結(jié)核分枝桿菌與實驗室生物安全

結(jié)核分枝桿菌與實驗室生物安全廣東省結(jié)核病防治研究所鐘球

錢明附件廣東省結(jié)核病防治研究所鐘球

錢明§結(jié)核病的定義§結(jié)核病的疫情§結(jié)核病病原學§結(jié)核病的流行§結(jié)核病實驗室生物安全§結(jié)核病實驗室安全防護§結(jié)核病實驗室廢物解決§結(jié)核病職業(yè)暴露§結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（偶然可由牛型或非洲型分枝桿菌）引發(fā)的一種細菌性疾病。結(jié)核病可累及全身各個器官，但以肺結(jié)核最為常見。該病含有傳染性強，散播面廣，不分地區(qū)均可發(fā)生。結(jié)核病可由呼吸道、消化道、皮膚等途徑感染，但其重要傳輸途徑是以空氣為傳輸因子的呼吸道傳染，而排菌的肺結(jié)核病人傳染性更大，是傳輸感染的重要傳染源。結(jié)核病的疫情n感染人數(shù)

約為20億n新發(fā)活動性肺結(jié)核病人890萬(141/10萬)n新發(fā)涂陽肺結(jié)核病人

390萬n結(jié)核病發(fā)病率每年增加1%n預(yù)計患病人數(shù)為1550萬例（患病率為246/10萬）其中涉及HIV+TB38萬例n死于結(jié)核病為180萬例，結(jié)核病死亡率為29/10萬,其中涉及HIV+TB死亡27萬例結(jié)核病病原學§結(jié)核分枝桿菌是引發(fā)人類結(jié)核病的重要病原體。1882年由德國醫(yī)生Koch發(fā)現(xiàn)。在微生物分類中，結(jié)核分枝桿菌屬于厚壁門、裂殖菌綱、放線菌目、分枝桿菌科、分枝桿菌屬。分枝桿菌復合群共涉及人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型結(jié)核分枝桿菌是人類重要的致病菌。結(jié)核分枝桿菌的形態(tài)§

結(jié)核分枝桿菌菌體含有多形態(tài)特性，除正常典型形態(tài)外，受不良生長條件的影響。如物理因素、化學因素，特別是藥品因素，而呈現(xiàn)異常變化，其多個形態(tài)可歸納為桿菌型（基本形態(tài)）、濾過型、顆粒型和球菌型（L型）4種類型?！?/p>

1.桿菌型（基本形態(tài)）結(jié)核分枝桿菌正常典型的形態(tài)是直或稍彎曲、兩端鈍圓的桿菌。菌體

長1～4μm，寬0.3～0.6μm，無芽胞、無莢膜、無鞭毛，生長發(fā)育期間有分枝生長傾向。§

2.濾過型早在19，F(xiàn)outes在檢查細菌濾器濾過的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液時，在電子顯微鏡下觀察到球狀微粒體。1991年，Khomeko在豚鼠損壞性肺結(jié)核模型中證明了濾過型的存在。此球狀微粒體可通過細菌濾膜，稱為濾過型。§

3.顆粒型19莫赫(Much)在結(jié)核性冷性膿腫、漿液性滲出液、干酪性淋巴結(jié)等膿液中觀察到革蘭染色陽性顆粒，稱為莫赫顆粒。莫赫顆粒的重要意義在于這些顆粒型體仍有生機與活力，在適宜的營養(yǎng)條件下，可重新獲得增殖，發(fā)育生長出典型結(jié)核分枝桿菌?！?/p>

4.球菌型（L型）結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)外受物理、化學、免疫等因素的影響，維持菌體固有形態(tài)的細胞壁缺損或喪失，產(chǎn)生細胞壁缺點型。細胞壁缺點型細菌是1935年Kilienberger在英國Lister醫(yī)學研究院研究念珠狀鏈桿菌時首先發(fā)現(xiàn)的，故以Lister醫(yī)學研究院的第一種字母，將細胞壁缺點型細菌命名為L型菌。結(jié)核分枝桿菌的染色特性§

結(jié)核分枝桿菌本身無顏色，觀察結(jié)核分枝桿菌必須染色后進行。結(jié)核分枝桿菌革蘭染色陽性，但革蘭染色不易著色。經(jīng)苯胺染料著色后，能抵抗酸和酸乙醇脫色，此種特性稱為抗酸性。Z-N染色法為最慣用的一種抗酸染色辦法，經(jīng)此法染色后，分枝桿菌，涉及結(jié)核分枝桿菌呈紅色，而標本中其它細菌、細胞、雜質(zhì)等均呈藍色結(jié)核分枝桿菌的生長特性§

結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，繁殖一代在人工培養(yǎng)基內(nèi)約需要15～20小時，在靜脈感染未經(jīng)免疫小鼠肺中約需要15小時，在巨噬細胞內(nèi)約需要15～20小時，在家兔角膜中約需要20～22小時。結(jié)核分枝桿菌的抵抗力§

結(jié)核分枝桿菌因細胞壁含大量類脂質(zhì)，特別是臘樣物質(zhì)，含有疏水性，對物理和化學因素的作用均較普通致病菌抵抗力強?！?/p>

1.物理因素影響結(jié)核分枝桿菌生存能力較強，在溫室和陰暗處干燥痰內(nèi)能夠存活6～8個月，粘附在飛揚的空氣塵埃中可保持傳染性8～10天。結(jié)核分枝桿菌普通較耐低溫，在-6～8℃能存活4～5年?！?/p>

干熱對結(jié)核分枝桿菌殺傷力弱，痰內(nèi)結(jié)核分枝桿菌在100℃下需要4～5小時被殺滅。濕熱對結(jié)核分枝桿菌殺傷力強，在60℃30分鐘、70℃10分鐘、80℃5分鐘和90℃1分鐘可將其殺死，因此煮沸與高壓蒸氣消毒是最有效的辦法之一。§

結(jié)核分枝桿菌對光線和射線敏感，在太陽光直射下2～7小時死亡。病人用過的物品在強陽光下直曬半日，基本可達成消毒的目的。10～1mg/ml菌懸液，液層厚度3mm，用10W紫外線燈在距離確0.5m處持續(xù)照射3分鐘，在距離1m處持續(xù)照射10分鐘，經(jīng)培養(yǎng)無細菌生長。但紫外線穿透力弱，難以透入固體物質(zhì)內(nèi)部和液體深層，因此紫外線普通用于空氣和物體表面消毒。§

2.化學因素的影響化學消毒劑的種類諸多，其殺菌的機制因化學藥品種類不同而異。乙醇使菌細胞蛋白質(zhì)變性、凝固而產(chǎn)生殺菌作用。結(jié)核分枝桿菌直接接觸70%～75%乙醇5～30分鐘可被殺死，因此可用于皮膚消毒。但由于乙醇能凝固蛋白，使痰表面形成一層把菌體包裹起來的膜，短時間內(nèi)不能殺死細菌，故乙醇不能用于痰的消毒?！?/p>

苯酚重要通過破壞菌細胞膜而致細胞質(zhì)內(nèi)容物漏出，使菌體蛋白質(zhì)變性、凝固，克制菌體脫氫酶和氧化酶等酶系統(tǒng)殺死結(jié)核分枝桿菌。2%苯酚

5分鐘、5%苯酚1分鐘能殺死結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物。5%苯酚與痰液等量混合，24小時才干殺死結(jié)核分枝桿菌。煤酚皂溶液作用機制與苯酚相似，0.5%煤酚皂60分鐘，1%煤酚皂45分鐘，2%煤酚皂10分鐘，5%煤酚皂5分鐘，即能殺死結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物。5%～10%煤酚皂等量混入痰標本，12小時可殺滅結(jié)核分枝桿菌?！?/p>

甲醛使菌細胞蛋白質(zhì)變性凝固，喪失代謝功效致細菌死亡。1%甲醛解決結(jié)核分枝桿菌5分鐘，可使細菌死亡。5%甲醛和痰液等量混合，解決12小時以上才干達成殺菌作用?！?/p>

“84”消毒液是以氯為重要成分的消毒劑。氯是一種氧化劑，能使菌體的酶失活，還能與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，使菌體蛋白氯化，代謝功效障礙，細菌死亡。0.5%“84”消毒液15分鐘可殺死結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物，但對在蛋白質(zhì)混合液中的結(jié)核分枝桿菌幾乎無消毒效果。§

結(jié)核分枝桿菌對酸、堿抵抗力強，在4%NaOH，3%HCL和6%H2SO4中30分鐘仍能存活。臨床應(yīng)用酸或堿加入病人標本，消化蛋白質(zhì)及殺滅雜菌，以此分離出結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌對染料，如1∶13000孔雀綠和1∶75000甲紫有抵抗力，普通在培養(yǎng)基內(nèi)加入一定量的孔雀綠或甲紫克制其它雜菌生長。對普通細菌有較強殺菌作用的新潔爾滅，對結(jié)核分枝桿菌幾乎無消毒作用。結(jié)核分枝桿菌的致病性§

結(jié)核分枝桿菌不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素，也無侵襲性酶類。普通認為其致病作用可能與菌體表面構(gòu)造及某些菌體成分，如脂質(zhì)、某些菌體蛋白、多糖等多個物質(zhì)有關(guān)，重要是有毒結(jié)核分枝桿菌菌株在易感機體內(nèi)頑強增殖和與機體互相作用的成果。結(jié)核病流行§

結(jié)核病在人群中流行的三個生物學環(huán)節(jié)是：

1、傳染源，

2、感染傳輸途徑；

3、易動人群。影響結(jié)核分枝桿菌傳輸?shù)闹匾蛩亍?/p>

1、排菌量痰中結(jié)核分枝桿菌越多，傳輸?shù)奈ｋU性越大。病人出現(xiàn)痰涂片陽性若1ml痰液中含菌量為

1000－

10000，其痰涂片陽性率為40%－50%，痰液中含菌量低時，痰涂片陽性率亦低（表l）。表1

痰涂片與痰標本中結(jié)核分枝桿菌數(shù)§

痰涂片陽性（涂陽）病人的排菌量大，其親密接觸者的結(jié)核感染率明顯高于痰涂片陰性（涂陰）病人的親密接觸者，英國報告涂陰培陰病人的家庭小朋友親密接觸者結(jié)核感染率為17.6%；涂陰培陽病人的接觸者結(jié)核感染率為26.8%；涂陽培陽病人的接觸者結(jié)核感染率高達65.0%（表2）。表2不同傳染源對15歲下列親密接觸者的感染率（%）§

2．排出飛沫的大小傳染源排出的飛沫受壓力和粘稠度的影響而大小不一，飛沬核直徑1－10μm者在空氣中漂浮時間長，可進入人體末梢支氣管內(nèi)；飛沫核直徑較大者，則受地心引力的影響而墜落。§3．

患者病變與癥狀病變廣泛、損害嚴重的患者，特別是病變急劇進展，干酪溶解形成空洞患者的痰中含有大量結(jié)核分枝桿菌，是重要的傳染源?；颊呖人?、噴嚏或大聲說話時都能產(chǎn)生飛沫，有報道，當人咳嗽時每次排出的飛沫數(shù)約為3500個，一次噴嚏則可排出飛沫達100萬個；日常說話5分鐘所排出的飛沫數(shù)相稱于一次咳嗽，咳嗽是肺結(jié)核病人產(chǎn)生飛沫的重要方式。§

表3統(tǒng)計了病人每晚咳嗽次數(shù)，并觀察其0－14歲家庭接觸者的結(jié)核感染率每晚咳嗽48次以上患者的家庭接觸者感染率為43.9%，而咳嗽12次下列患者的接觸者感染率為27.5%。表3傳染源咳嗽次數(shù)與接觸者感染率§

4．接觸的親密程度周邊人群與傳染源接觸越親密，受感染的機會越多，涂片陽性病人的親密接觸者感染率明顯高于偶然接觸者（表4）。表4不同接觸程度小朋友感染率§

5．環(huán)境因素與傳染源病人同處在空氣不流通的室內(nèi)的親密接觸者，受結(jié)核感染的可能性增大。第二次世界大戰(zhàn)時期曾報道潛艇內(nèi)官兵大批感染和發(fā)病，也有民航客機上結(jié)核病傳染源使同機乘客受感染的報道。傳輸途徑§

呼吸道感染（respiratortractinfection）是肺結(jié)核的重要傳染途徑（routesofinfection），飛沬傳染（dropletinfection）為最常見的方式。傳染源重要是排菌的肺結(jié)核患者（特別是痰涂片陽性未經(jīng)治療者）。飛沬核（dropletnuclei）＜10μm時可被吸人呼吸道，健康人可因吸入患者咳嗽、打噴嚏時噴出的帶菌飛沫而受感染。易感者§

結(jié)核分枝桿菌進人人體，引發(fā)易感者（susceptible）機體的復雜反映?！?/p>

1．人體的防御反映人體的防御反映（defensereaction）有物理、化學和生物學反映。進人呼吸道的結(jié)核分枝桿菌飛泳核可被鼻、咽、喉、氣管和支氣管的粘液吸著、被酶殺滅并隨纖毛運動經(jīng)咳嗽、噴嚏和咳痰等動作排出體外，或被吞噬細胞吞噬殺滅。當防御功效（defensefunction）低下時，結(jié)核分枝桿菌進人下呼吸道，引發(fā)機體反映?！?/p>

2．人體的易感性未受結(jié)核感染的人是結(jié)核病的易動人群（susceptiblepopulation）一旦受到結(jié)核分枝桿菌傳輸，含有普遍的易感性（susceptibility），進入人體的結(jié)核分枝桿菌可在人體內(nèi)繁殖，結(jié)核分枝桿菌的繁殖周期約為10－20小時，一條結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)繁殖1周可達128條菌，繁殖20天將超出100萬條菌（表5），體內(nèi)的大量結(jié)核分枝桿菌將使人體患病，引發(fā)機體的免疫與變態(tài)反映。表5一條結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的繁殖狀況§

3.免疫與變態(tài)反映人體對結(jié)核分枝桿菌的自然免疫力（naturalimmunity）（先天免疫力）是非特異性的。接種卡介苗（bacillicalmette－guérin，BCG）或受結(jié)核分枝桿菌感染后所產(chǎn)生的獲得免疫力（acquiredimmunity）（后天性免疫力）則含有特異性，能將入侵的結(jié)核分枝桿菌殺死或嚴密包圍，制止其擴散，使病灶愈合。結(jié)核病的免疫重要是細胞免疫，體現(xiàn)為淋巴細胞的致敏與吞噬細胞功效的增強?；煏r代的結(jié)核病流行§化學療法的流行病學效果

傳染性肺結(jié)核病人接受抗結(jié)核藥品化學治療（chemotherapy）后，肺部病灶中的結(jié)核分枝桿菌被殺滅，傳染性減小以至消失，傳染源的流行病學作用隨之消失。實驗報告敏感菌在未治療時相對傳染性100%，在治療中只有25%，耐藥病人未治療時相對傳染性為100%。在治療時則只有27.3%。結(jié)核分枝桿菌檢查§一、結(jié)核分枝桿菌檢查的意義結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引發(fā)的可致全身器官或組織發(fā)生病變，而以肺部病變?yōu)槌Ｒ姷膫魅拘约膊?。因此，痰結(jié)核菌的檢查是結(jié)核病流行病學、結(jié)核病診療、擬定化療方案以及評價治療效果的重要手段，在當代結(jié)核病控制工作中起著不可或缺的重要作用?！旖Y(jié)核分枝桿菌檢查:

直接涂片;結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng)和結(jié)核分枝桿菌的藥品敏感性測定結(jié)核病實驗室生物安全§一、生物安全的概念

實驗室生物安全，是指在以微生物為對象的實驗工作中，防止生物危害，保障操作對象、操作者和環(huán)境的安全。合理的實驗室建筑構(gòu)造和布局、生物安全柜的對的使用，能夠使操作對象和工作人員得到有效的保護，排出的空氣經(jīng)高效濾器濾過也能夠保護鄰近人員及環(huán)境的安全。在沒有確保安全的實驗室條件下，解決傳染性強的實驗材料時，防護服、防止免疫和藥品防止是實驗室生物安全的必要確保?！於⑿g(shù)語與定義(一)生物因子（biologicalagents）一切微生物和生物活性物質(zhì)。(二)病原體（pathogens）可使人、動物或植物致病的生物因子（涉及微生物、寄生蟲等）。(三)危害廢棄物（hazardouswaste）有潛在生物危險、可燃、易燃、腐蝕、有毒、放射和起破壞作用的對人、環(huán)境有害的一切廢棄物。(四)危險（risk）傷害發(fā)生的概率及其嚴重性的綜合。(五)氣溶膠（aerosols）懸浮于氣體介質(zhì)中的固態(tài)或液態(tài)微小粒子（粒徑普通為0.001-100μm）形成的相對穩(wěn)定的分散體系。(六)高效空氣過濾器[highefficiencyparticulateairfilter（HEPA）]

普通以濾除≥0.3μm微粒為目的，濾除效率符合有關(guān)規(guī)定的過濾器。(七)安全罩（safetyhood）置于實驗室工作臺或儀器設(shè)備上的負壓排風罩，以減少實驗室工作者的暴露危險，排風經(jīng)高效過濾。(八)緩沖間（bufferroom）設(shè)立在清潔區(qū)、半污染區(qū)和污染區(qū)相臨兩區(qū)之間的緩沖密閉室，含有通風系統(tǒng)，其兩個門含有互鎖功效，且不能同時處在啟動狀態(tài)。(九)實驗室分區(qū)（laboratoryarea）按照生物因子污染概率的大小，實驗室可進行合理的分區(qū)。(十)氣鎖（airlock）氣壓可調(diào)節(jié)的氣密室，用于連接氣壓不同的兩個相鄰區(qū)域，其兩個門含有互鎖功效，不能同時處在啟動狀態(tài)。在實驗室中用作特殊通道。(十一)定向氣流（directionalairflow）在氣壓低于外環(huán)境大氣壓的實驗室中，從污染概率小且相對壓力高處向污染概率高且相對壓力低處受控制流動的氣流。(十二)一級屏障（primarybarrier）是操作者和被操作對象之間的隔離，也稱一級隔離。如生物安全柜、個體防護裝備等。(十三)二級屏障（secondarybarrier）是生物安全實驗室和外部環(huán)境的隔離，也稱二級隔離。(十四)生物安全實驗室（biosafetylaboratory）通過防護屏障和配套管理方法，達成生物安全規(guī)定的生物實驗室和動物實驗室?！烊?、微生物危害程度分級

微生物按其與否致病、致病力強弱、危害人體的嚴重性、傳染性的大小、臨近人群的抵抗力、有無免疫制劑和特效治療藥品等綜合評價，可分為四個不同的危害等級。結(jié)核分枝桿菌屬于3級危險?！?/p>

3級危險（對個體含有極大危害，對群體含有較大的危害性）：指有特殊危險的致病菌。感染后癥狀較重，并可能危及生命，或者缺少有效的防止辦法、發(fā)病后不易治療的微生物。實驗室感染的因素及防止§（一）技術(shù)操作可能造成的感染及其防止方法。

1.接種：應(yīng)使用無彈力的鉑絲接種環(huán)，結(jié)核菌接種后接種環(huán)火焰滅菌易崩散，酒精燈燒灼時要特別注意。

2.混勻：吸管吸吹菌液時不要產(chǎn)憤怒泡，應(yīng)沿容器壁排出。

3.研磨：最佳使用組織研磨器，乳缽易產(chǎn)憤怒溶膠。4.移液：吸管上端的棉花松緊要適度，吸液時要從管底吸取，吹出時要輕緩，不要全部吹凈，以免產(chǎn)憤怒泡，形成氣溶膠。5.開封：要避免壓力和氣流的急劇變化。6.離心：離心管套底墊要完好，使用匹配的管、套、離心頭，加蓋。7.注射：做好個人防護，對的使用注射器。8.搬運：室內(nèi)移動要避免滑落，移出室外要有堅實密閉的外包裝?！欤ǘ┥锇踩闹贫确椒?/p>

1.無生物安全3級實驗室，進行病原的實驗操作，要在有緩沖間的無菌室內(nèi)操作，并使用生物安全柜。2.工作前后要用紫外燈消毒。3.操作臺面要鋪濕消毒巾。4.按操作病原的危險等級和感染途徑做好個人防護。5.操作臺附近要常備消毒液，污染物要放入密閉容器及時滅菌。6.實驗室內(nèi)要嚴防蟲、鼠進入。7.根據(jù)需要對實驗室工作人員進行免疫接種和藥品防止。8.有皮膚破損和疾患的人員不得操作3、4級危險性病原。生物安全保障§（一）建筑構(gòu)造保障——生物安全3級實驗室

1.結(jié)核分枝桿菌屬于生物危害3級的微生物，進行活病原（培養(yǎng)物或感染標本）操作時，應(yīng)使用本級別實驗室。

2.實驗室建筑設(shè)備規(guī)定：雙層門或有氣幕的出入口；實驗室表面可洗刷、消毒；由上至下的氣流方向；排氣經(jīng)高效濾器；窗戶密閉、工作區(qū)可防一切蚊蟲進入。3.工作制度規(guī)定：非工作人員不得進入；使用實驗室專用工作服、鞋；排水經(jīng)無害化解決；搬出物品規(guī)定要滅菌或密閉包裝；實驗室內(nèi)嚴禁進食飲水。§（二）裝備保障1.生物安全柜

一級生物安全柜：由外向內(nèi)的單向氣流，只保護人體，不能保護實驗材料?？捎糜谔低科僮鳌?/p>

二級生物安全柜：有向內(nèi)氣流和經(jīng)高效濾器的垂直氣流，可保護人體和實驗材料不受污染。用于病原分離、培養(yǎng)。2.高壓滅菌器：運行狀態(tài)良好。3.消毒防護物品等?！欤ㄈ┘夹g(shù)保障1.雙人原則，不允許單人操作1、2類病原。2.入口處應(yīng)有危險警示標記，并標明所操作的微生物的種類。3.培訓考核上崗，掌握有關(guān)技術(shù)操作要領(lǐng)，熟悉規(guī)章制度，適應(yīng)工作環(huán)境。4.完備的管理方法，技術(shù)操作規(guī)范。5.良好的工作行為可減少生物危害風險?！炝嶒炇疑锇踩椒旨?一)根據(jù)所操作的生物因子的危害程度和采用的防護方法，將實驗室生物安全防護水平（biosafetylevel，BSL）分為4級，１級防護水平最低，4級防護水平最高。(二)以BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4表達實驗室的對應(yīng)生物安全防護水平。(三)以ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3、ABSL-4表達動物實驗室的對應(yīng)生物安全防護水平?！炱摺嶒炇夜芾碇贫?一)實驗室管理規(guī)章制度：涉及培訓制度、準入制度、健康監(jiān)測報告制度、個人良好行為制度、意外事故報告制度等。(二)原則操作程序：涉及實驗廢棄物處置原則操作程序、進出實驗室原則程序、菌毒種使用原則操作程序、實驗室消毒原則操作程序、意外事故解決原則操作程序及多個儀器設(shè)備和實驗原則操作程序等。結(jié)核病實驗室安全防護§

各級結(jié)核病細菌學實驗室必須對工作人員予以充足保護，同時控制對環(huán)境造成的污染。在實驗室從事實驗或工作的人員，應(yīng)當理解可能接觸到的各類危險物品的種類和性質(zhì)，明確這些危險物對本身和別人及環(huán)境含有的潛在威脅。應(yīng)嚴格按照實驗室操作規(guī)程做好安全防護?！煲弧嶒炇抑械姆种U菌及分枝桿菌氣溶膠

結(jié)核病實驗室工作人員，在分枝桿菌檢查過程中，會接觸到多個潛在感染源標本和多個危險物，特別是許多操作易產(chǎn)生分枝桿菌氣溶膠。含有結(jié)核分枝桿菌的微滴核（1-5微米）通過呼吸進入人體肺泡，能夠黏附在肺泡內(nèi)生長繁殖。因此，首先要對實驗室中生物危險物產(chǎn)生的途徑和存在的地點有充足的認識，方便明確生物安全防護的環(huán)節(jié)?！?一)分枝桿菌存在的地點

1、多個臨床標本，普通是痰，胃或支氣管灌洗液、腦脊液、尿液等。2、被污染的操作臺、器械、儀器、試劑等。3、收集的結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌菌株等。4、細菌學實驗室的部分區(qū)域。§(二)產(chǎn)生分枝桿菌氣溶膠1、實驗室內(nèi)可疑肺結(jié)核患者痰標本的采集。2、樣本的制備和涂片的火焰固定。3、分離培養(yǎng)或接種培養(yǎng)物。4、用火焰燒灼接種環(huán)。5、使用移液器混合培養(yǎng)物。6、培養(yǎng)管或培養(yǎng)瓶中含有培養(yǎng)物的滴落物。7、溢出的分枝桿菌懸浮液。8、高速混合含有分枝桿菌的液體。9、轉(zhuǎn)移液態(tài)培養(yǎng)物和上清液，或培養(yǎng)液、上清液的傾倒。10、離心過程中離心管的破碎。11、用做原代培養(yǎng)所需的組織勻漿。§二、安全防護(一)嚴格恪守實驗室安全操作規(guī)程，任何時侯都要警惕分枝桿菌氣溶膠的產(chǎn)生。實驗室的技術(shù)人員必須通過生物安全培訓后方可上崗。(二)實驗室應(yīng)嚴格限制非實驗人員進入，減少實驗室內(nèi)外交叉生物污染。完畢實驗工作離開實驗室，要關(guān)好門窗。(三)進入實驗室應(yīng)避免攜帶非必需物品。(四)進入實驗室，工作人員應(yīng)穿著工作服，操作時應(yīng)穿戴防護隔離衣、口罩、帽子和手套，長發(fā)者應(yīng)將頭發(fā)裝束在帽子內(nèi)。(五)實驗過程中絕對嚴禁吸煙、飲食等，不要以手撫頭面部等。(六)實驗前須啟動紫外線燈對實驗室和操作區(qū)域進行照射消毒1小時以上；實驗結(jié)束后，立刻啟動紫外燈進行照射消毒2小時以上。(七)任何實驗的開始和結(jié)束后，操作人員要用70%酒精浸泡雙手或認真擦后，用清潔劑或清水洗凈。(八)每次實驗結(jié)束后，必須清理好實驗臺，并用70%酒精液或3-5%石炭酸擦洗實驗臺面。(九)實驗室中的生物危險品要根據(jù)檢查項目和性質(zhì)不同，局限在對應(yīng)的實驗區(qū)間，不得隨意將其帶到其它的實驗室。(十)實驗室內(nèi)任何微生物的樣本，廢棄物都必須經(jīng)高溫高壓滅菌后，方可按普通垃圾解決?！烊?、安全保障

(一)首先各級實驗室應(yīng)按等級規(guī)定完善實驗設(shè)施，如簡易安全柜內(nèi)的抽氣排風功效、紫外燈消毒功效，生物安全柜維護與除菌濾膜定時更換等。

(二)實驗室采集病人痰標本時應(yīng)在戶外進行，避免因病人咳漱造成室內(nèi)氣溶膠污染。

(三)普通實驗室應(yīng)注意氣流方向，實驗過程中盡量避免強氣流變化而產(chǎn)憤怒溶膠（如﹕涂片、染色過程中）。

(四)細菌的分離培養(yǎng)、菌種開封、轉(zhuǎn)種、研磨、稀釋等操作，各級實驗室均應(yīng)在簡易安全柜或生物安全柜中進行。

(五)使用接種環(huán)進行操作時，接種環(huán)應(yīng)在工作燈的內(nèi)焰中燃燒，以避免菌液或菌塊飛濺。

(六)稀釋菌液時，吸管、針管要緩慢插入試管或燒瓶底部，小心操作避免產(chǎn)憤怒泡或氣溶膠。(七)使用注射器加樣時，用過的針頭切勿再重新入套或拔開注射器與針頭，應(yīng)直接放入銳器收集器，以免劃破皮膚造成接種感染。(八)菌株庫要設(shè)專人管理，并按照國家微生物菌毒種管理方法執(zhí)行。(九)進行毒菌操作過程中，不要穿戴巳經(jīng)污染的防護性手套觸摸門柄、儀器或毒菌區(qū)以外區(qū)域，避免由于粗心擴大污染范疇。(十)實驗結(jié)束后，操作過程中全部可能與生物危險物接觸或被污染的實驗器械和物品，能夠高壓消毒的必須高壓消毒，不能進行高壓消毒的設(shè)備、儀器，應(yīng)使用有效的消毒劑擦洗后再以紫外燈近距離長時間消毒。(十一)實驗中發(fā)生意外污染狀況，應(yīng)立刻告知主管人員并做好解決污染物和對應(yīng)區(qū)域的準備，不得私自采用其它嚴禁的辦法進行消毒解決。(十二)實驗室主任應(yīng)制訂規(guī)章和程序，只有告知潛在風險并符合進入實驗室特殊規(guī)定(如，通過免疫接種)的人，才干進入實驗室。(十三)操作致病性微生物時，實驗室入口處應(yīng)貼有生物危險標志，并顯示下列信息：有關(guān)病原、生物安全級別、免疫接種規(guī)定、研究人員姓名、電話號碼、在實驗室中必須佩帶的個人防護設(shè)施、出實驗室所規(guī)定的程序。(十四)實驗室主任為實驗室人員特別制訂的原則操作程序或生物安全手冊中，應(yīng)涉及生物安全程序。對于有特殊風險的人員，規(guī)定閱讀并在工作及程序上遵照執(zhí)行。(十五)實驗室主任確保明驗及其輔助人員接受適宜的培訓，涉及和工作有關(guān)的可能存在的風險、避免暴露的必要方法和暴露評定程序。（十六）實驗室所用任何個人防護裝備應(yīng)符合國家有關(guān)原則的規(guī)定。實驗室應(yīng)確保含有足夠的有適宜防護水平的清潔防護服供使用。還應(yīng)穿戴其它的個人防護裝備，如手套、防護鏡、面具、頭部面部保護罩等。(十七)解決樣本的過程中易產(chǎn)生高危害氣溶膠時，規(guī)定同時使用適宜的個人防護裝備、生物安全柜和/或其它物理防護設(shè)備。如可產(chǎn)生含生物因子的氣溶膠，應(yīng)在適宜的生物安全柜中操作。§

(十八)實驗用鞋應(yīng)舒適，鞋底防滑。應(yīng)用皮制或合成材料的不滲液體的鞋類。在從事可能出現(xiàn)漏出的工作時可穿一次性防水鞋套。在實驗室的特殊區(qū)域（例如有防靜電規(guī)定的區(qū)域）或BSL-3和BSL-4實驗室規(guī)定使用專用鞋（例如一次性或橡膠靴子）。結(jié)核病實驗室廢物解決§一、實驗室廢棄物解決的目的：

(一)將操作、收集、運輸、解決及處置廢棄物的危險減至最??；

(二)將實驗室廢棄物對環(huán)境的有害作用減至最小?！於嶒炇椅畚锝鉀Q及消毒

(一)實驗室含有生物危險物的臨床標本及被污染的一次性用品，實驗完畢后，應(yīng)在操作臺或?qū)嶒瀰^(qū)域內(nèi)以紫外燈近距離照射消毒2小時以上，再經(jīng)高壓消毒后方可丟棄或焚燒。

(二)可重復使用的實驗用品及器材，完畢實驗后，應(yīng)在操作臺或?qū)嶒瀰^(qū)域內(nèi)經(jīng)紫外燈近距離照射消毒2小時以上后，再交有關(guān)人員進行高壓消毒和煮沸洗刷。(三)實驗用的試管、吸管、注射器，須裝在加蓋不漏的容器內(nèi)，經(jīng)高壓滅菌后取出。

(四)培養(yǎng)物或?qū)嶒炇依趤G棄前必須經(jīng)高壓消毒和紫外燈近距離長時間照射解決。不允許積存垃圾和實驗室廢棄物。已裝滿的容器應(yīng)定時運走。在去污染或最后處置之前，應(yīng)寄存在指定的安全地方，普通在實驗室區(qū)內(nèi)。

(五)實驗室廢棄物應(yīng)置于適宜的密封且防漏容器中安全運出實驗室。有害氣體、氣溶膠、污水、廢液應(yīng)經(jīng)適宜的無害化解決后排放，應(yīng)符合國家有關(guān)的規(guī)定。(六)實驗過程中，如標本或含標本的前消化解決液被打翻污染了操作臺或地面，應(yīng)以吸滿70%酒精的衛(wèi)生紙覆蓋污染區(qū)，15分鐘后來衛(wèi)生紙方可移去。(七)實驗室內(nèi)未經(jīng)消毒的污水，嚴禁直接排入公共排水系統(tǒng)，更不允許混入居民生活垃圾?！烊?、意外事故的解決

(一)如果發(fā)生意外，必須立刻告知實驗室主管人員，并在有關(guān)人員的指導監(jiān)督下對出事現(xiàn)場進行解決，絕對嚴禁未經(jīng)報告而私自對出事現(xiàn)場予以非規(guī)范的解決。(二)實驗過程中，如污染物濺落到身體表面，或有割傷、刺傷、燒傷、燙傷等狀況發(fā)生，應(yīng)立刻停止實驗工作進行緊急解決，更換被污染的實驗服，皮膚表面用消毒液清洗，傷口以碘酒或酒精消毒，眼睛用無菌生理鹽水沖洗。(三)如果發(fā)生菌液溢出，含菌種的培養(yǎng)管破碎等，造成中、小面積污染，可用比污染面積大25%以上的紗布覆蓋污染區(qū)域，邊沿用脫脂棉圍住，向紗布傾倒5%苯酚溶液或70%的酒精，浸泡2小時以上（其間適量加溶液避免干燥），再經(jīng)紫外燈近距離（1米內(nèi)）照射2小時以上；被污染的器械、容器等立刻浸泡于70%酒精中2小時以上，實驗完畢后再進行高壓消毒解決。(四)如果發(fā)憤怒溶膠污染或大面積污染，應(yīng)立刻停止實驗并關(guān)閉實驗室，對污染區(qū)域進行紫外燈照射消毒過夜；第二天對污染區(qū)進行24小時封閉空氣熏蒸消毒（乙醛消毒法﹕5ml乙醛＋2g高錳酸鉀/m3空間）?！?五)絕對嚴禁使用的事故解決辦法﹕1.任何有可能造成污染面積擴大的去污辦法，如使用70%乙醇或甲酚皂液擦洗被污染的區(qū)域。2.直接用火焰對未經(jīng)任何解決的污染地面、操作臺、器械等進行燒灼解決。3.使用消毒效果未經(jīng)證明的消毒劑進行消毒。4.使用低濃度的消毒劑和紫外燈進行短時間、長距離的照射。結(jié)核病職業(yè)暴露§一、衛(wèi)生服務(wù)人員與職業(yè)暴露

衛(wèi)生服務(wù)人員(health-careperson,HCP)是指在衛(wèi)生服務(wù)部門、實驗室以及公共安全環(huán)境下其活動與結(jié)核病病人或其痰液/體液接觸的有關(guān)人員。