第七章之后四基因治療

基因治療1.基因治療歷史與現(xiàn)狀20世紀(jì)80年代初，Cline首次對β-珠蛋白生成障礙性貧血患者進(jìn)行基因治療嘗試1990年9月，美國批準(zhǔn)世界上首個基因治療方案。腺苷酸脫氨酶（ADA）基因。1989-1995，企業(yè)界投入10億美元從事研究；1995-1996年，NIH對美國已進(jìn)行的103個基因治療研究方案進(jìn)行了評估；急功近利、不切實(shí)際；1996年，載體研究初見成效，非病毒型載體改建成功，在細(xì)胞中表達(dá)效率提高了100倍以上。開展基因治療臨床試驗(yàn)的主要國家和地區(qū)國家或地區(qū)臨床方案數(shù)%病例數(shù)%美國27874.4220070.2英國184.81113.5法國143.8892.8德國82.1672.1意大利82.1391.2加拿大71.9481.5瑞士71.9341.1埃及10.3150.5日本30.850.2中國20.540.1新加坡20.5190.6韓國10.310以色列10.300已進(jìn)行基因治療臨床試驗(yàn)的受試對象與疾病類型類型臨床方案數(shù)%病例數(shù)%腫瘤23462.7213468.1單基因遺傳病5314.22969.4基因標(biāo)志41112277.2感染性疾病30840512.9健康志愿者20.560.2其他133.5662.1惡性腫瘤中，惡性黑色素瘤約占40%，轉(zhuǎn)移腫瘤占14%，惡性膠質(zhì)瘤占11%，乳腺癌10%，腎癌7%，結(jié)腸癌6%等。基因治療臨床試驗(yàn)所采用的主要載體與轉(zhuǎn)移方法載體或方法臨床方案數(shù)%病例數(shù)%逆轉(zhuǎn)錄病毒載體15441.3119438.1脂質(zhì)體6918.572523.1腺病毒載體6316.936411.6牛痘病毒載體246.41304.1產(chǎn)RV細(xì)胞215.642013.4裸DNA133.5692.2基因槍41.1351.1腺相關(guān)病毒載體30.8361.1電穿孔20.5200.62.基因治療的概念與策略基因治療的定義：

將正常功能性基因置換或彌補(bǔ)缺陷基因的手段，廣義地講，即將新的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)某個體的細(xì)胞內(nèi)從而獲得治療效果，導(dǎo)入的基因可以是與缺陷基因?qū)?yīng)的功能性同源基因，也可以是與缺陷基因無關(guān)的治療基因?；蛑委煹牟呗曰蛑脫Q(genereplacement)基因修復(fù)(genecorrection)基因增補(bǔ)(geneaugmentation)基因失活(geneinactivation)免疫調(diào)節(jié)(immuneadjustment)基因治療的途徑invivo，稱為活體直接轉(zhuǎn)移，指將外源基因直接注入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞。更簡單、直接和經(jīng)濟(jì)，療效也比較確切，常用的體內(nèi)基因直接轉(zhuǎn)移手段有病毒介導(dǎo)、脂質(zhì)體介導(dǎo)和基因直接注射等。exvivo，稱為在體轉(zhuǎn)移，指在體外將外源基因?qū)爰?xì)胞，再將這種細(xì)胞回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。該方法經(jīng)典、安全且效果容易控制，但技術(shù)復(fù)雜。3.基因轉(zhuǎn)移的方法物理方法：包括裸DNA直接注射、微粒轟擊、電穿孔、顯微注射等?；瘜W(xué)方法：磷酸鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等。生物學(xué)方法：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、單純皰疹病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、嵌合病毒載體。幾種常見的基因?qū)氚屑?xì)胞的方法的比較名稱機(jī)制轉(zhuǎn)染效率用途優(yōu)缺點(diǎn)影響因素細(xì)胞核微注射直接注射50-100%穩(wěn)定轉(zhuǎn)化需要特殊儀器,處理樣品數(shù)量少,高效注射技術(shù),DNA濃度電穿孔高壓在膜上形成微孔較高瞬時表達(dá),穩(wěn)定轉(zhuǎn)化需要精密儀器,可用于動、植物細(xì)胞和細(xì)菌電場強(qiáng)度，脈沖長度，溫度，DNA濃度，培養(yǎng)液原生質(zhì)體融合細(xì)胞膜融合50-100%瞬時表達(dá),穩(wěn)定轉(zhuǎn)化操作復(fù)雜，不能進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，慎用于篩選營養(yǎng)缺陷型變異株溶菌酶，PEG濃度，溫育時間脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染脂膜融合50-60%瞬時表達(dá),穩(wěn)定轉(zhuǎn)化操作簡單，可用于體內(nèi)試驗(yàn)脂質(zhì)體質(zhì)量，DNA濃度磷酸鈣共沉淀內(nèi)吞作用20%瞬時表達(dá)簡單有效，適用于貼壁、非貼壁細(xì)胞Ca2+，DNA濃度，pH，沉淀時間，氯喹、甘油和丁酸鈉處理基因治療的載體可分為病毒性載體和非病毒性載體兩大類。

病毒性載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒（Rt）、腺病毒（Ad）、皰疹病毒(HSV)及腺相關(guān)病毒（AAV）等。

非病毒性載體主要包括脂質(zhì)體、分子偶聯(lián)載體、裸露DNA等常見病毒載體的優(yōu)缺點(diǎn)比較載體優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)主要用途逆轉(zhuǎn)錄病毒，單鏈RNA病毒，約10kb基因組小并且簡單，生物學(xué)特性清楚，可有效整合到靶細(xì)胞的基因組中，并穩(wěn)定持久表達(dá)所帶外源基因，表達(dá)時間較長，病毒基因組以轉(zhuǎn)座的方式整合，可高效感染分裂細(xì)胞插入容量有限，可能會與有復(fù)制能力的病毒重組，有致癌的危險(xiǎn)Exvivo基因治療，腫瘤基因治療腺病毒，雙鏈DNA病毒，36kb生物學(xué)特性清楚，可感染分裂和非分裂細(xì)胞，在非分裂細(xì)胞中也可進(jìn)行高效的體內(nèi)感染，病毒滴度高，外源基因表達(dá)水平較高不與宿主基因組整合，表達(dá)時間較短，病毒蛋白免疫原性強(qiáng)，可引起免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，插入容量有限（7-8kb）Ivvivo基因治療，特別適于原位使用，尤其是肺部，腫瘤基因治療常見病毒載體的優(yōu)缺點(diǎn)比較（續(xù)）載體優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)主要用途腺伴隨病毒，單鏈DNA病毒，4.6kb無毒、無致病性，免疫原性弱，可位點(diǎn)特異性整合于人19號染色體，長期表達(dá)外源基因，可感染分裂和非分裂細(xì)胞，在骨骼肌、心肌、肝、視網(wǎng)膜等組織中表達(dá)較高基因組小，攜帶外源基因能力有限（4kb），需腺病毒等輔助復(fù)制，難得到高滴度病毒Ivvivo及exvivo基因治療，遺傳疾病基因治療，獲得性慢性疾病的基因治療單純皰疹病毒，雙鏈DNA病毒，152kb插入容量可達(dá)50kb以上，可同時裝載多個目的基因，具有嗜神經(jīng)性，可潛伏感染，可感染分裂和非分裂細(xì)胞分子生物學(xué)特性尚未完全闡明，神經(jīng)毒性在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療方面得到了廣泛應(yīng)用4.基因治療的靶細(xì)胞生殖細(xì)胞基因治療(germcellgenetherapy)

精細(xì)胞、卵細(xì)胞、早期胚胎體細(xì)胞基因治療（somaticcellg