有太大影響。Gupta(2007)用固體表面(solidsurfacevitrification,SSV)法冷凍豬GV期和MII期卵母細(xì)胞,采用乙二醇(ethyleneglycol,EG)作為冷凍保護(hù)劑,細(xì)胞松弛素(cytochalasinB,CB)預(yù)處理后冷凍,均得到了60%以上的形態(tài)完整率,CB預(yù)處理沒(méi)有明顯提高冷凍效果。說(shuō)明SSV法是一種方便有效的冷凍保存方法。3.1不同處理的冷凍保護(hù)劑對(duì)成熟卵母細(xì)胞冷凍效果的影響體外成熟是指將未成熟卵母細(xì)胞冷凍解凍后,在TCM199成熟液中成熟培養(yǎng)42～46h。培養(yǎng)方法同新鮮的卵母細(xì)胞,培養(yǎng)后脫除卵丘細(xì)胞,在倒置鏡下觀察第一極體的排出情況,統(tǒng)計(jì)成熟率。為研究細(xì)胞松弛素B和冷凍保護(hù)劑對(duì)卵母細(xì)胞冷凍效果的影響,Fujihira(2004)對(duì)未成熟豬卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍,在用7.5μg/ml細(xì)胞松弛素B處理30min后,分別用EG或EG和二甲基亞砜(dimethysulphoxide,DMSO)混合劑作為冷凍保護(hù)劑,冷凍后得到37.1%和23.9%的成熟率,說(shuō)明用細(xì)胞松弛素B預(yù)處理有利于對(duì)未成熟卵母細(xì)胞的冷凍保存,使用EG或EG與DMSO混合劑作冷凍保護(hù)劑對(duì)未成熟卵母細(xì)胞冷凍效果差異不顯著Park(2005)認(rèn)為冷凍前部分的去除脂滴可以提高未成熟卵母細(xì)胞的成熟率,在對(duì)未成熟豬卵母細(xì)胞采用顯微去脂法和離心去脂法去脂后冷凍,顯微去脂后冷凍得到15%的成熟率,離心去脂和未離心的卵母細(xì)胞冷凍后成熟率均為4%。Hara(2005)采用離心去脂法處理未成熟豬卵母細(xì)胞后冷凍,并在處理液中添加0.27mol/L的葡萄糖,冷凍解凍后體外成熟,離心去脂的卵母細(xì)胞凍后有7%發(fā)育到MII期,未處理的卵母細(xì)胞沒(méi)有發(fā)育到MII期,結(jié)果證明了這種方法有助于更好的使得脂滴突出,遠(yuǎn)離線(xiàn)粒體,便于在去除脂滴時(shí)不傷害線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu),從而提高了GV期卵母細(xì)胞對(duì)冷凍的耐受力。Gupta(2007)研究結(jié)果表明,改進(jìn)冷凍載體也可以提高凍后卵母細(xì)胞成熟率,采用固體表面法(SSV)冷凍GV期豬卵母細(xì)胞,分別用EG、DMSO和EG與DMSO混合劑作為冷凍保護(hù)劑,體外成熟,比較成熟率,結(jié)果采用EG、DMSO和混合劑作為冷凍保護(hù)劑的成熟率分別為51%、31%和53%,用EG和EG與DMSO混合劑作為冷凍保護(hù)劑獲得的成熟率明顯要高于DMSO作為冷凍保護(hù)劑的,說(shuō)明固體表面冷凍法是一種簡(jiǎn)單、高速的冷凍程序。3.2胞孤成蟲(chóng)激活培養(yǎng)卵母細(xì)胞的孤雌激活是動(dòng)物孤雌生殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié),通常卵母細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)沒(méi)有受精或激活就會(huì)自行退化裂解。卵母細(xì)胞孤雌激活是指在沒(méi)有配子參與下,通過(guò)人工或自然條件的刺激,終止卵子的靜息狀態(tài),恢復(fù)其發(fā)育進(jìn)程的生理現(xiàn)象。Somfai等(2006)報(bào)道豬MII期卵母細(xì)胞冷凍后發(fā)育到囊胚階段,這是首次關(guān)于凍后卵母細(xì)胞孤雌激活發(fā)育到囊胚的報(bào)道。試驗(yàn)采用固體表面玻璃化冷凍法,用CB預(yù)處理,高濃度冷凍保護(hù)劑處理后冷凍保存,解凍后的卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活,移入胚胎培養(yǎng)液中體外培養(yǎng),第2d觀察卵裂情況,用CB預(yù)處理后冷凍的卵母細(xì)胞、直接冷凍的卵母細(xì)胞和未冷凍的卵母細(xì)胞卵裂率分別為62.4%、25.7%和72.4%;繼續(xù)培養(yǎng)到第6d,統(tǒng)計(jì)囊胚率,分別為5.4%、2.6%和27.7%。結(jié)果說(shuō)明高濃度冷凍保護(hù)劑對(duì)卵母細(xì)胞體外發(fā)育傷害不大,使用CB預(yù)處理可以提高M(jìn)II期卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力。孤雌激活不僅是核移植、嵌合體生產(chǎn)的重要手段和衡量體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞成熟的方法,也是一種重要的判定豬卵母細(xì)胞凍后發(fā)育潛力的方法之一。由于豬存在著多精受精的現(xiàn)象,單純的以受精評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞冷凍效果過(guò)于片面,通過(guò)孤雌激活的方法,統(tǒng)計(jì)卵裂率和囊胚率來(lái)判定冷凍效果,為研究冷凍對(duì)豬卵母細(xì)胞的影響、改進(jìn)冷凍方法和提高冷凍效果提供了快速準(zhǔn)確的依據(jù)。當(dāng)然,這種方法也存在許多的問(wèn)題,如對(duì)孤雌激活的機(jī)理了解甚少,另外卵母細(xì)胞的激活率雖然很高,但不能保證其以后的發(fā)育。3.3冷凍保存使用檢出液和藥代動(dòng)力學(xué)廣義上的體外受精技術(shù)包括了卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)和受精卵的體外培養(yǎng)兩項(xiàng)密切相關(guān)的技術(shù)。從狹義上講,就是指將動(dòng)物受精過(guò)程中的精卵結(jié)合在體外環(huán)境下完成的一種現(xiàn)象,它包括自然條件下的體外受精和人為培養(yǎng)條件下的體外受精。通常所說(shuō)的體外受精技術(shù),是將哺乳動(dòng)物的精子和卵子置于適宜的培養(yǎng)條件下使之完成受精的一種技術(shù)。為研究顆粒細(xì)胞在冷凍中所起到的作用,Varga(2006)用開(kāi)口式拉長(zhǎng)麥管法(openpulledstraw,OPS)冷凍豬未成熟卵母細(xì)胞,分別冷凍有顆粒細(xì)胞包裹的卵和裸卵,解凍后體外成熟,發(fā)育到MII期后繼續(xù)冷凍,解凍后體外受精,有顆粒細(xì)胞包裹的卵母細(xì)胞受精率為22.35%。說(shuō)明顆粒細(xì)胞在冷凍過(guò)程中有保護(hù)卵母細(xì)胞的作用,并對(duì)卵母細(xì)胞凍后的發(fā)育能力起著重要的作用。為研究冷凍對(duì)豬卵母細(xì)胞造成的傷害,武彩紅(2006)分別冷凍GV期和MII期豬卵母細(xì)胞,解凍后體外受精,154枚GV期卵母細(xì)胞有12枚卵裂,6枚發(fā)育到8-細(xì)胞,3枚發(fā)育到桑葚胚;MII期卵母細(xì)胞無(wú)卵裂,說(shuō)明冷凍對(duì)卵母細(xì)胞造成了一定的傷害。同時(shí)Gupta(2007)認(rèn)為卵母細(xì)胞不去脂冷凍后也可以正常受精并發(fā)育到囊胚,采用SSV法冷凍含有脂滴的MII期豬卵母細(xì)胞,冷凍解凍后體外受精,得到的卵裂率和囊胚率分別為26%和9%,未冷凍的卵母細(xì)胞分別為60%和20%,證明含有脂滴的卵母細(xì)胞凍后也可以正常發(fā)育。體外受精技術(shù)是目前研究的熱門(mén)領(lǐng)域,將體外受精技術(shù)與冷凍保存技術(shù)相結(jié)合,不僅能夠發(fā)揮優(yōu)良種畜的繁殖潛能,而且可以作為判定冷凍保存效果的一種重要方法。將冷凍解凍后的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精,統(tǒng)計(jì)卵裂率和囊胚率,作為判定冷凍效果的依據(jù),來(lái)改進(jìn)冷凍載體,找到適合冷凍的卵母細(xì)胞發(fā)育階段等,以提高豬卵母細(xì)胞冷凍保存的效果多精受精是困擾豬卵母細(xì)胞體外受精技術(shù)的問(wèn)題,可以導(dǎo)致受精卵發(fā)育停止或形成非整倍體,從而引起早期胚胎死亡,勢(shì)必會(huì)影響對(duì)卵母細(xì)胞冷凍效果的判定。3.4對(duì)不同采收期豬卵母細(xì)胞冷凍保存效果的評(píng)估顯微受精是一種借助顯微操作儀,將精子或精子細(xì)胞直接注入卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或卵周隙中來(lái)實(shí)現(xiàn)受精的方法。它包括卵胞質(zhì)內(nèi)受精(ntracytoplasmicsperminjection,ICSI)和帶下受精(subzonalinsemination,SUZI)。Fujihira(2004)對(duì)未成熟豬卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍,用7.5μg/mlCB處理30min后,分別用EG或EG與DMSO混合劑作為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍,解凍后成熟培養(yǎng),ICSI后卵裂率分別為37.8%和39.3%,繼續(xù)培養(yǎng)分別有13.5%和14.3%發(fā)育到了囊胚,對(duì)照組分別為45.2%和20.0%。結(jié)果表明CB處理有利于對(duì)未成熟卵母細(xì)胞的冷凍保存,使用EG或EG與DMSO混合劑作冷凍保護(hù)劑對(duì)未成熟卵母細(xì)胞凍后的發(fā)育能力影響差異不顯著,冷凍的未成熟卵母細(xì)胞成熟后進(jìn)行顯微受精,囊胚率與新鮮卵母細(xì)胞的差異不顯著,說(shuō)明凍后卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力基本不受影響,可以正常發(fā)育。通過(guò)對(duì)凍后卵母細(xì)胞進(jìn)行顯微受精,體外培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)卵裂率和囊胚率,可以避免體外受精的多精受精引起胚胎死亡影響判定冷凍效果,從而更準(zhǔn)確地反映卵母細(xì)胞的冷凍效果,為優(yōu)化豬卵