小麥線粒體dna快速提取技術(shù)研究

小麥線粒體dna快速提取技術(shù)研究

線條是真正的遺傳因子中的一個(gè)重要的遺傳因子裝置。它于185年發(fā)現(xiàn)，并于1898年命名。它包含自己的dna，具有半自治性。研究證實(shí),線粒體DNA(mtDNA)攜帶具有重要生物學(xué)功能的一系列基因,這些基因不但編碼了核糖體和生物氧化鏈上某些重要酶的部分亞基,而且與真核細(xì)胞的抗藥性、細(xì)胞的生命周期、植物的胞質(zhì)雄性不育,以及人類(lèi)的一些疾病密切相關(guān)。如mtDNA的突變會(huì)導(dǎo)致氨基糖甙類(lèi)抗生素致聾、線粒體基因的變異重排與人類(lèi)衰老死亡密切相關(guān)等。mtDNA具有快速進(jìn)化、缺少重組以及嚴(yán)格母系遺傳等特點(diǎn),并且在多數(shù)真核生物中,線粒體基因組比核基因組小,易于測(cè)序及分析,然而在植物中由于植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁、大的液泡和葉綠體DNA的干擾,使分離難度大大增加。本研究以小麥黃化苗為材料,在總結(jié)前人方法的基礎(chǔ)上,分析了mtDNA抽提純化過(guò)程所涉及到的多種因素并比較了不同處理方法的優(yōu)劣,旨在組建一套簡(jiǎn)捷、快速、經(jīng)濟(jì)的植物mtDNA抽提純化方法體系。1材料和方法1.1材料表面小麥種子于室溫下浸泡12h,HgCl2消毒,鋪于有吸水紙的培養(yǎng)皿上,置于培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng),溫度27℃,培養(yǎng)5~6d。1.2粗部分沉淀剪取黃化苗50g左右,加入3倍體積的勻漿緩沖液(50mmol/LTris-HCL,pH8.0、0.3mol/L甘露醇、0.2mol/L蔗糖、1mmol/LEDTA,pH8.0、0.1%BSA、0.6%PVP、β-巰基乙醇),用預(yù)冷的DS-200高速組織勻漿搗碎機(jī)破碎組織,經(jīng)6層紗布過(guò)濾,離心管分裝濾液。將濾液在2℃下3500r/min離心15min,取上清液10000r/min離心20min,棄上清液。向沉淀中加入懸浮液(50mmol/LTris-HCL,pH8.0、0.3mol/L甘露醇、0.2mol/L蔗糖、0.1%BSA、0.6%PVP),用毛筆輕刷沉淀使之充分懸浮,重復(fù)上述離心過(guò)程,得到粗線粒體沉淀。然后向沉淀中加入10mL緩沖液(蔗糖0.3mol/L、Tris-HCl50mmol/L),終濃度為0.01mol/LMgCl2,同時(shí)加入DNaseI至終濃度20μg/mL,4℃保溫1~2h(冰中)。加入EDTA至終濃度20mmol/L,中止DNaseI反應(yīng)。將此溶液小心的置于20mL0.6mol/L蔗糖溶液介質(zhì)上(0.3mol/L甘露醇、50mmol/LTris-HCL、0.6mol/L蔗糖),10000r/min離心20min,所得的沉淀為較純的線粒體。1.3活性化合物的合成加入2mL裂解液(0.1mmol/LTris-HCL,pH8.0、50mmol/LEDTA,pH8.0、0.1mol/LNaCl、5%SDS、β-巰基乙醇)、蛋白酶K至終濃度為50μg/mL,同時(shí)加入無(wú)DNaseI的Rnase至終濃度100μg/mL,60℃反應(yīng)1~2h。然后加入等體積的酚:氯仿(1∶1)緩慢搖勻,放置5min,8000r/min離心5min后再用氯仿抽提一次。加入兩倍體積的無(wú)水乙醇,同時(shí)加入3μLKAC,-20℃靜止20min。12000r/min離心5min,棄上清,沉淀風(fēng)干后得到mtDNA。1.4樣品處理和電泳試驗(yàn)將DNA樣品溶于TE溶液中,取10μLDNA+3μL溴酚藍(lán)點(diǎn)樣。0.8%的瓊脂糖凝膠電泳90min,電壓80V。2結(jié)果與分析2.1細(xì)胞器的破碎方式真核生物細(xì)胞包含由各種膜性細(xì)胞器組成的膜性系統(tǒng)和細(xì)胞骨架系統(tǒng),對(duì)植物來(lái)說(shuō),還具有由纖維素和半纖維素組成的高硬度的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。因此,分離某一細(xì)胞器時(shí),對(duì)組織的破碎要求一定要充分,但長(zhǎng)時(shí)間的處理也會(huì)影響細(xì)胞器的完整性。本實(shí)驗(yàn)材料用組織勻漿搗碎機(jī)快速破碎,通過(guò)增加勻漿液,保證多數(shù)線粒體的浸出,既達(dá)到了快速破碎的目的又保證了線粒體的完整性。2.2浮力密度的確定在提取線粒體過(guò)程中,本研究采用4次差速離心去除雜質(zhì),然后再用簡(jiǎn)易的密度梯度離心的方法得到較純的線粒體。簡(jiǎn)易的密度梯度離心方法中蔗糖的密度(0.6mol/L)是根據(jù)線粒體的浮力密度確定的。用該方法得到的線粒體,比差速離心所得到的線粒體純度要高得多,雖比密度梯度離心所得到的線粒體純度要略低一些,但更加快速、經(jīng)濟(jì),尤其對(duì)于高活性線粒體的獲得更為實(shí)用。由圖1可見(jiàn)線粒體膜完整,結(jié)構(gòu)清晰(這是用該方法提取的線粒體,經(jīng)瓊脂包埋,戊二醛和鋨酸雙固定,丙酮脫水,Epon812樹(shù)脂包埋,LKBⅤ型超薄切片機(jī)切片,100-CXⅡ透射電鏡拍照)。2.3裂解液sds的影響SDS是一種離子型去垢劑,具有極性端和非極性端,它的非極性端與跨膜蛋白的疏水區(qū)作用,取代膜脂,極性端游離于水中形成SDS-膜蛋白復(fù)合物,以便達(dá)到使膜裂解的目的。本實(shí)驗(yàn)比較了裂解液SDS的濃度(5%或1%)與蛋白酶K(加與不加)對(duì)裂解效果的影響,結(jié)果表明用含5%SDS的裂解液與蛋白酶K一同處理裂解效果最好。可能是因?yàn)楦邼舛鹊腟DS與蛋白酶K更容易使線粒體膜裂解,利于mtDNA釋放。如果提高裂解液溫度至60℃,適當(dāng)延長(zhǎng)裂解時(shí)間,會(huì)使線粒體裂解的更充分。2.4裂解過(guò)程中rna的改變用純化的線粒體提取mtDNA時(shí),沒(méi)有用DNaseⅠ處理,得到的結(jié)果如圖3,從中可以看出條帶有明顯的拖尾,推測(cè)拖尾部分是由細(xì)胞核和質(zhì)體在裂解過(guò)程中釋放的DNA降解所致。在裂解前用DNaseⅠ處理后,拖尾現(xiàn)象消失(圖2)。注意在裂解線粒體之前一定要把DNaseⅠ殘余液處理干凈,否則DNaseⅠ會(huì)對(duì)mtDNA產(chǎn)生影響。為了避免RNA的污染,實(shí)驗(yàn)中也可以加RNase去除RNA。RNase處理可以分為兩種情況:一種是將RNase加入到裂解液中,隨裂解一同進(jìn)行,這種省時(shí)但處理的不徹底,最終的mtDNA會(huì)含有少量的RNA(圖4);另一種是裂解后進(jìn)行,這種方法費(fèi)時(shí)但處理的徹底,mtDNA中幾乎不含RNA(圖2)。建議若提取mtDNA用于回收克隆或者酶切,必須用DNaseI和RNase處理樣品以保證樣品的純度,并可適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)作用時(shí)間或加大酶量。若僅用于不同植物mtDNA的篩選檢測(cè),可省去DNaseI、RNase處理。2.5酚抗氧化學(xué)法在提取質(zhì)粒DNA時(shí),去除蛋白質(zhì)常采用的方法是在質(zhì)粒裂解后加入KAC,也有用此方法去除mtDNA中的蛋白質(zhì)的,但本實(shí)驗(yàn)用該方法效果并不理想。我們采用了有機(jī)溶劑去蛋白的方法,且分別比較了酚∶氯仿(1∶1)一步去蛋白與酚∶氯仿(1∶1)和氯仿兩步去蛋白的效果。表1為分別用兩種方法去蛋白所提取的mtDNA,溶解于50μLTE后,取出2μL稀釋50倍所得到的OD值。從表1中可以看出,經(jīng)過(guò)酚∶氯仿(1∶1)和氯仿兩次去蛋白得到的mtDNA的OD值A(chǔ)260/280比只經(jīng)過(guò)酚∶氯仿(1∶1)處理要高,說(shuō)明前者去蛋白效果更好一些。而A260/230的比值沒(méi)有明顯的變化。2.6ac濃度對(duì)mtnda提取的影響如果在用兩倍體積的無(wú)水乙醇沉淀mtDNA的同時(shí),再加入適當(dāng)濃度的KAC,可明顯改善提取效果。圖5示不同KAC濃度對(duì)mtDNA提取的影響,1泳道未加KAC,2泳道加100μLKAC,3泳道加10μLKAC,4泳道加3μLKAC。從圖5中可以看出,提取mtDNA時(shí),未加KAC(1泳道)不如加入3μLKAC(4泳道)的效果好。但是,當(dāng)KAC濃度過(guò)高時(shí),對(duì)提取的效果也有明顯的不良影響,如第2、3泳道。3mtnda的構(gòu)建通常的mtDNA提取方法多采用經(jīng)差速離心和蔗糖密度梯度離心從植物材料勻漿中分離線粒體,再將線粒體裂解后純化線粒體DNA。這種方法可以得到純的mtDNA樣品,但此方法操作復(fù)雜,耗時(shí)長(zhǎng),費(fèi)用高,材料需求量大。本