高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)人血漿酮康唑和伏立康唑

高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)人血漿酮康唑和伏立康唑

托吡唑和博爾康唑是臨床上常用的抗真菌藥物。酮康唑?yàn)檫溥蝾?lèi),伏立康唑是合成的三唑類(lèi)藥物;作用機(jī)制為抑制真菌細(xì)胞膜麥角甾醇的生物合成,影響細(xì)胞膜的通透性,抑制其生長(zhǎng)。酮康唑用于治療淺表和深部真菌病,如皮膚和指甲癬、陰道白念珠菌病、胃腸真菌感染等,以及由白念珠菌、類(lèi)球孢子菌、組織胞漿菌等引起的全身感染。伏立康唑用于治療侵入性曲霉病,以及對(duì)氟康唑耐藥的嚴(yán)重侵入性念珠菌感染及由足放線病菌屬和鐮刀菌屬引起的嚴(yán)重真菌感染。臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn),伏立康唑的臨床效應(yīng)(療效和不良反應(yīng))具有明顯的濃度依賴(lài)性,有效治療濃度范圍為0.25～6.00mg·L-1,當(dāng)血藥濃度>6mg·L-1時(shí),肝功能損傷的發(fā)生率明顯增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn),給予相同的劑量,不同個(gè)體的血藥濃度差異顯著,即相同劑量下不同患者療效和不良反應(yīng)存在顯著的個(gè)體差異。酮康唑的不良反應(yīng)也較多,主要為肝損害和過(guò)敏性疾病。因此,伏立康唑和酮康唑的血藥濃度監(jiān)測(cè)具有重要的臨床價(jià)值。關(guān)于血漿酮康唑和伏立康唑的檢測(cè)已有報(bào)道,但同時(shí)檢測(cè)這兩種藥物報(bào)道筆者較少見(jiàn)到。筆者在本試驗(yàn)中建立與評(píng)價(jià)同時(shí)檢測(cè)人血漿酮康唑和伏立康唑的反相高效液相色譜法,旨在為臨床檢測(cè)提供依據(jù)。1藥品、試劑與儀器甲醇和乙腈(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心),三氟乙酸(TFA,Sigma,064K3647);乙酸乙酯、正己烷、無(wú)水碳酸鈉(分析純,天津市化學(xué)試劑三廠);實(shí)驗(yàn)用水均為重蒸水(本實(shí)驗(yàn)室自制)。酮康唑標(biāo)準(zhǔn)品(湖北紐蘭藥業(yè)有限公司,純度:99.5%,批號(hào):040302),伏立康唑?qū)φ掌?哈爾濱健迪醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)有限公司,純度:99.8%,批號(hào):040401),卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司,批號(hào):064K1653)。高效液相色譜儀為Agilent1100系列,包括G1322A在線脫氣機(jī),G1311A四元泵,G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器,G1316A溫控箱,G1315B二極管陣列檢測(cè)器,Agilent化學(xué)工作站[RevA.10.02.(1757)]。電子分析天平[AB204-A,梅特勒-托利多(上海)儀器公司];渦旋混合器(FZQ-2,江蘇泰縣醫(yī)療器械廠);氮吹儀(D10型,杭州藍(lán)焰科技有限公司);重蒸水儀(1810-B型,江蘇金壇市科析儀器有限公司)。1.3標(biāo)準(zhǔn)工作液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制①準(zhǔn)確稱(chēng)取酮康唑?qū)φ掌?5mg置于25mL量瓶中,用甲醇溶解定容至25mL,得質(zhì)量濃度為1g·L-1的酮康唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用重蒸純化水稀釋成濃度依次為100,10,1mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液(臨用時(shí)稀釋)。②準(zhǔn)確稱(chēng)取伏立康唑?qū)φ掌?5mg置于25mL量瓶中,用甲醇溶解定容至25mL,得質(zhì)量濃度為1g·L-1的伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用重蒸純化水稀釋成濃度依次為100,10,1mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液(臨用時(shí)稀釋);③準(zhǔn)確稱(chēng)取卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品25mg置于25mL量瓶中,用甲醇溶解定容至25mL,最終質(zhì)量濃度為1g·L-1。然后用甲醇稀釋成濃度為10mg·L-1的內(nèi)標(biāo)溶液。準(zhǔn)確吸取三氟乙酸1mL,用重蒸純化水稀釋并定容至1L。色譜柱:AgilentTC-C18(4.6mm×150mm,5μm,Agilent,USA);保護(hù)柱:TC-C18保護(hù)柱(4.6mm×12.5mm,5μm,Agilent,USA);流動(dòng)相:乙腈-0.1%TFA-水=40:20:40(V/V/V);流速:0.9mL·min-1;柱溫:40℃;檢測(cè)波長(zhǎng):0～6.5min,294nm,6.5～9.0min,256nm。準(zhǔn)確吸取待測(cè)血漿樣品1.0mL置于10mL具塞試管中,加入10mg·L-1卡馬西平內(nèi)標(biāo)工作液25μL,混勻后加入1mol·L-1氫氧化鈉溶液500μL堿化血漿。再加入乙酸乙酯4.0mL、正己烷1.0mL,渦旋混勻2min。轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相于另一刻度離心管中,氮吹儀中吹干。用300μL流動(dòng)相復(fù)溶,取復(fù)溶液于自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中,設(shè)定20μL進(jìn)樣檢測(cè)。2保留時(shí)間和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間酮康唑和伏立康唑純標(biāo)、空白血漿、血漿標(biāo)準(zhǔn)等樣品,經(jīng)HPLC分析測(cè)定得到色譜圖。酮康唑保留時(shí)間為3.8min,內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間為5.6min,伏立康唑的保留時(shí)間為7.8min。由圖可見(jiàn)在本試驗(yàn)條件下,酮康唑、內(nèi)標(biāo)卡馬西平和伏立康唑的色譜峰能完全分離,沒(méi)有明顯的內(nèi)生雜質(zhì)峰干擾。2.2回收率、精密度與定量下限取8只10mL具塞試管,依次加入不同濃度不同體積的酮康唑和伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,再加入空白血漿1.0mL,配成酮康唑濃度相當(dāng)于0.25,0.50,1.00,2.00,4.00,8.00,12.00,16.00mg·L-1,伏立康唑濃度相當(dāng)于0.025,0.050,0.100,0.200,0.400,0.800,1.200,1.600mg·L-1的血漿樣品;再按“1.5”項(xiàng)處理方法處理后,測(cè)定酮康唑峰面積AiT、伏立康唑峰面積AiF,內(nèi)標(biāo)峰面積As,以Ai/As為縱坐標(biāo),以所對(duì)應(yīng)各點(diǎn)濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)最小二乘法線性回歸,得酮康唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為C=6.835AiT/As+0.021,r=0.9999;伏立康唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為C=1.652AiF/As-0.004,r=0.9999。取標(biāo)準(zhǔn)曲線的最小濃度值為定量下限,酮康唑定量下限為0.25mg·L-1、伏立康唑的定量下限為0.025mg·L-1。取空白血漿1.0mL,加入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液,配制低、中、高3種濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中酮康唑濃度為0.50,4.00,12.00mg·L-1,伏立康唑濃度為0.05,0.40,1.20mg·L-1的血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液。再按“1.5”項(xiàng)處理后,于同1d內(nèi)測(cè)定5次和連續(xù)5d測(cè)定,計(jì)算日內(nèi)、日間精密度,結(jié)果見(jiàn)表1。取空白血漿1.0mL,加入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液,配制低、中、高3種濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中酮康唑濃度為0.50,4.00,12.00mg·L-1,伏立康唑濃度為0.05,0.40,1.20mg·L-1。再按“1.5”項(xiàng)處理后,進(jìn)樣檢測(cè),計(jì)算檢測(cè)量。以檢測(cè)量與加入量的比值計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表2。配制低、中、高3種濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中酮康唑濃度為0.50,4.00,12.00mg·L-1,伏立康唑濃度為0.05,0.40,1.20mg·L-1。3種濃度各5份,其中3份在室溫下放置0,6,12h后再經(jīng)血漿樣品處理方法處理后進(jìn)樣檢測(cè),記錄結(jié)果。另外2份分別在-65℃冰箱冰凍保存2周和4周后,再經(jīng)血漿樣品處理方法處理后進(jìn)樣檢測(cè),記錄結(jié)果。酮康唑3個(gè)濃度的RSD分別為4.12%,2.81%,0.86%,伏立康唑3個(gè)濃度的RSD分別為4.32%,3.57%,1.32%。說(shuō)明血漿樣品在室溫放置和冰凍保存的條件下,均有很好的穩(wěn)定性。3分散藥的制備1例健康志愿者單劑量口服400mg酮康唑片(西安楊森制藥有限公司,批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H10930212,批號(hào):08061094)和200mg伏立康唑分散片(輝瑞制藥有限公司,注冊(cè)證號(hào):H20040661,批號(hào):080212),分別于給藥前和給藥后0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0,6.0,8.0,12.0,24.0h取靜脈血4.0mL,分離血漿。用此方法測(cè)得血漿中的酮康唑和伏立康唑濃度,繪制血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖1。4色譜-質(zhì)譜條件的確定AgilentTC-C18的色譜柱使用超純硅膠基質(zhì),具有高比表面積,12%碳載量和惰性表面,特別適合酸性、堿性和中性混合物的分離。在此色譜柱上,大部分成分有較好的保留,并且得到對(duì)稱(chēng)的色譜峰。本試驗(yàn)采用1%三氟乙酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值,比例為20%。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),流動(dòng)相中不加三氟乙酸時(shí),只有內(nèi)標(biāo)卡馬西平出峰,酮康唑和伏立康唑均不出峰;同時(shí)三氟乙酸的比例會(huì)影響酮康唑的峰面積,40%三氟乙酸時(shí),酮康唑的峰面積下降30%,但不影響伏立康唑的峰面積。經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn),確定流動(dòng)相中三氟乙酸的比例為20%。文獻(xiàn)報(bào)道單劑量口服400mg酮康唑的血漿峰濃度約為13mg·L-1,而單劑量口服200mg伏立康唑的血漿峰濃度約為1.0mg·L-1。兩者在血漿中的濃度相差10倍,會(huì)導(dǎo)致酮康唑的峰很高,而伏立康唑的峰很小。本試驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器的波長(zhǎng)梯度的方法,得到了相對(duì)比例均衡的色譜圖。DAD三維立體圖顯示,酮康唑在200～300nm波長(zhǎng)均有吸收,在240nm有最大吸收,在294nm處吸收較小;伏立康唑在230和256nm處有最大吸收。故檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為:0～6.5min,294nm;6.5～10.0min,256nm?？R西平是常用的內(nèi)標(biāo),在大多數(shù)色譜柱上都能很好的出峰,并且不受流動(dòng)相酸堿度的影響,峰形對(duì)稱(chēng);在整個(gè)紫外區(qū)具有吸收。無(wú)論在酸性條件還是堿性條件下,都有很高的萃取率。本試驗(yàn)建立的高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)血漿酮康唑和伏立康唑濃度,專(zhuān)屬性高,相對(duì)回收率均在85%～115%范圍內(nèi),絕對(duì)回收率>75%;日內(nèi)和日間變異均<10%,符合生物等效性研究的要求。操作簡(jiǎn)單,