結(jié)核分枝桿菌與實(shí)驗(yàn)室生物安全

結(jié)核分枝桿菌與實(shí)驗(yàn)室生物安全廣東省結(jié)核病防治研究所鐘球

錢(qián)明附件廣東省結(jié)核病防治研究所鐘球

錢(qián)明§結(jié)核病的定義§結(jié)核病的疫情§結(jié)核病病原學(xué)§結(jié)核病的流行§結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室生物安全§結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)§結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室廢物解決§結(jié)核病職業(yè)暴露§結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（偶然可由牛型或非洲型分枝桿菌）引發(fā)的一種細(xì)菌性疾病。結(jié)核病可累及全身各個(gè)器官，但以肺結(jié)核最為常見(jiàn)。該病含有傳染性強(qiáng)，散播面廣，不分地區(qū)均可發(fā)生。結(jié)核病可由呼吸道、消化道、皮膚等途徑感染，但其重要傳輸途徑是以空氣為傳輸因子的呼吸道傳染，而排菌的肺結(jié)核病人傳染性更大，是傳輸感染的重要傳染源。結(jié)核病的疫情n感染人數(shù)

約為20億n新發(fā)活動(dòng)性肺結(jié)核病人890萬(wàn)(141/10萬(wàn))n新發(fā)涂陽(yáng)肺結(jié)核病人

390萬(wàn)n結(jié)核病發(fā)病率每年增加1%n預(yù)計(jì)患病人數(shù)為1550萬(wàn)例（患病率為246/10萬(wàn)）其中涉及HIV+TB38萬(wàn)例n死于結(jié)核病為180萬(wàn)例，結(jié)核病死亡率為29/10萬(wàn),其中涉及HIV+TB死亡27萬(wàn)例結(jié)核病病原學(xué)§結(jié)核分枝桿菌是引發(fā)人類結(jié)核病的重要病原體。1882年由德國(guó)醫(yī)生Koch發(fā)現(xiàn)。在微生物分類中，結(jié)核分枝桿菌屬于厚壁門(mén)、裂殖菌綱、放線菌目、分枝桿菌科、分枝桿菌屬。分枝桿菌復(fù)合群共涉及人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型結(jié)核分枝桿菌是人類重要的致病菌。結(jié)核分枝桿菌的形態(tài)§

結(jié)核分枝桿菌菌體含有多形態(tài)特性，除正常典型形態(tài)外，受不良生長(zhǎng)條件的影響。如物理因素、化學(xué)因素，特別是藥品因素，而呈現(xiàn)異常變化，其多個(gè)形態(tài)可歸納為桿菌型（基本形態(tài)）、濾過(guò)型、顆粒型和球菌型（L型）4種類型?！?/p>

1.桿菌型（基本形態(tài)）結(jié)核分枝桿菌正常典型的形態(tài)是直或稍彎曲、兩端鈍圓的桿菌。菌體

長(zhǎng)1～4μm，寬0.3～0.6μm，無(wú)芽胞、無(wú)莢膜、無(wú)鞭毛，生長(zhǎng)發(fā)育期間有分枝生長(zhǎng)傾向?！?/p>

2.濾過(guò)型早在19，F(xiàn)outes在檢查細(xì)菌濾器濾過(guò)的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液時(shí)，在電子顯微鏡下觀察到球狀微粒體。1991年，Khomeko在豚鼠損壞性肺結(jié)核模型中證明了濾過(guò)型的存在。此球狀微粒體可通過(guò)細(xì)菌濾膜，稱為濾過(guò)型?！?/p>

3.顆粒型19莫赫(Much)在結(jié)核性冷性膿腫、漿液性滲出液、干酪性淋巴結(jié)等膿液中觀察到革蘭染色陽(yáng)性顆粒，稱為莫赫顆粒。莫赫顆粒的重要意義在于這些顆粒型體仍有生機(jī)與活力，在適宜的營(yíng)養(yǎng)條件下，可重新獲得增殖，發(fā)育生長(zhǎng)出典型結(jié)核分枝桿菌?！?/p>

4.球菌型（L型）結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)外受物理、化學(xué)、免疫等因素的影響，維持菌體固有形態(tài)的細(xì)胞壁缺損或喪失，產(chǎn)生細(xì)胞壁缺點(diǎn)型。細(xì)胞壁缺點(diǎn)型細(xì)菌是1935年Kilienberger在英國(guó)Lister醫(yī)學(xué)研究院研究念珠狀鏈桿菌時(shí)首先發(fā)現(xiàn)的，故以Lister醫(yī)學(xué)研究院的第一種字母，將細(xì)胞壁缺點(diǎn)型細(xì)菌命名為L(zhǎng)型菌。結(jié)核分枝桿菌的染色特性§

結(jié)核分枝桿菌本身無(wú)顏色，觀察結(jié)核分枝桿菌必須染色后進(jìn)行。結(jié)核分枝桿菌革蘭染色陽(yáng)性，但革蘭染色不易著色。經(jīng)苯胺染料著色后，能抵抗酸和酸乙醇脫色，此種特性稱為抗酸性。Z-N染色法為最慣用的一種抗酸染色辦法，經(jīng)此法染色后，分枝桿菌，涉及結(jié)核分枝桿菌呈紅色，而標(biāo)本中其它細(xì)菌、細(xì)胞、雜質(zhì)等均呈藍(lán)色結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)特性§

結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，繁殖一代在人工培養(yǎng)基內(nèi)約需要15～20小時(shí)，在靜脈感染未經(jīng)免疫小鼠肺中約需要15小時(shí)，在巨噬細(xì)胞內(nèi)約需要15～20小時(shí)，在家兔角膜中約需要20～22小時(shí)。結(jié)核分枝桿菌的抵抗力§

結(jié)核分枝桿菌因細(xì)胞壁含大量類脂質(zhì)，特別是臘樣物質(zhì)，含有疏水性，對(duì)物理和化學(xué)因素的作用均較普通致病菌抵抗力強(qiáng)?！?/p>

1.物理因素影響結(jié)核分枝桿菌生存能力較強(qiáng)，在溫室和陰暗處干燥痰內(nèi)能夠存活6～8個(gè)月，粘附在飛揚(yáng)的空氣塵埃中可保持傳染性8～10天。結(jié)核分枝桿菌普通較耐低溫，在-6～8℃能存活4～5年?！?/p>

干熱對(duì)結(jié)核分枝桿菌殺傷力弱，痰內(nèi)結(jié)核分枝桿菌在100℃下需要4～5小時(shí)被殺滅。濕熱對(duì)結(jié)核分枝桿菌殺傷力強(qiáng)，在60℃30分鐘、70℃10分鐘、80℃5分鐘和90℃1分鐘可將其殺死，因此煮沸與高壓蒸氣消毒是最有效的辦法之一?！?/p>

結(jié)核分枝桿菌對(duì)光線和射線敏感，在太陽(yáng)光直射下2～7小時(shí)死亡。病人用過(guò)的物品在強(qiáng)陽(yáng)光下直曬半日，基本可達(dá)成消毒的目的。10～1mg/ml菌懸液，液層厚度3mm，用10W紫外線燈在距離確0.5m處持續(xù)照射3分鐘，在距離1m處持續(xù)照射10分鐘，經(jīng)培養(yǎng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。但紫外線穿透力弱，難以透入固體物質(zhì)內(nèi)部和液體深層，因此紫外線普通用于空氣和物體表面消毒?！?/p>

2.化學(xué)因素的影響化學(xué)消毒劑的種類諸多，其殺菌的機(jī)制因化學(xué)藥品種類不同而異。乙醇使菌細(xì)胞蛋白質(zhì)變性、凝固而產(chǎn)生殺菌作用。結(jié)核分枝桿菌直接接觸70%～75%乙醇5～30分鐘可被殺死，因此可用于皮膚消毒。但由于乙醇能凝固蛋白，使痰表面形成一層把菌體包裹起來(lái)的膜，短時(shí)間內(nèi)不能殺死細(xì)菌，故乙醇不能用于痰的消毒?！?/p>

苯酚重要通過(guò)破壞菌細(xì)胞膜而致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物漏出，使菌體蛋白質(zhì)變性、凝固，克制菌體脫氫酶和氧化酶等酶系統(tǒng)殺死結(jié)核分枝桿菌。2%苯酚

5分鐘、5%苯酚1分鐘能殺死結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物。5%苯酚與痰液等量混合，24小時(shí)才干殺死結(jié)核分枝桿菌。煤酚皂溶液作用機(jī)制與苯酚相似，0.5%煤酚皂60分鐘，1%煤酚皂45分鐘，2%煤酚皂10分鐘，5%煤酚皂5分鐘，即能殺死結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物。5%～10%煤酚皂等量混入痰標(biāo)本，12小時(shí)可殺滅結(jié)核分枝桿菌?！?/p>

甲醛使菌細(xì)胞蛋白質(zhì)變性凝固，喪失代謝功效致細(xì)菌死亡。1%甲醛解決結(jié)核分枝桿菌5分鐘，可使細(xì)菌死亡。5%甲醛和痰液等量混合，解決12小時(shí)以上才干達(dá)成殺菌作用?！?/p>

“84”消毒液是以氯為重要成分的消毒劑。氯是一種氧化劑，能使菌體的酶失活，還能與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，使菌體蛋白氯化，代謝功效障礙，細(xì)菌死亡。0.5%“84”消毒液15分鐘可殺死結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物，但對(duì)在蛋白質(zhì)混合液中的結(jié)核分枝桿菌幾乎無(wú)消毒效果?！?/p>

結(jié)核分枝桿菌對(duì)酸、堿抵抗力強(qiáng)，在4%NaOH，3%HCL和6%H2SO4中30分鐘仍能存活。臨床應(yīng)用酸或堿加入病人標(biāo)本，消化蛋白質(zhì)及殺滅雜菌，以此分離出結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌對(duì)染料，如1∶13000孔雀綠和1∶75000甲紫有抵抗力，普通在培養(yǎng)基內(nèi)加入一定量的孔雀綠或甲紫克制其它雜菌生長(zhǎng)。對(duì)普通細(xì)菌有較強(qiáng)殺菌作用的新潔爾滅，對(duì)結(jié)核分枝桿菌幾乎無(wú)消毒作用。結(jié)核分枝桿菌的致病性§

結(jié)核分枝桿菌不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素，也無(wú)侵襲性酶類。普通認(rèn)為其致病作用可能與菌體表面構(gòu)造及某些菌體成分，如脂質(zhì)、某些菌體蛋白、多糖等多個(gè)物質(zhì)有關(guān)，重要是有毒結(jié)核分枝桿菌菌株在易感機(jī)體內(nèi)頑強(qiáng)增殖和與機(jī)體互相作用的成果。結(jié)核病流行§

結(jié)核病在人群中流行的三個(gè)生物學(xué)環(huán)節(jié)是：

1、傳染源，

2、感染傳輸途徑；

3、易動(dòng)人群。影響結(jié)核分枝桿菌傳輸?shù)闹匾蛩亍?/p>

1、排菌量痰中結(jié)核分枝桿菌越多，傳輸?shù)奈ｋU(xiǎn)性越大。病人出現(xiàn)痰涂片陽(yáng)性若1ml痰液中含菌量為

1000－

10000，其痰涂片陽(yáng)性率為40%－50%，痰液中含菌量低時(shí)，痰涂片陽(yáng)性率亦低（表l）。表1

痰涂片與痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌數(shù)§

痰涂片陽(yáng)性（涂陽(yáng)）病人的排菌量大，其親密接觸者的結(jié)核感染率明顯高于痰涂片陰性（涂陰）病人的親密接觸者，英國(guó)報(bào)告涂陰培陰病人的家庭小朋友親密接觸者結(jié)核感染率為17.6%；涂陰培陽(yáng)病人的接觸者結(jié)核感染率為26.8%；涂陽(yáng)培陽(yáng)病人的接觸者結(jié)核感染率高達(dá)65.0%（表2）。表2不同傳染源對(duì)15歲下列親密接觸者的感染率（%）§

2．排出飛沫的大小傳染源排出的飛沫受壓力和粘稠度的影響而大小不一，飛沬核直徑1－10μm者在空氣中漂浮時(shí)間長(zhǎng)，可進(jìn)入人體末梢支氣管內(nèi)；飛沫核直徑較大者，則受地心引力的影響而墜落。§3．

患者病變與癥狀病變廣泛、損害嚴(yán)重的患者，特別是病變急劇進(jìn)展，干酪溶解形成空洞患者的痰中含有大量結(jié)核分枝桿菌，是重要的傳染源?；颊呖人?、噴嚏或大聲說(shuō)話時(shí)都能產(chǎn)生飛沫，有報(bào)道，當(dāng)人咳嗽時(shí)每次排出的飛沫數(shù)約為3500個(gè)，一次噴嚏則可排出飛沫達(dá)100萬(wàn)個(gè)；日常說(shuō)話5分鐘所排出的飛沫數(shù)相稱于一次咳嗽，咳嗽是肺結(jié)核病人產(chǎn)生飛沫的重要方式?！?/p>

表3統(tǒng)計(jì)了病人每晚咳嗽次數(shù)，并觀察其0－14歲家庭接觸者的結(jié)核感染率每晚咳嗽48次以上患者的家庭接觸者感染率為43.9%，而咳嗽12次下列患者的接觸者感染率為27.5%。表3傳染源咳嗽次數(shù)與接觸者感染率§

4．接觸的親密程度周邊人群與傳染源接觸越親密，受感染的機(jī)會(huì)越多，涂片陽(yáng)性病人的親密接觸者感染率明顯高于偶然接觸者（表4）。表4不同接觸程度小朋友感染率§

5．環(huán)境因素與傳染源病人同處在空氣不流通的室內(nèi)的親密接觸者，受結(jié)核感染的可能性增大。第二次世界大戰(zhàn)時(shí)期曾報(bào)道潛艇內(nèi)官兵大批感染和發(fā)病，也有民航客機(jī)上結(jié)核病傳染源使同機(jī)乘客受感染的報(bào)道。傳輸途徑§

呼吸道感染（respiratortractinfection）是肺結(jié)核的重要傳染途徑（routesofinfection），飛沬傳染（dropletinfection）為最常見(jiàn)的方式。傳染源重要是排菌的肺結(jié)核患者（特別是痰涂片陽(yáng)性未經(jīng)治療者）。飛沬核（dropletnuclei）＜10μm時(shí)可被吸人呼吸道，健康人可因吸入患者咳嗽、打噴嚏時(shí)噴出的帶菌飛沫而受感染。易感者§

結(jié)核分枝桿菌進(jìn)人人體，引發(fā)易感者（susceptible）機(jī)體的復(fù)雜反映。§

1．人體的防御反映人體的防御反映（defensereaction）有物理、化學(xué)和生物學(xué)反映。進(jìn)人呼吸道的結(jié)核分枝桿菌飛泳核可被鼻、咽、喉、氣管和支氣管的粘液吸著、被酶殺滅并隨纖毛運(yùn)動(dòng)經(jīng)咳嗽、噴嚏和咳痰等動(dòng)作排出體外，或被吞噬細(xì)胞吞噬殺滅。當(dāng)防御功效（defensefunction）低下時(shí)，結(jié)核分枝桿菌進(jìn)人下呼吸道，引發(fā)機(jī)體反映。§

2．人體的易感性未受結(jié)核感染的人是結(jié)核病的易動(dòng)人群（susceptiblepopulation）一旦受到結(jié)核分枝桿菌傳輸，含有普遍的易感性（susceptibility），進(jìn)入人體的結(jié)核分枝桿菌可在人體內(nèi)繁殖，結(jié)核分枝桿菌的繁殖周期約為10－20小時(shí)，一條結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)繁殖1周可達(dá)128條菌，繁殖20天將超出100萬(wàn)條菌（表5），體內(nèi)的大量結(jié)核分枝桿菌將使人體患病，引發(fā)機(jī)體的免疫與變態(tài)反映。表5一條結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的繁殖狀況§

3.免疫與變態(tài)反映人體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的自然免疫力（naturalimmunity）（先天免疫力）是非特異性的。接種卡介苗（bacillicalmette－guérin，BCG）或受結(jié)核分枝桿菌感染后所產(chǎn)生的獲得免疫力（acquiredimmunity）（后天性免疫力）則含有特異性，能將入侵的結(jié)核分枝桿菌殺死或嚴(yán)密包圍，制止其擴(kuò)散，使病灶愈合。結(jié)核病的免疫重要是細(xì)胞免疫，體現(xiàn)為淋巴細(xì)胞的致敏與吞噬細(xì)胞功效的增強(qiáng)。化療時(shí)代的結(jié)核病流行§化學(xué)療法的流行病學(xué)效果

傳染性肺結(jié)核病人接受抗結(jié)核藥品化學(xué)治療（chemotherapy）后，肺部病灶中的結(jié)核分枝桿菌被殺滅，傳染性減小以至消失，傳染源的流行病學(xué)作用隨之消失。實(shí)驗(yàn)報(bào)告敏感菌在未治療時(shí)相對(duì)傳染性100%，在治療中只有25%，耐藥病人未治療時(shí)相對(duì)傳染性為100%。在治療時(shí)則只有27.3%。結(jié)核分枝桿菌檢查§一、結(jié)核分枝桿菌檢查的意義結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引發(fā)的可致全身器官或組織發(fā)生病變，而以肺部病變?yōu)槌Ｒ?jiàn)的傳染性疾病。因此，痰結(jié)核菌的檢查是結(jié)核病流行病學(xué)、結(jié)核病診療、擬定化療方案以及評(píng)價(jià)治療效果的重要手段，在當(dāng)代結(jié)核病控制工作中起著不可或缺的重要作用?！旖Y(jié)核分枝桿菌檢查:

直接涂片;結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng)和結(jié)核分枝桿菌的藥品敏感性測(cè)定結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室生物安全§一、生物安全的概念

實(shí)驗(yàn)室生物安全，是指在以微生物為對(duì)象的實(shí)驗(yàn)工作中，防止生物危害，保障操作對(duì)象、操作者和環(huán)境的安全。合理的實(shí)驗(yàn)室建筑構(gòu)造和布局、生物安全柜的對(duì)的使用，能夠使操作對(duì)象和工作人員得到有效的保護(hù)，排出的空氣經(jīng)高效濾器濾過(guò)也能夠保護(hù)鄰近人員及環(huán)境的安全。在沒(méi)有確保安全的實(shí)驗(yàn)室條件下，解決傳染性強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，防護(hù)服、防止免疫和藥品防止是實(shí)驗(yàn)室生物安全的必要確保?！於?、術(shù)語(yǔ)與定義(一)生物因子（biologicalagents）一切微生物和生物活性物質(zhì)。(二)病原體（pathogens）可使人、動(dòng)物或植物致病的生物因子（涉及微生物、寄生蟲(chóng)等）。(三)危害廢棄物（hazardouswaste）有潛在生物危險(xiǎn)、可燃、易燃、腐蝕、有毒、放射和起破壞作用的對(duì)人、環(huán)境有害的一切廢棄物。(四)危險(xiǎn)（risk）傷害發(fā)生的概率及其嚴(yán)重性的綜合。(五)氣溶膠（aerosols）懸浮于氣體介質(zhì)中的固態(tài)或液態(tài)微小粒子（粒徑普通為0.001-100μm）形成的相對(duì)穩(wěn)定的分散體系。(六)高效空氣過(guò)濾器[highefficiencyparticulateairfilter（HEPA）]

普通以濾除≥0.3μm微粒為目的，濾除效率符合有關(guān)規(guī)定的過(guò)濾器。(七)安全罩（safetyhood）置于實(shí)驗(yàn)室工作臺(tái)或儀器設(shè)備上的負(fù)壓排風(fēng)罩，以減少實(shí)驗(yàn)室工作者的暴露危險(xiǎn)，排風(fēng)經(jīng)高效過(guò)濾。(八)緩沖間（bufferroom）設(shè)立在清潔區(qū)、半污染區(qū)和污染區(qū)相臨兩區(qū)之間的緩沖密閉室，含有通風(fēng)系統(tǒng)，其兩個(gè)門(mén)含有互鎖功效，且不能同時(shí)處在啟動(dòng)狀態(tài)。(九)實(shí)驗(yàn)室分區(qū)（laboratoryarea）按照生物因子污染概率的大小，實(shí)驗(yàn)室可進(jìn)行合理的分區(qū)。(十)氣鎖（airlock）氣壓可調(diào)節(jié)的氣密室，用于連接氣壓不同的兩個(gè)相鄰區(qū)域，其兩個(gè)門(mén)含有互鎖功效，不能同時(shí)處在啟動(dòng)狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)室中用作特殊通道。(十一)定向氣流（directionalairflow）在氣壓低于外環(huán)境大氣壓的實(shí)驗(yàn)室中，從污染概率小且相對(duì)壓力高處向污染概率高且相對(duì)壓力低處受控制流動(dòng)的氣流。(十二)一級(jí)屏障（primarybarrier）是操作者和被操作對(duì)象之間的隔離，也稱一級(jí)隔離。如生物安全柜、個(gè)體防護(hù)裝備等。(十三)二級(jí)屏障（secondarybarrier）是生物安全實(shí)驗(yàn)室和外部環(huán)境的隔離，也稱二級(jí)隔離。(十四)生物安全實(shí)驗(yàn)室（biosafetylaboratory）通過(guò)防護(hù)屏障和配套管理方法，達(dá)成生物安全規(guī)定的生物實(shí)驗(yàn)室和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室?！烊⑽⑸镂：Τ潭确旨?jí)

微生物按其與否致病、致病力強(qiáng)弱、危害人體的嚴(yán)重性、傳染性的大小、臨近人群的抵抗力、有無(wú)免疫制劑和特效治療藥品等綜合評(píng)價(jià)，可分為四個(gè)不同的危害等級(jí)。結(jié)核分枝桿菌屬于3級(jí)危險(xiǎn)?！?/p>

3級(jí)危險(xiǎn)（對(duì)個(gè)體含有極大危害，對(duì)群體含有較大的危害性）：指有特殊危險(xiǎn)的致病菌。感染后癥狀較重，并可能危及生命，或者缺少有效的防止辦法、發(fā)病后不易治療的微生物。實(shí)驗(yàn)室感染的因素及防止§（一）技術(shù)操作可能造成的感染及其防止方法。

1.接種：應(yīng)使用無(wú)彈力的鉑絲接種環(huán)，結(jié)核菌接種后接種環(huán)火焰滅菌易崩散，酒精燈燒灼時(shí)要特別注意。

2.混勻：吸管吸吹菌液時(shí)不要產(chǎn)憤怒泡，應(yīng)沿容器壁排出。

3.研磨：最佳使用組織研磨器，乳缽易產(chǎn)憤怒溶膠。4.移液：吸管上端的棉花松緊要適度，吸液時(shí)要從管底吸取，吹出時(shí)要輕緩，不要全部吹凈，以免產(chǎn)憤怒泡，形成氣溶膠。5.開(kāi)封：要避免壓力和氣流的急劇變化。6.離心：離心管套底墊要完好，使用匹配的管、套、離心頭，加蓋。7.注射：做好個(gè)人防護(hù)，對(duì)的使用注射器。8.搬運(yùn)：室內(nèi)移動(dòng)要避免滑落，移出室外要有堅(jiān)實(shí)密閉的外包裝?！欤ǘ┥锇踩闹贫确椒?/p>

1.無(wú)生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行病原的實(shí)驗(yàn)操作，要在有緩沖間的無(wú)菌室內(nèi)操作，并使用生物安全柜。2.工作前后要用紫外燈消毒。3.操作臺(tái)面要鋪濕消毒巾。4.按操作病原的危險(xiǎn)等級(jí)和感染途徑做好個(gè)人防護(hù)。5.操作臺(tái)附近要常備消毒液，污染物要放入密閉容器及時(shí)滅菌。6.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)要嚴(yán)防蟲(chóng)、鼠進(jìn)入。7.根據(jù)需要對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員進(jìn)行免疫接種和藥品防止。8.有皮膚破損和疾患的人員不得操作3、4級(jí)危險(xiǎn)性病原。生物安全保障§（一）建筑構(gòu)造保障——生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室

1.結(jié)核分枝桿菌屬于生物危害3級(jí)的微生物，進(jìn)行活病原（培養(yǎng)物或感染標(biāo)本）操作時(shí)，應(yīng)使用本級(jí)別實(shí)驗(yàn)室。

2.實(shí)驗(yàn)室建筑設(shè)備規(guī)定：雙層門(mén)或有氣幕的出入口；實(shí)驗(yàn)室表面可洗刷、消毒；由上至下的氣流方向；排氣經(jīng)高效濾器；窗戶密閉、工作區(qū)可防一切蚊蟲(chóng)進(jìn)入。3.工作制度規(guī)定：非工作人員不得進(jìn)入；使用實(shí)驗(yàn)室專用工作服、鞋；排水經(jīng)無(wú)害化解決；搬出物品規(guī)定要滅菌或密閉包裝；實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁進(jìn)食飲水。§（二）裝備保障1.生物安全柜

一級(jí)生物安全柜：由外向內(nèi)的單向氣流，只保護(hù)人體，不能保護(hù)實(shí)驗(yàn)材料。可用于痰涂片操作。

二級(jí)生物安全柜：有向內(nèi)氣流和經(jīng)高效濾器的垂直氣流，可保護(hù)人體和實(shí)驗(yàn)材料不受污染。用于病原分離、培養(yǎng)。2.高壓滅菌器：運(yùn)行狀態(tài)良好。3.消毒防護(hù)物品等?！欤ㄈ┘夹g(shù)保障1.雙人原則，不允許單人操作1、2類病原。2.入口處應(yīng)有危險(xiǎn)警示標(biāo)記，并標(biāo)明所操作的微生物的種類。3.培訓(xùn)考核上崗，掌握有關(guān)技術(shù)操作要領(lǐng)，熟悉規(guī)章制度，適應(yīng)工作環(huán)境。4.完備的管理方法，技術(shù)操作規(guī)范。5.良好的工作行為可減少生物危害風(fēng)險(xiǎn)?！炝?、實(shí)驗(yàn)室生物安全水平分級(jí)(一)根據(jù)所操作的生物因子的危害程度和采用的防護(hù)方法，將實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)水平（biosafetylevel，BSL）分為4級(jí)，１級(jí)防護(hù)水平最低，4級(jí)防護(hù)水平最高。(二)以BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4表達(dá)實(shí)驗(yàn)室的對(duì)應(yīng)生物安全防護(hù)水平。(三)以ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3、ABSL-4表達(dá)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的對(duì)應(yīng)生物安全防護(hù)水平?！炱?、實(shí)驗(yàn)室管理制度(一)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)章制度：涉及培訓(xùn)制度、準(zhǔn)入制度、健康監(jiān)測(cè)報(bào)告制度、個(gè)人良好行為制度、意外事故報(bào)告制度等。(二)原則操作程序：涉及實(shí)驗(yàn)廢棄物處置原則操作程序、進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室原則程序、菌毒種使用原則操作程序、實(shí)驗(yàn)室消毒原則操作程序、意外事故解決原則操作程序及多個(gè)儀器設(shè)備和實(shí)驗(yàn)原則操作程序等。結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)§

各級(jí)結(jié)核病細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室必須對(duì)工作人員予以充足保護(hù)，同時(shí)控制對(duì)環(huán)境造成的污染。在實(shí)驗(yàn)室從事實(shí)驗(yàn)或工作的人員，應(yīng)當(dāng)理解可能接觸到的各類危險(xiǎn)物品的種類和性質(zhì)，明確這些危險(xiǎn)物對(duì)本身和別人及環(huán)境含有的潛在威脅。應(yīng)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程做好安全防護(hù)?！煲弧?shí)驗(yàn)室中的分枝桿菌及分枝桿菌氣溶膠

結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作人員，在分枝桿菌檢查過(guò)程中，會(huì)接觸到多個(gè)潛在感染源標(biāo)本和多個(gè)危險(xiǎn)物，特別是許多操作易產(chǎn)生分枝桿菌氣溶膠。含有結(jié)核分枝桿菌的微滴核（1-5微米）通過(guò)呼吸進(jìn)入人體肺泡，能夠黏附在肺泡內(nèi)生長(zhǎng)繁殖。因此，首先要對(duì)實(shí)驗(yàn)室中生物危險(xiǎn)物產(chǎn)生的途徑和存在的地點(diǎn)有充足的認(rèn)識(shí)，方便明確生物安全防護(hù)的環(huán)節(jié)。§(一)分枝桿菌存在的地點(diǎn)

1、多個(gè)臨床標(biāo)本，普通是痰，胃或支氣管灌洗液、腦脊液、尿液等。2、被污染的操作臺(tái)、器械、儀器、試劑等。3、收集的結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌菌株等。4、細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室的部分區(qū)域。§(二)產(chǎn)生分枝桿菌氣溶膠1、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)可疑肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的采集。2、樣本的制備和涂片的火焰固定。3、分離培養(yǎng)或接種培養(yǎng)物。4、用火焰燒灼接種環(huán)。5、使用移液器混合培養(yǎng)物。6、培養(yǎng)管或培養(yǎng)瓶中含有培養(yǎng)物的滴落物。7、溢出的分枝桿菌懸浮液。8、高速混合含有分枝桿菌的液體。9、轉(zhuǎn)移液態(tài)培養(yǎng)物和上清液，或培養(yǎng)液、上清液的傾倒。10、離心過(guò)程中離心管的破碎。11、用做原代培養(yǎng)所需的組織勻漿?！於?、安全防護(hù)(一)嚴(yán)格恪守實(shí)驗(yàn)室安全操作規(guī)程，任何時(shí)侯都要警惕分枝桿菌氣溶膠的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必須通過(guò)生物安全培訓(xùn)后方可上崗。(二)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格限制非實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入，減少實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外交叉生物污染。完畢實(shí)驗(yàn)工作離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室，要關(guān)好門(mén)窗。(三)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室應(yīng)避免攜帶非必需物品。(四)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，工作人員應(yīng)穿著工作服，操作時(shí)應(yīng)穿戴防護(hù)隔離衣、口罩、帽子和手套，長(zhǎng)發(fā)者應(yīng)將頭發(fā)裝束在帽子內(nèi)。(五)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中絕對(duì)嚴(yán)禁吸煙、飲食等，不要以手撫頭面部等。(六)實(shí)驗(yàn)前須啟動(dòng)紫外線燈對(duì)實(shí)驗(yàn)室和操作區(qū)域進(jìn)行照射消毒1小時(shí)以上；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立刻啟動(dòng)紫外燈進(jìn)行照射消毒2小時(shí)以上。(七)任何實(shí)驗(yàn)的開(kāi)始和結(jié)束后，操作人員要用70%酒精浸泡雙手或認(rèn)真擦后，用清潔劑或清水洗凈。(八)每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，必須清理好實(shí)驗(yàn)臺(tái)，并用70%酒精液或3-5%石炭酸擦洗實(shí)驗(yàn)臺(tái)面。(九)實(shí)驗(yàn)室中的生物危險(xiǎn)品要根據(jù)檢查項(xiàng)目和性質(zhì)不同，局限在對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)區(qū)間，不得隨意將其帶到其它的實(shí)驗(yàn)室。(十)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)任何微生物的樣本，廢棄物都必須經(jīng)高溫高壓滅菌后，方可按普通垃圾解決?！烊?、安全保障

(一)首先各級(jí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按等級(jí)規(guī)定完善實(shí)驗(yàn)設(shè)施，如簡(jiǎn)易安全柜內(nèi)的抽氣排風(fēng)功效、紫外燈消毒功效，生物安全柜維護(hù)與除菌濾膜定時(shí)更換等。

(二)實(shí)驗(yàn)室采集病人痰標(biāo)本時(shí)應(yīng)在戶外進(jìn)行，避免因病人咳漱造成室內(nèi)氣溶膠污染。

(三)普通實(shí)驗(yàn)室應(yīng)注意氣流方向，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中盡量避免強(qiáng)氣流變化而產(chǎn)憤怒溶膠（如﹕涂片、染色過(guò)程中）。

(四)細(xì)菌的分離培養(yǎng)、菌種開(kāi)封、轉(zhuǎn)種、研磨、稀釋等操作，各級(jí)實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)在簡(jiǎn)易安全柜或生物安全柜中進(jìn)行。

(五)使用接種環(huán)進(jìn)行操作時(shí)，接種環(huán)應(yīng)在工作燈的內(nèi)焰中燃燒，以避免菌液或菌塊飛濺。

(六)稀釋菌液時(shí)，吸管、針管要緩慢插入試管或燒瓶底部，小心操作避免產(chǎn)憤怒泡或氣溶膠。(七)使用注射器加樣時(shí)，用過(guò)的針頭切勿再重新入套或拔開(kāi)注射器與針頭，應(yīng)直接放入銳器收集器，以免劃破皮膚造成接種感染。(八)菌株庫(kù)要設(shè)專人管理，并按照國(guó)家微生物菌毒種管理方法執(zhí)行。(九)進(jìn)行毒菌操作過(guò)程中，不要穿戴巳經(jīng)污染的防護(hù)性手套觸摸門(mén)柄、儀器或毒菌區(qū)以外區(qū)域，避免由于粗心擴(kuò)大污染范疇。(十)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，操作過(guò)程中全部可能與生物危險(xiǎn)物接觸或被污染的實(shí)驗(yàn)器械和物品，能夠高壓消毒的必須高壓消毒，不能進(jìn)行高壓消毒的設(shè)備、儀器，應(yīng)使用有效的消毒劑擦洗后再以紫外燈近距離長(zhǎng)時(shí)間消毒。(十一)實(shí)驗(yàn)中發(fā)生意外污染狀況，應(yīng)立刻告知主管人員并做好解決污染物和對(duì)應(yīng)區(qū)域的準(zhǔn)備，不得私自采用其它嚴(yán)禁的辦法進(jìn)行消毒解決。(十二)實(shí)驗(yàn)室主任應(yīng)制訂規(guī)章和程序，只有告知潛在風(fēng)險(xiǎn)并符合進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室特殊規(guī)定(如，通過(guò)免疫接種)的人，才干進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。(十三)操作致病性微生物時(shí)，實(shí)驗(yàn)室入口處應(yīng)貼有生物危險(xiǎn)標(biāo)志，并顯示下列信息：有關(guān)病原、生物安全級(jí)別、免疫接種規(guī)定、研究人員姓名、電話號(hào)碼、在實(shí)驗(yàn)室中必須佩帶的個(gè)人防護(hù)設(shè)施、出實(shí)驗(yàn)室所規(guī)定的程序。(十四)實(shí)驗(yàn)室主任為實(shí)驗(yàn)室人員特別制訂的原則操作程序或生物安全手冊(cè)中，應(yīng)涉及生物安全程序。對(duì)于有特殊風(fēng)險(xiǎn)的人員，規(guī)定閱讀并在工作及程序上遵照?qǐng)?zhí)行。(十五)實(shí)驗(yàn)室主任確保明驗(yàn)及其輔助人員接受適宜的培訓(xùn)，涉及和工作有關(guān)的可能存在的風(fēng)險(xiǎn)、避免暴露的必要方法和暴露評(píng)定程序。（十六）實(shí)驗(yàn)室所用任何個(gè)人防護(hù)裝備應(yīng)符合國(guó)家有關(guān)原則的規(guī)定。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確保含有足夠的有適宜防護(hù)水平的清潔防護(hù)服供使用。還應(yīng)穿戴其它的個(gè)人防護(hù)裝備，如手套、防護(hù)鏡、面具、頭部面部保護(hù)罩等。(十七)解決樣本的過(guò)程中易產(chǎn)生高危害氣溶膠時(shí)，規(guī)定同時(shí)使用適宜的個(gè)人防護(hù)裝備、生物安全柜和/或其它物理防護(hù)設(shè)備。如可產(chǎn)生含生物因子的氣溶膠，應(yīng)在適宜的生物安全柜中操作?！?/p>

(十八)實(shí)驗(yàn)用鞋應(yīng)舒適，鞋底防滑。應(yīng)用皮制或合成材料的不滲液體的鞋類。在從事可能出現(xiàn)漏出的工作時(shí)可穿一次性防水鞋套。在實(shí)驗(yàn)室的特殊區(qū)域（例如有防靜電規(guī)定的區(qū)域）或BSL-3和BSL-4實(shí)驗(yàn)室規(guī)定使用專用鞋（例如一次性或橡膠靴子）。結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室廢物解決§一、實(shí)驗(yàn)室廢棄物解決的目的：

(一)將操作、收集、運(yùn)輸、解決及處置廢棄物的危險(xiǎn)減至最??；

(二)將實(shí)驗(yàn)室廢棄物對(duì)環(huán)境的有害作用減至最小?！於?shí)驗(yàn)室污物解決及消毒

(一)實(shí)驗(yàn)室含有生物危險(xiǎn)物的臨床標(biāo)本及被污染的一次性用品，實(shí)驗(yàn)完畢后，應(yīng)在操作臺(tái)或?qū)嶒?yàn)區(qū)域內(nèi)以紫外燈近距離照射消毒2小時(shí)以上，再經(jīng)高壓消毒后方可丟棄或焚燒。

(二)可重復(fù)使用的實(shí)驗(yàn)用品及器材，完畢實(shí)驗(yàn)后，應(yīng)在操作臺(tái)或?qū)嶒?yàn)區(qū)域內(nèi)經(jīng)紫外燈近距離照射消毒2小時(shí)以上后，再交有關(guān)人員進(jìn)行高壓消毒和煮沸洗刷。(三)實(shí)驗(yàn)用的試管、吸管、注射器，須裝在加蓋不漏的容器內(nèi)，經(jīng)高壓滅菌后取出。

(四)培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)室垃圾，在丟棄前必須經(jīng)高壓消毒和紫外燈近距離長(zhǎng)時(shí)間照射解決。不允許積存垃圾和實(shí)驗(yàn)室廢棄物。已裝滿的容器應(yīng)定時(shí)運(yùn)走。在去污染或最后處置之前，應(yīng)寄存在指定的安全地方，普通在實(shí)驗(yàn)室區(qū)內(nèi)。

(五)實(shí)驗(yàn)室廢棄物應(yīng)置于適宜的密封且防漏容器中安全運(yùn)出實(shí)驗(yàn)室。有害氣體、氣溶膠、污水、廢液應(yīng)經(jīng)適宜的無(wú)害化解決后排放，應(yīng)符合國(guó)家有關(guān)的規(guī)定。(六)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，如標(biāo)本或含標(biāo)本的前消化解決液被打翻污染了操作臺(tái)或地面，應(yīng)以吸滿70%酒精的衛(wèi)生紙覆蓋污染區(qū)，15分鐘后來(lái)衛(wèi)生紙方可移去。(七)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)未經(jīng)消毒的污水，嚴(yán)禁直接排入公共排水系統(tǒng)，更不允許混入居民生活垃圾?！烊⒁馔馐鹿实慕鉀Q

(一)如果發(fā)生意外，必須立刻告知實(shí)驗(yàn)室主管人員，并在有關(guān)人員的指導(dǎo)監(jiān)督下對(duì)出事現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行解決，絕對(duì)嚴(yán)禁未經(jīng)報(bào)告而私自對(duì)出事現(xiàn)場(chǎng)予以非規(guī)范的解決。(二)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，如污染物濺落到身體表面，或有割傷、刺傷、燒傷、燙傷等狀況發(fā)生，應(yīng)立刻停止實(shí)驗(yàn)工作進(jìn)行緊急解決，更換被污染的實(shí)驗(yàn)服，皮膚表面用消毒液清洗，傷口以碘酒或酒精消毒，眼睛用無(wú)菌生理鹽水沖洗。(三)如果發(fā)生菌液溢出，含菌種的培養(yǎng)管破碎等，造成中、小面積污染，可用比污染面積大25%以上的紗布覆蓋污染區(qū)域，邊沿用脫脂棉圍住，向紗布傾倒5%苯酚溶液或70%的酒精，浸泡2小時(shí)以上（其間適量加溶液避免干燥），再經(jīng)紫外燈近距離（1米內(nèi)）照射2小時(shí)以上；被污染的器械、容器等立刻浸泡于70%酒精中2小時(shí)以上，實(shí)驗(yàn)完畢后再進(jìn)行高壓消毒解決。(四)如果發(fā)憤怒溶膠污染或大面積污染，應(yīng)立刻停止實(shí)驗(yàn)并關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室，對(duì)污染區(qū)域進(jìn)行紫外燈照射消毒過(guò)夜；第二天對(duì)污染區(qū)進(jìn)行24小時(shí)封閉空氣熏蒸消毒（乙醛消毒法﹕5ml乙醛＋2g高錳酸鉀/m3空間）?！?五)絕對(duì)嚴(yán)禁使用的事故解決辦法﹕1.任何有可能造成污染面積擴(kuò)大的去污辦法，如使用70%乙醇或甲酚皂液擦洗被污染的區(qū)域。2.直接用火焰對(duì)未經(jīng)任何解決的污染地面、操作臺(tái)、器械等進(jìn)行燒灼解決。3.使用消毒效果未經(jīng)證明的消毒劑進(jìn)行消毒。4.使用低濃度的消毒劑和紫外燈進(jìn)行短時(shí)間、長(zhǎng)距離的照射。結(jié)核病職業(yè)暴露§一、衛(wèi)生服務(wù)人員與職業(yè)暴露

衛(wèi)生服務(wù)人員(health-careperson,HCP)是指在衛(wèi)生服務(wù)部門(mén)、實(shí)驗(yàn)室以及公共安全環(huán)境下其活動(dòng)與結(jié)核病病人或其痰液/體液接觸的有關(guān)人員。