綠色木霉菌v-1菌株在煙草三葉定殖中的生長

綠色木霉菌v-1菌株在煙草三葉定殖中的生長

草木菌劑是由土壤中誘導(dǎo)得到的綠色木菌（tt-1）開發(fā)的微生物殺菌劑。具有廣的光譜抗菌性和抗菌活性。它對主要真菌疾?。ㄈ绾诓荨⒉莩嘈遣『筒葩赖龋┮灿泻芨叩念A(yù)防效果。在草的生產(chǎn)過程中，木霉素不僅具有上述抗菌作用外，而且對促進煙草素的生長起到了很強的作用。為了進一步研究木霉素的肥效，以及使用后煙草的生理變化，我們研究了木霉素在煙草素中的定位和性質(zhì)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1aviridpers,opfr.Tv-1:綠色木霉(TrichodermaviridPers.ExFr.)。木霉菌劑:顆粒劑有效濃度7×107個孢子/g;粉劑有效濃度3×1010個孢子/g。1.1.2試驗草品種K326、G28、NC89、NC82、RG11、云煙851.1.3響應(yīng)面圖木霉半選擇性培養(yǎng)基(TSM):MgSO4·7H2O0.2g;K2HPO40.9g;KCl0.25g;NH4NO31.0g;葡萄糖3.0g;氯霉素0.25g;玫瑰紅0.15g;敵克松可濕性粉劑0.3g;PCNB0.2g;瓊脂20g;H2O1000mL。土壤浸漬液瓊膠培養(yǎng)基(SA)的制備:取自然土壤1000g,加水1000mL,浸泡一段時間后雙層濾紙過濾,按如下成分配制培養(yǎng)基:土壤浸液100mL;瓊脂15g;水900mL。然后分裝滅菌。1.2方法1.2.1試驗設(shè)計與處理盆栽試驗:試驗設(shè)在云南煙草研究院農(nóng)業(yè)所試驗基地,裝盆土壤為沙壤土,裝盆體積24L,品種為K326,用于測定生理生化指標(biāo)。大田試驗:試驗設(shè)在紅塔區(qū)北城鎮(zhèn)(水稻土)、峨山縣小街鎮(zhèn)(紅壤)、江川縣安化鄉(xiāng)(紫色土),品種為K326,用于測定大田煙株性狀。處理設(shè)置:試驗從不同營養(yǎng)水平與不同木霉制劑用量水平兩方面進行研究,采用裂區(qū)試驗設(shè)計處理。以施肥量(0、4、8gN/株,N∶P2O5∶K2O=1∶1∶2)為主處理,木霉菌劑用量(0、45kg/hm2)為副處理,處理組合見表1。盆栽每個處理栽10盆,田間試驗處理隨機排列,3次重復(fù),每小區(qū)植煙50株以上,栽煙行株1.1m×0.6m。肥料利用率與生理生化測定:在測定生物量和N、P、K含量的基礎(chǔ)上,用差減法測定氮、磷、鉀肥料利用率。煙葉葉綠體色素、硝酸還原酶(NR)活性和游離脯氨酸(FPro)、丙二醛(MDA)的含量用比色法測定。1.2.2tv-1接種量的測定煙苗的準(zhǔn)備:供試煙草種子先經(jīng)1%的NaClO表面消毒5min,再用滅菌水漂洗3次,然后在滅菌條件下吸脹24h,倒掉滅菌水后再用新滅菌水漂洗3次,取出煙草種子置于經(jīng)滅菌含濕濾紙上,滅菌條件下風(fēng)干,催芽3d后播入無菌土中,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至5～7葉期移入上述試驗土中。葉面接種:用無菌水多次沖洗葉片,將Tv-1搖瓶培養(yǎng)液均勻噴至葉面(葉面葉背均要噴),噴后4h第一次取樣,以后每隔7d取一次樣。Tv-1葉面定殖動態(tài):PD培養(yǎng)液培養(yǎng)5d的Tv-1菌液,經(jīng)離心后用無菌水懸浮,調(diào)節(jié)到108cfu/mL。用經(jīng)70%酒精消過毒的手持噴霧器噴霧,直到葉面上均勻布滿一層細微水珠而不流淌為止。噴霧后1h取第一次樣,以后每隔一周取一次樣,共4次。每次每處理取的葉片剪成0.5cm小段,無菌水中振蕩(120r/分)洗30min。取稀釋液涂布于木霉半選擇性培養(yǎng)基(TSM)上,28℃下培養(yǎng)10d,5皿重復(fù),計菌落數(shù)。以第一次取樣所檢測到的菌量為接種量。菌量以cfu/g葉表示。電鏡樣品處理及觀察:將所取樣品切成小片,于3%戊二醛中固定3h,然后丙酮梯度脫水,醋酸異戊酯置換,二氧化碳臨界點干燥,噴金后掃描電鏡觀察,照相。1.2.3培養(yǎng)條件檢查結(jié)果煙苗的準(zhǔn)備:同一種影響因素試驗的不同處理所使用的煙苗均于相同Tv-1孢子含量的懸浮液中浸泡1h。移入不同處理的SA中后,分別于3d,6d,9d時檢查結(jié)果。檢查時,分別稱剪取幼根0.01g,研磨成漿狀,稀釋一定倍數(shù)涂于TSM上培養(yǎng)5d后,計菌落數(shù)。水分含量測定:將SA分別按瓊脂含量為0.5%、1.5%、3%、5.0%、7.0%、9.0%配制。pH值測定:將SA分別配制成pH值為4、5、6、7、8、9。不同培養(yǎng)基測定:將上述煙苗培養(yǎng)于SA、WA(水洋菜平板)、GA(2%葡萄糖洋菜平板)。不同煙草品種準(zhǔn)備:分別于SA上培養(yǎng)以上6種不同品種煙苗。2結(jié)果和分析2.1木霉劑肥效果2.1.1木霉菌劑的對比試驗在玉溪市紅塔區(qū)北城鎮(zhèn)進行了苗期(袋苗)施用木霉菌劑的對比試驗,指出木霉菌劑對烤煙袋苗有較好的促生效果。其株高、葉數(shù)及葉片長寬比對照增加10%左右,而根、莖、葉比對照增加50%～80%(表2)。2.1.2不同土壤、紅土、水土流變對紅土促生的影響從表3、表4和表5可以看出,施用木霉菌劑對煙株長勢、長相均有一定作用,但在不同土壤上表現(xiàn)有差異,紅壤土上的促生作用較大,水稻土和紫色土上的促生效果較小。而且,施用木霉菌劑對煙株上部葉的展開有很好的效果。2.1.3不同施肥水平下木霉菌劑產(chǎn)出量比較田間結(jié)果表明,在紅壤和水稻土上施用木霉菌劑的增產(chǎn)增值效果較好,而紫色土上效果不明顯。方差分析還指出,在同等施肥水平下,施用與不施用木霉菌劑產(chǎn)值量差異不明顯。但是,在紅壤和水稻土上每hm2施用60kg純N的條件下,施用45kg木霉菌劑的能明顯地使煙葉產(chǎn)量提高8.5%～10.8%,產(chǎn)值提高10.2%,均價和上等煙比例也有不同幅度的增加,而且其產(chǎn)量、產(chǎn)值及外觀品質(zhì)已接近或超過了每hm2施純N120kg的處理(表6)。2.1.4不同施肥方案對土壤養(yǎng)分利用率的影響從盆栽試驗結(jié)果中以看出,烤煙施用木霉菌劑后,煙株的干物重、養(yǎng)分(N、P、K)吸收量、肥料與土壤養(yǎng)分利用率均得到了提高。其中,在施用N4g/株的條件下,施木霉菌劑對N、P、K肥利用率的提高幅度最大,與同等施肥水平相比,N、P、K肥利用率分別提高了7.7%、1.13%和11.8%。更為顯著的是,施用木霉菌劑能使土壤養(yǎng)分利用率大幅度提高,土壤N、P、K利用率分別提高了21.8%、27.3%、38.5%(表7)。因此,施用木霉菌劑不但能提高肥料利用率,而且對提高土壤養(yǎng)分利用率的使用更大。2.1.5木霉菌劑對低碳煙株氮素的影響葉綠體色素:煙葉在生長發(fā)育期間,其葉綠體色素含量與煙株長勢、養(yǎng)分協(xié)調(diào)性有很大關(guān)系。從表8看出,在同等施肥水平下,施用木霉菌劑的處理煙葉葉綠體色素含量明顯得到提高。更重要的是,施用木霉菌劑后煙葉黃綠比相應(yīng)提高,說明其成熟與落黃較為協(xié)調(diào)。硝酸還原酶(NR)活性:硝酸還原酶是植物氮代謝的關(guān)鍵酶,其活力的高低可以反映氮素的供給與還原情況。從圖1可以看出,施用木霉菌劑后,煙葉內(nèi)的NR活性得到了提高,提高幅度為6.7～12.3個百分點。說明施用木霉菌劑可提高煙株的氮素謝代水平,促進煙株對氮素的吸收與利用。游離脯氨酸:游離脯氨酸是植物處于環(huán)境脅迫下而產(chǎn)生的一種重要氨基酸。就煙草而言,在煙葉內(nèi)產(chǎn)生較多的游離脯氨酸一方面可提高抵御能力,但另一方面也是代謝不平衡的表現(xiàn),對煙葉品質(zhì)形成不利?？緹熓┯媚久咕鷦┖?可使煙葉內(nèi)的游離脯氨酸降低,代謝趨于平衡,降低幅度為12.3%～25.6%(圖2)。丙二醛(MDA):MDA是植物細胞膜脂過氧化的產(chǎn)物,與植物的抗逆性、衰老等有密切關(guān)系。煙草葉片的MDA含量與品種、氣候、栽培有關(guān),可作為煙草抗病性與成熟性的重要指標(biāo)。在本試驗的6個處理中,以處理4的煙葉MDA含量最高,比同等施肥量的處理3MDA含量提高了76.6%(圖3)。表明施N4g/株與施用木霉菌劑45kg/hm2株的處理煙株抗病性強,成熟落黃較為正常,有利于煙葉品質(zhì)形成。2.2牧草表面的定殖研究2.2.1tv-1的定殖噴霧后24h取樣觀察,可以看到Tv-1的分生孢子在葉面上的分布極不均勻,既有散生或幾個聚在一起,也有多個聚生,以氣孔周圍及葉面凹陷處居多(封三圖版1)。噴霧后一周取樣觀察Tv-1在葉面的定殖情況,可以看到Tv-1的菌絲及分生孢子混合存在(封三圖版2);定殖的適宜位點在氣孔周圍及葉面腺毛基部(封三圖版3,4)。封三圖版5為未噴施Tv-1的對照葉片。在觀察的樣品中,多數(shù)均能看到Tv-1菌絲侵入葉片的生長趨勢,侵入位點多位于葉面凹陷處(封三圖版6)。2.2.2tv-1分散劑用量Tv-1在葉面上的生長曲線見圖4。第一次取樣,菌量為2.1×106cfu/g葉片,此即為Tv-1的接種量。一周后第2次檢測,數(shù)量降為1.3×105cfu/g葉片。Tv-1在室內(nèi)培養(yǎng)約需4d時間產(chǎn)孢,在葉面環(huán)境中由于各種條件的影響,產(chǎn)孢量會受到抑制,產(chǎn)孢時間也要長于室內(nèi)培養(yǎng)。因此,第一周內(nèi)的菌量比初始菌量降低。此后Tv-1適應(yīng)了葉面環(huán)境,菌量逐漸回升,第2周檢測菌量為3.9×105cfu/g葉片。從第3周開始,菌量持續(xù)下降,尤其是第4周內(nèi)菌量降至1.1×103cfu/g葉片。2.3草本根的邊界分布2.3.1tv-1定殖Tv-1菌株定殖煙草根部能力受水分含量影響明顯。在3%含水量的SA上,Tv-1定殖數(shù)量最高。水分偏高或偏低都影響Tv-1菌株在煙草根部的定殖,且差異達到了顯著水平(α=0.05)。2.3.2檢查結(jié)果的測定Tv-1菌株定殖煙草根部的能力受pH影響較大。第3d、6d、9d3次檢查結(jié)果均表明。最高定殖量同最低定殖量之間達到顯著性差異(α=0.05)。pH4,5,6條件下的定殖量明顯高于pH8,9條件下的定殖。表明偏酸性的環(huán)境較適合于Tv-1的定殖。2.3.3煙草頂部的定殖生長于GA營養(yǎng)條件下的Tv-1,在煙草根部的定殖數(shù)量明顯高于WA上的定殖數(shù)量,總體水平也要高于SA。差異也達到了顯著水平(α=0.05)。2.3.4煙草品種深部定殖在SA平板上培養(yǎng)3,6,9d時,Tv-1菌株在6個煙草品種根部定殖數(shù)量變化較大,且定殖數(shù)量差異顯著(α=0.05)。但從總體上看,云煙85,G28,NC89較適合于Tv-1的定殖。3結(jié)論和討論3.1木霉菌劑促生長作用機制從上述施用木霉菌劑后,對煙苗素質(zhì)、大田煙株性狀、煙葉產(chǎn)質(zhì)量、肥料利用率和生理代謝的影響等可看出:木霉菌劑能明顯改善煙株的農(nóng)藝性狀,提高煙葉產(chǎn)質(zhì)量,提高肥料利用率以及協(xié)調(diào)煙株生理代謝平衡。木霉菌劑的促生長作用機制目前認(rèn)為主要是菌體代謝物中生長素類如赤霉素、吲哚乙酸等的直接作用以及酶類如纖維素酶、幾丁質(zhì)酶等的間接作用。當(dāng)然這涉及煙株、木霉菌和土壤3方面的因素,在本研究中也發(fā)現(xiàn)在不施肥或施肥水平過高的條件下,施用木霉菌劑不能起到增產(chǎn)增值效果,這值得進一步探討。3.2tv-1位點的優(yōu)勢生防菌在植物表面的定殖能力反映了生防菌在植物表面與病原菌競爭空間和營養(yǎng)的能力。本文研究表明,Tv-1可以在煙草葉面定殖。Tv-1在葉面噴霧后,主要定殖于葉面氣孔周圍、腺毛基部及葉面凹陷處。這些位點或是分泌物產(chǎn)生處,或是葉面水分分布較多處,能為Tv-1的生長繁殖提供適宜的條件。另一方面,這些位點也是其它病原菌的競爭位點,但Tv-1是人工接種,且生長繁殖速度快,相比病原菌具有種群數(shù)量大,出現(xiàn)早的特點。因此,Tv-1對這些位點的搶先占領(lǐng),不僅有利于本身的生存,而且使煙草葉面受到保護,免于病原菌的侵染。生防菌在植物體內(nèi)的傳導(dǎo)能力也在一定程度上反映了生防菌在植物體內(nèi)與病原菌競爭空間可營養(yǎng)的能力。Tv-1在煙草葉面上具有強烈的侵入葉片的生長趨勢,很可能能夠從葉面上的某些適宜位點進入煙株內(nèi)部生長繁殖。如果Tv-1能夠進入煙株內(nèi)部,其生長繁殖勢必受到植物的保護,在競爭壓力相對較小的環(huán)境中增殖。不僅可以有效的殺傷煙株內(nèi)部的病原菌,還可以達到長期防治病害的目的。但Tv-1是否具有從葉面進入植株內(nèi)部生長的能力還需進一步深入研究。3.3tv-1定殖的培養(yǎng)過程偏酸性的環(huán)境利于Tv-1的定殖,這與平板培養(yǎng)結(jié)果是一致的。平板培養(yǎng)結(jié)果表明:綠色木霉菌最適生長pH5.0～5.5,分生孢子的萌發(fā)受H+濃度的影響,酸性條件比堿性條件利于萌發(fā)。不同品種對Tv-1定殖的影響可能反映了植物生長期間根分泌物質(zhì)種類與數(shù)量的變化。據(jù)Darah(1991)研究表明:根圈微生物