熒光原位雜交FISH探針制備及其應(yīng)用

熒光原位雜交（FISH）探針的制備及其應(yīng)用概述1、克隆性染色體異常是腫瘤的特性2、染色體異經(jīng)常見(jiàn)的類(lèi)型3、染色體異常的檢測(cè)辦法二、熒光原位雜交及其探針1、熒光原位雜交的原理2、熒光原位雜交的探針三、熒光原位雜交探針的制備和熒光原位雜交（按實(shí)驗(yàn)流程介紹）概述1、克隆性染色體異常是腫瘤的特性19德國(guó)遺傳學(xué)家Boveri就提出染色體畸變與腫瘤來(lái)源有關(guān)，然而這還僅僅只是一種假說(shuō)；1960年Nowell和Hungerford在7例慢性髓系白血?。╟hronicmyeloidleukemia，CML）的患者中發(fā)現(xiàn)后來(lái)被稱(chēng)為費(fèi)城染色體（Philadelphiachromosome）的微小染色體；1973年Rowley證明了Ph染色體是9號(hào)和22號(hào)染色體易位所致，這是人們?cè)谀[瘤中認(rèn)識(shí)到的第一種染色體易位；現(xiàn)在，已有11,500篇文獻(xiàn)報(bào)道了55,600多個(gè)克隆性細(xì)胞遺傳學(xué)異常。這些染色體畸變，特別是染色體易位及其對(duì)應(yīng)的融合基因在腫瘤致病的起始階段有著重要的作用，無(wú)不闡明克隆性細(xì)胞遺傳學(xué)異常是腫瘤的特性，在腫瘤來(lái)源中起重要作用。下圖是多個(gè)疾病報(bào)告的克隆性染色體異常病例數(shù)2、染色體異常的常見(jiàn)類(lèi)型染色體異常指數(shù)目異常和構(gòu)造異常兩類(lèi)：前者涉及整條染色體數(shù)目的擴(kuò)增和缺失；后者涉及染色體易位、插入、倒置、區(qū)帶的缺失或擴(kuò)增等。下圖是染色體數(shù)目異常染色體構(gòu)造異常3、染色體異常的檢測(cè)辦法染色體異常的識(shí)別得益于二十世紀(jì)六十年代后發(fā)展起來(lái)的胰蛋白酶－姬姆薩染色和常規(guī)顯帶技術(shù)，使得常規(guī)篩查全基因組染色體異常和檢測(cè)染色體核型變化成為可能。染色體顯帶是細(xì)胞遺傳學(xué)分析技術(shù)中原則和慣用的辦法，但耗時(shí)且依賴(lài)于獲得良好的分裂相，還難于分析復(fù)雜和隱匿的異常。PCR或熒光原位雜交（FISH，fluorescentinsituhybridization）對(duì)染色體異常的檢出依賴(lài)于引物或探針與模板的結(jié)合，因此較常規(guī)顯帶含有更高的特異性，是高通量檢測(cè)染色體異常的敏感和特異的辦法。熒光原位雜交及其探針1、熒光原位雜交的原理染色體熒光原位雜交始于傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)和DNA技術(shù)的結(jié)合，這種結(jié)合開(kāi)創(chuàng)了一門(mén)新的學(xué)科——分子細(xì)胞遺傳學(xué)。其基礎(chǔ)是Southernblot原理，以半抗原如生物素、地高辛間接標(biāo)記或以熒光素直接標(biāo)記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交，互補(bǔ)的異源單鏈DNA分子在適宜的溫度和離子強(qiáng)度下退火形成穩(wěn)定的異源雙鏈DNA，通過(guò)熒光標(biāo)記的親和素或抗地高辛抗體將半抗原顯示出來(lái)，通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察雜交信號(hào)。FISH含有快速敏捷、特異性好的特點(diǎn)，可同時(shí)分析分裂期和間期的多個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行定量；能夠檢測(cè)隱匿或微小的染色體畸變以及復(fù)雜核型；還能夠使用多個(gè)熒光標(biāo)記，顯示DNA片段及基因之間的相對(duì)位置與方向，空間定位精確。2、熒光原位雜交探針的類(lèi)型FISH技術(shù)種類(lèi)甚多，發(fā)展快速，其實(shí)現(xiàn)需要獲得能與靶序列互補(bǔ)結(jié)合的探針。慣用的探針有下列三類(lèi)：1、染色體重復(fù)序列探針，重要是指著絲粒α-衛(wèi)星DNA重復(fù)序列探針和端粒重復(fù)序列探針，用以檢測(cè)染色體數(shù)目異常，同時(shí)由于G顯帶時(shí)，端粒區(qū)是蒼白的，因此涉及此區(qū)的易位常難以檢測(cè)，而應(yīng)用端粒探針則彌補(bǔ)了G顯帶的局限性；2、染色體涂染探針，涉及通過(guò)流式分選或顯微切割獲得的全染色體或染色體臂以及特異性區(qū)帶的涂染探針，用以檢測(cè)染色體數(shù)目或構(gòu)造異常；3、染色體單一序列探針，涉及各類(lèi)人工染色體探針，如酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)、細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）、P1人工染色體（P1artificialchromosome,PAC）探針，重要用以識(shí)別染色體的易位、缺失和擴(kuò)增。α-衛(wèi)星DNA（alphasatelliteDNA）是唯一一種存在于全部人類(lèi)染色體著絲粒區(qū)域的著絲粒DNA（centromereDNA，CEN-DNA）家族，由171bp的單體為單位構(gòu)成的高度串聯(lián)重復(fù)片段，重復(fù)數(shù)百次至數(shù)千次，跨越長(zhǎng)達(dá)100kb的著絲粒DNA區(qū)域，其雜交將產(chǎn)生很強(qiáng)的雜交信號(hào)。因此常被選為著絲粒探針的來(lái)源。TheWellcomeTrustSangerInstitute（Hinxton,Cambridge）由WellcomeTrust和BritishMedicalResearchCouncil聯(lián)合建立，是世界上較早開(kāi)展人類(lèi)基因組大規(guī)模測(cè)序并含有相稱(chēng)實(shí)力的測(cè)序中心。該中心運(yùn)用能容納大片段人類(lèi)基因組DNA的高容量載體（如粘粒、BAC、PAC等）構(gòu)建了大片段人類(lèi)基因組DNA文庫(kù)，通過(guò)文庫(kù)中末端互相重疊的DNA片段連接成疊連群（contig）并與鳥(niǎo)槍法相結(jié)合，加緊了基因組測(cè)序，實(shí)現(xiàn)了人類(lèi)基因組計(jì)劃（HumanGenomeProject，HGP）中人類(lèi)基因組的物理作圖（physicalmapping）和基因組測(cè)序相結(jié)合的目的。因此，這些克隆文庫(kù)為基因定位研究提供了豐富的DNA序列資源，NCBICloneRegistry（）、EnsemblGenomeBrowser（）和UCSCGenomeBioinformatics（）提供的網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)資源也記載了許多克隆基因組定位的具體信息，為我們選擇對(duì)應(yīng)克隆為作為染色體單一序列和端粒探針的來(lái)源提供了便利。大片段人類(lèi)基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程慣用的BAC、PAC文庫(kù)人類(lèi)基因組的鳥(niǎo)槍法測(cè)序和物理作圖定位檢索BAC、PAC克隆的慣用數(shù)據(jù)庫(kù)熒光原位雜交探針的制備和熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)流程第一天缺口平移標(biāo)記探針1.1試劑準(zhǔn)備（1）0.1mmol/LdNTP0.3mmol/LdATP、0.3mmol/LdCTP和0.3mmol/LdGTP等體積混合。（2）0.1mmol/LdTTP1倍體積的0.3mmol/LdTTP和2倍體積的三蒸水混合。1.2缺口平移體系和反映條件0.1mmol/LdTTP6.5μl0.1mmol/LdNTP10μl10×NickTranslationbuffer5μl1mmol/LDIG-11-dUTP/Biotin-16-dUTP0.5μlNickTranslationEnzyme10μlDNA(1μg)XμlH2O18-Xμlintotal50μl以上為標(biāo)記1μgDNA的缺口平移體系，若標(biāo)記更多量的DNA，則試劑量和反映體系對(duì)應(yīng)等倍擴(kuò)大。各成分混勻后短時(shí)離心。對(duì)于≤10kb的質(zhì)粒，于15℃反映3.5小時(shí)；對(duì)于BAC/PAC，于151.3凝膠電泳判斷探針大小將EP管置于冰上，取其中5μl于70℃加熱5分鐘后行2％瓊脂糖凝膠電泳以觀(guān)察所標(biāo)記探針的大小，單一序列探針適宜大小為200～600bp；如片段大小偏大，則于151.4終止反映向反映體系中加入1μl0.5MEDTA和（或）70℃加熱5分鐘，以滅活酶。探針于-20第二天1.探針的沉淀和變性1.1探針混合物的構(gòu)成（1）對(duì)BAC/PAC探針DNA探針5ulHumanCot-1DNA3ulSalmonSpermDNA0.5ulH2O1.5ulintotal10ul（2）對(duì)著絲粒探針：DNA探針5ulSalmonSpermDNA0.5ulH2O4.5ulintotal10ul1.2DNA的沉淀將探針混合物與1ul（V/10）3M醋酸鈉（PH5.2）和27.5ul（2.5V）無(wú)水乙醇（-20℃凍存）混合，-80℃沉淀30min（或-20℃沉淀過(guò)夜），以14000g1.3清洗沉淀小心棄去上清，用70％乙醇洗滌一次，再次以14000g在4℃離心15min；小心棄去上清，在45～50℃注：當(dāng)大部分乙醇蒸發(fā)時(shí)，白色的DNA沉淀變?yōu)榘胪该鳡?；一定要徹底去除乙醇，否則會(huì)在加入MasterMix后產(chǎn)生微小的沉淀，造成高背景。1.4溶解探針加入5μl預(yù)熱至37℃的去離子甲酰胺（PH7.0），短時(shí)離心后在37℃振搖30min以充足溶解DNA；再加入預(yù)熱至37℃注：振搖時(shí)間盡量延長(zhǎng)；DNA沉淀亦能夠TE緩沖液1.1μl溶解后加入Vysis探針緩沖液4.4μl稀釋?zhuān)靹蚝笏矔r(shí)離心，37℃1.5探針的變性和預(yù)雜交短時(shí)離心后于80℃水浴中變性探針10min，冰浴5分鐘；短時(shí)離心，于372.標(biāo)本（染色體靶DNA）的解決和變性2.1滴片和老化取出儲(chǔ)存于-20℃的細(xì)胞懸液標(biāo)本，以1100rpm.離心10min沉淀細(xì)胞，換用適量體積的新鮮甲醇:冰乙醇（v/v）＝3:1固定液重懸細(xì)胞并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度，滴片，劃出雜交區(qū)域，晾干；在預(yù)熱到372.2RNaseA消化每張玻片上加30μl100μg/mlRNA酶（將10mg/ml的RNaseA儲(chǔ)存液稀釋100倍），蓋上22×22mm蓋玻片，置于37℃2.3靶DNA的變性將玻片放入預(yù)溫至72℃（每增加一張玻片，溫度要提高1℃）的70%去離子甲酰胺/2×SSC中變性2分鐘后，立刻置入預(yù)冷至2.4蛋白酶消化將50μl100mg/ml的胃蛋白酶（終濃度為0.01％）加入預(yù)溫至37℃注：靶DNA的變性和消化應(yīng)與探針變性同時(shí)進(jìn)行，完畢后盡快進(jìn)行雜交。3.雜交將變性后的DNA探針加于玻片雜交區(qū)域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，封片后置于濕盒中，37℃第三天1.雜交后洗滌和半抗原信號(hào)放大1.1雜交后洗片小心揭去封片膠和蓋玻片，將玻片置于預(yù)熱至46℃的50％甲酰胺/2×SSC中，5min×3缸；將玻片移入室溫下4×SSC/0.1%Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸；每張玻片滴加30μl阻斷液1，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37注：此后環(huán)節(jié)應(yīng)注意避光操作。1.2滴加一抗將4μlAnti-DIGmonoclonalantibody和0.5μlTexas-red-Avidin稀釋于100μl抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25μl于雜交區(qū)域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃1.3滴加二抗將4μlAnti-mouse-Ig-DIG和1μlBiotinylatedgoatanti-Avidin稀釋于100μl抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25μl于雜交區(qū)域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃1.4滴加三抗將4μlAnti-DIG-Fluorescein和0.5μlTexas-red-Avidin稀釋于100μl抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25μl于雜交區(qū)域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃注：以上環(huán)節(jié)按雙色FISH描述，若為單色FISH則選擇對(duì)應(yīng)抗體即可。2.核復(fù)染和抗熒光淬滅劑封片將1.25μl5mg/ml的DAPI加入50ml2×SSC中（終濃度為125ng/ml，避光保存于4℃），混勻；將玻片置于其中，避光復(fù)染2min；2×