熒光原位雜交FISH探針制備及其應(yīng)用

熒光原位雜交（FISH）探針的制備及其應(yīng)用概述1、克隆性染色體異常是腫瘤的特性2、染色體異經(jīng)常見的類型3、染色體異常的檢測辦法二、熒光原位雜交及其探針1、熒光原位雜交的原理2、熒光原位雜交的探針三、熒光原位雜交探針的制備和熒光原位雜交（按實驗流程介紹）概述1、克隆性染色體異常是腫瘤的特性19德國遺傳學(xué)家Boveri就提出染色體畸變與腫瘤來源有關(guān)，然而這還僅僅只是一種假說；1960年Nowell和Hungerford在7例慢性髓系白血?。╟hronicmyeloidleukemia，CML）的患者中發(fā)現(xiàn)后來被稱為費城染色體（Philadelphiachromosome）的微小染色體；1973年Rowley證明了Ph染色體是9號和22號染色體易位所致，這是人們在腫瘤中認識到的第一種染色體易位；現(xiàn)在，已有11,500篇文獻報道了55,600多個克隆性細胞遺傳學(xué)異常。這些染色體畸變，特別是染色體易位及其對應(yīng)的融合基因在腫瘤致病的起始階段有著重要的作用，無不闡明克隆性細胞遺傳學(xué)異常是腫瘤的特性，在腫瘤來源中起重要作用。下圖是多個疾病報告的克隆性染色體異常病例數(shù)2、染色體異常的常見類型染色體異常指數(shù)目異常和構(gòu)造異常兩類：前者涉及整條染色體數(shù)目的擴增和缺失；后者涉及染色體易位、插入、倒置、區(qū)帶的缺失或擴增等。下圖是染色體數(shù)目異常染色體構(gòu)造異常3、染色體異常的檢測辦法染色體異常的識別得益于二十世紀六十年代后發(fā)展起來的胰蛋白酶－姬姆薩染色和常規(guī)顯帶技術(shù)，使得常規(guī)篩查全基因組染色體異常和檢測染色體核型變化成為可能。染色體顯帶是細胞遺傳學(xué)分析技術(shù)中原則和慣用的辦法，但耗時且依賴于獲得良好的分裂相，還難于分析復(fù)雜和隱匿的異常。PCR或熒光原位雜交（FISH，fluorescentinsituhybridization）對染色體異常的檢出依賴于引物或探針與模板的結(jié)合，因此較常規(guī)顯帶含有更高的特異性，是高通量檢測染色體異常的敏感和特異的辦法。熒光原位雜交及其探針1、熒光原位雜交的原理染色體熒光原位雜交始于傳統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)和DNA技術(shù)的結(jié)合，這種結(jié)合開創(chuàng)了一門新的學(xué)科——分子細胞遺傳學(xué)。其基礎(chǔ)是Southernblot原理，以半抗原如生物素、地高辛間接標記或以熒光素直接標記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交，互補的異源單鏈DNA分子在適宜的溫度和離子強度下退火形成穩(wěn)定的異源雙鏈DNA，通過熒光標記的親和素或抗地高辛抗體將半抗原顯示出來，通過熒光顯微鏡觀察雜交信號。FISH含有快速敏捷、特異性好的特點，可同時分析分裂期和間期的多個細胞，并進行定量；能夠檢測隱匿或微小的染色體畸變以及復(fù)雜核型；還能夠使用多個熒光標記，顯示DNA片段及基因之間的相對位置與方向，空間定位精確。2、熒光原位雜交探針的類型FISH技術(shù)種類甚多，發(fā)展快速，其實現(xiàn)需要獲得能與靶序列互補結(jié)合的探針。慣用的探針有下列三類：1、染色體重復(fù)序列探針，重要是指著絲粒α-衛(wèi)星DNA重復(fù)序列探針和端粒重復(fù)序列探針，用以檢測染色體數(shù)目異常，同時由于G顯帶時，端粒區(qū)是蒼白的，因此涉及此區(qū)的易位常難以檢測，而應(yīng)用端粒探針則彌補了G顯帶的局限性；2、染色體涂染探針，涉及通過流式分選或顯微切割獲得的全染色體或染色體臂以及特異性區(qū)帶的涂染探針，用以檢測染色體數(shù)目或構(gòu)造異常；3、染色體單一序列探針，涉及各類人工染色體探針，如酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)、細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）、P1人工染色體（P1artificialchromosome,PAC）探針，重要用以識別染色體的易位、缺失和擴增。α-衛(wèi)星DNA（alphasatelliteDNA）是唯一一種存在于全部人類染色體著絲粒區(qū)域的著絲粒DNA（centromereDNA，CEN-DNA）家族，由171bp的單體為單位構(gòu)成的高度串聯(lián)重復(fù)片段，重復(fù)數(shù)百次至數(shù)千次，跨越長達100kb的著絲粒DNA區(qū)域，其雜交將產(chǎn)生很強的雜交信號。因此常被選為著絲粒探針的來源。TheWellcomeTrustSangerInstitute（Hinxton,Cambridge）由WellcomeTrust和BritishMedicalResearchCouncil聯(lián)合建立，是世界上較早開展人類基因組大規(guī)模測序并含有相稱實力的測序中心。該中心運用能容納大片段人類基因組DNA的高容量載體（如粘粒、BAC、PAC等）構(gòu)建了大片段人類基因組DNA文庫，通過文庫中末端互相重疊的DNA片段連接成疊連群（contig）并與鳥槍法相結(jié)合，加緊了基因組測序，實現(xiàn)了人類基因組計劃（HumanGenomeProject，HGP）中人類基因組的物理作圖（physicalmapping）和基因組測序相結(jié)合的目的。因此，這些克隆文庫為基因定位研究提供了豐富的DNA序列資源，NCBICloneRegistry（）、EnsemblGenomeBrowser（）和UCSCGenomeBioinformatics（）提供的網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)資源也記載了許多克隆基因組定位的具體信息，為我們選擇對應(yīng)克隆為作為染色體單一序列和端粒探針的來源提供了便利。大片段人類基因組DNA文庫的構(gòu)建過程慣用的BAC、PAC文庫人類基因組的鳥槍法測序和物理作圖定位檢索BAC、PAC克隆的慣用數(shù)據(jù)庫熒光原位雜交探針的制備和熒光原位雜交實驗流程第一天缺口平移標記探針1.1試劑準備（1）0.1mmol/LdNTP0.3mmol/LdATP、0.3mmol/LdCTP和0.3mmol/LdGTP等體積混合。（2）0.1mmol/LdTTP1倍體積的0.3mmol/LdTTP和2倍體積的三蒸水混合。1.2缺口平移體系和反映條件0.1mmol/LdTTP6.5μl0.1mmol/LdNTP10μl10×NickTranslationbuffer5μl1mmol/LDIG-11-dUTP/Biotin-16-dUTP0.5μlNickTranslationEnzyme10μlDNA(1μg)XμlH2O18-Xμlintotal50μl以上為標記1μgDNA的缺口平移體系，若標記更多量的DNA，則試劑量和反映體系對應(yīng)等倍擴大。各成分混勻后短時離心。對于≤10kb的質(zhì)粒，于15℃反映3.5小時；對于BAC/PAC，于151.3凝膠電泳判斷探針大小將EP管置于冰上，取其中5μl于70℃加熱5分鐘后行2％瓊脂糖凝膠電泳以觀察所標記探針的大小，單一序列探針適宜大小為200～600bp；如片段大小偏大，則于151.4終止反映向反映體系中加入1μl0.5MEDTA和（或）70℃加熱5分鐘，以滅活酶。探針于-20第二天1.探針的沉淀和變性1.1探針混合物的構(gòu)成（1）對BAC/PAC探針DNA探針5ulHumanCot-1DNA3ulSalmonSpermDNA0.5ulH2O1.5ulintotal10ul（2）對著絲粒探針：DNA探針5ulSalmonSpermDNA0.5ulH2O4.5ulintotal10ul1.2DNA的沉淀將探針混合物與1ul（V/10）3M醋酸鈉（PH5.2）和27.5ul（2.5V）無水乙醇（-20℃凍存）混合，-80℃沉淀30min（或-20℃沉淀過夜），以14000g1.3清洗沉淀小心棄去上清，用70％乙醇洗滌一次，再次以14000g在4℃離心15min；小心棄去上清，在45～50℃注：當(dāng)大部分乙醇蒸發(fā)時，白色的DNA沉淀變?yōu)榘胪该鳡?；一定要徹底去除乙醇，否則會在加入MasterMix后產(chǎn)生微小的沉淀，造成高背景。1.4溶解探針加入5μl預(yù)熱至37℃的去離子甲酰胺（PH7.0），短時離心后在37℃振搖30min以充足溶解DNA；再加入預(yù)熱至37℃注：振搖時間盡量延長；DNA沉淀亦能夠TE緩沖液1.1μl溶解后加入Vysis探針緩沖液4.4μl稀釋，混勻后瞬時離心，37℃1.5探針的變性和預(yù)雜交短時離心后于80℃水浴中變性探針10min，冰浴5分鐘；短時離心，于372.標本（染色體靶DNA）的解決和變性2.1滴片和老化取出儲存于-20℃的細胞懸液標本，以1100rpm.離心10min沉淀細胞，換用適量體積的新鮮甲醇:冰乙醇（v/v）＝3:1固定液重懸細胞并調(diào)節(jié)細胞密度，滴片，劃出雜交區(qū)域，晾干；在預(yù)熱到372.2RNaseA消化每張玻片上加30μl100μg/mlRNA酶（將10mg/ml的RNaseA儲存液稀釋100倍），蓋上22×22mm蓋玻片，置于37℃2.3靶DNA的變性將玻片放入預(yù)溫至72℃（每增加一張玻片，溫度要提高1℃）的70%去離子甲酰胺/2×SSC中變性2分鐘后，立刻置入預(yù)冷至2.4蛋白酶消化將50μl100mg/ml的胃蛋白酶（終濃度為0.01％）加入預(yù)溫至37℃注：靶DNA的變性和消化應(yīng)與探針變性同時進行，完畢后盡快進行雜交。3.雜交將變性后的DNA探針加于玻片雜交區(qū)域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，封片后置于濕盒中，37℃第三天1.雜交后洗滌和半抗原信號放大1.1雜交后洗片小心揭去封片膠和蓋玻片，將玻片置于預(yù)熱至46℃的50％甲酰胺/2×SSC中，5min×3缸；將玻片移入室溫下4×SSC/0.1%Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸；每張玻片滴加30μl阻斷液1，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37注：此后環(huán)節(jié)應(yīng)注意避光操作。1.2滴加一抗將4μlAnti-DIGmonoclonalantibody和0.5μlTexas-red-Avidin稀釋于100μl抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25μl于雜交區(qū)域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃1.3滴加二抗將4μlAnti-mouse-Ig-DIG和1μlBiotinylatedgoatanti-Avidin稀釋于100μl抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25μl于雜交區(qū)域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃1.4滴加三抗將4μlAnti-DIG-Fluorescein和0.5μlTexas-red-Avidin稀釋于100μl抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25μl于雜交區(qū)域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃注：以上環(huán)節(jié)按雙色FISH描述，若為單色FISH則選擇對應(yīng)抗體即可。2.核復(fù)染和抗熒光淬滅劑封片將1.25μl5mg/ml的DAPI加入50ml2×SSC中（終濃度為125ng/ml，避光保存于4℃），混勻；將玻片置于其中，避光復(fù)染2min；2×