慢性復(fù)發(fā)性關(guān)節(jié)炎的病理學(xué)研究

慢性復(fù)發(fā)性關(guān)節(jié)炎的病理學(xué)研究

3預(yù)防預(yù)防并發(fā)癥的機(jī)制如圖1所示，在大鼠關(guān)節(jié)模型中確定克隆易感基因：該基因?qū)儆诮?jīng)典的純系育種分離技術(shù)，與合并系統(tǒng)和重組系統(tǒng)的建立相結(jié)合，減少了易感區(qū)域。最后，確定遺傳因素的變化、功能變化以及關(guān)節(jié)表型之間的關(guān)系。具體步驟見圖1。在數(shù)種關(guān)節(jié)炎模型中,用于進(jìn)行基因定位克隆的模型有:膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎、油誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎和Pristane誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。我們的研究工作主要采用PIA。PIA是用150μLPristane一次性皮下注射,在易感的大鼠中,從注射后8d,外周小關(guān)節(jié)開始發(fā)紅發(fā)腫,3周時(shí)炎癥達(dá)到高潮,幾乎所有外周小關(guān)節(jié),包括近節(jié)指間關(guān)節(jié)(趾間關(guān)節(jié))、掌指關(guān)節(jié)(跖趾關(guān)節(jié))、腕關(guān)節(jié)(踝關(guān)節(jié)),均可累及。4周后,炎癥逐漸消退。40d后,又可在已受累關(guān)節(jié)重新出現(xiàn)炎癥,或可在未受累關(guān)節(jié)出現(xiàn)炎癥,但往往沒有第一次炎癥嚴(yán)重。故認(rèn)為PIA是一種慢性復(fù)發(fā)性的關(guān)節(jié)炎,最能代表RA的特征。PIA的病理學(xué)改變主要為:①早期的滑膜炎。表現(xiàn)為滑膜增厚,細(xì)胞數(shù)目增多,滑膜間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞侵入,主要為多形核白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞,細(xì)胞可成團(tuán)成簇,形成巢狀結(jié)構(gòu),嚴(yán)重時(shí)巢狀細(xì)胞的中心又大量壞死,形成囊腔;大量的新生血管形成,由增厚的滑膜形成的血管翳突出于關(guān)節(jié)腔,覆蓋在關(guān)節(jié)軟骨的表面。②軟骨和骨的侵蝕。在嚴(yán)重的炎癥過(guò)程中,大量的炎癥細(xì)胞,主要是巨噬細(xì)胞,侵蝕骨和軟骨,甚至炎癥部位可和骨髓相連,炎癥部位的骨髓腔也可充滿炎癥細(xì)胞。③關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞。由于炎癥的破壞,關(guān)節(jié)的正常結(jié)構(gòu)消失,關(guān)節(jié)腔被纖維組織或軟骨骨組織所替代,形成纖維或軟骨和骨的僵直。④新生軟骨和骨的形成。在慢性炎癥時(shí),除有大量的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞外,在炎癥部位有纖維組織衍生的軟骨組織和骨組織形成。這些病理學(xué)改變和RA時(shí)在關(guān)節(jié)的病理學(xué)改變非常相似。另外,PIA和傳統(tǒng)的佐劑性關(guān)節(jié)炎不同,很少有其他器官的累及。PIA大鼠中的血液中也可檢測(cè)到類風(fēng)濕因子,一些炎性因子如急性反應(yīng)蛋白和細(xì)胞因子均增高,而反應(yīng)軟骨破壞的血清生化指標(biāo)如軟骨寡基質(zhì)蛋白(COMP)也增高。在關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)炎的發(fā)病和嚴(yán)重程度常采用大體的記分法。主要有簡(jiǎn)單記分系統(tǒng)和復(fù)雜記分系統(tǒng),簡(jiǎn)單記分系統(tǒng)總分為16分,四個(gè)爪子,每個(gè)爪子所有關(guān)節(jié)有炎癥(表現(xiàn)為紅腫)計(jì)4分,僅有一個(gè)小關(guān)節(jié)有炎癥計(jì)1分,兩個(gè)小關(guān)節(jié)或僅有踝(腕)關(guān)節(jié)受累者計(jì)2分,所有小關(guān)節(jié),或1個(gè)小關(guān)節(jié)和踝(腕)關(guān)節(jié)有炎癥計(jì)3分。復(fù)雜記分系統(tǒng)總分為60分,將每個(gè)爪子分為三部分,即踝(腕)部、中部及趾(指)部,每個(gè)部分最高分5分,每部1個(gè)趾有炎癥計(jì)1分,每爪最高分15分。評(píng)價(jià)炎癥的指標(biāo)有:患病率、每觀察天的患病率曲線、發(fā)病時(shí)間、平均最大記分,每觀察天的平均記分曲線等。常用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法是卡方檢驗(yàn)和秩和試驗(yàn)。也有的實(shí)驗(yàn)室采用簡(jiǎn)單的設(shè)備測(cè)定關(guān)節(jié)體積(jointvolume)、關(guān)節(jié)周長(zhǎng)、爪中部厚度等的改變,反映炎癥的程度。我們用于關(guān)節(jié)炎易感基因定位的近交系(inbred)大鼠為DA、LEW.1F和E3,三個(gè)近交系對(duì)不同關(guān)節(jié)炎的易感性歸納整理見表2。分離育種中,首先要選擇親代近交系,一般來(lái)說(shuō),選擇最易感的近交系和最不易感的近交系交配,生產(chǎn)子一代(F1)大鼠,F1代大鼠每個(gè)個(gè)體的遺傳背景相同,對(duì)疾病的易感性差異反映了環(huán)境因素的差異。F1代鼠互交產(chǎn)生的F2大鼠,不同基因位點(diǎn)進(jìn)行了分離,也就是說(shuō)由于基因的重組每個(gè)大鼠都可能攜帶著不同的基因。對(duì)F1代和F2代大鼠分別誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎,觀察各種表型,包括發(fā)病時(shí)間、嚴(yán)重程度、最大嚴(yán)重程度指數(shù)等反映疾病的指標(biāo)以及反映免疫反應(yīng)的自身抗體、DTH、細(xì)胞亞型、細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)等改變。計(jì)算各變量的方差。在F1代大鼠中,由于所有大鼠的基因是相同的,各變量的方差主要反映了環(huán)境因素的作用。而F2代大鼠中各變量的方差既反映了環(huán)境因素的作用,也有各大鼠間遺傳因素的作用。采用STR遺傳標(biāo)記,大約每10-20cM選擇一個(gè)有效STR標(biāo)記,進(jìn)行每個(gè)大鼠的全基因組掃描,獲得每個(gè)大鼠的基因型。在計(jì)算機(jī)軟件的幫助下,對(duì)每個(gè)表型,如發(fā)病、發(fā)病時(shí)間、嚴(yán)重程度等和基因型,進(jìn)行連鎖分析,計(jì)算出QTLs,以LOD值大于2.8為提示有連鎖,3.8為有連鎖顯著性差異。在我們對(duì)PIA的研究中,已經(jīng)確定了15個(gè)QTLs,一并歸納整理如表3。一旦確定QTLs,需要建立congenic系大鼠,以窄化QTLs區(qū)域,直到能夠進(jìn)行位置克隆易感基因。經(jīng)典的建立congenic系的方法是在STR標(biāo)記的幫助下,反復(fù)回交來(lái)自于抵抗系的QTLs區(qū)域到易感的近交系大鼠,也可采用相反的策略,取決于各QTL的遺傳模式。在PIA4的研究中,我們反復(fù)回交E3大鼠的PIA4位點(diǎn)到易感的DA大鼠,經(jīng)過(guò)十幾代的回交,除PIA4位點(diǎn)外,其余的基因位點(diǎn)幾乎和DA相同,我們稱這種congenic大鼠為DA.PIA4E3大鼠。在此基礎(chǔ)上,互交產(chǎn)生一系列重組DA.PIA4系,通過(guò)表型鑒定,SNPs標(biāo)記確定染色體區(qū)域,我們發(fā)現(xiàn)一重組系大鼠,不但對(duì)PIA關(guān)節(jié)炎,而且對(duì)CIA的表型也有顯著性影響,該區(qū)域不足2cM,為此后的位置克隆打下了基礎(chǔ)。建立congenic系,耗時(shí)且易于丟失表型。以保守估計(jì),需2-3年時(shí)間,期間還要不斷地驗(yàn)證表型,以觀察易感基因的效應(yīng)是否存在。為了解決這一問(wèn)題,有的研究者采用快捷congenic技術(shù)。這種方法和經(jīng)典方法的不同是,依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理,在全基因組STR標(biāo)記的幫助下,既選擇目的QTLs區(qū)的標(biāo)記來(lái)源于供體基因組,也選擇其他基因組區(qū)域的標(biāo)記和受體基因組近可能的一致的大鼠,與受體回交。理論上說(shuō),經(jīng)過(guò)5-6代的這種回交,可達(dá)到和經(jīng)典方法一樣的效果。美國(guó)大鼠基因組協(xié)作組建立了一組具有統(tǒng)一的遺傳背景,只有一條染色體不同的congenic大鼠系,稱之為consomic大鼠,以利于研究者窄化QTLs所需時(shí)間。另外,也有以表型為篩檢手段,建立congenic系,即在確定受體和供體基因組后,回交大鼠的選擇是采用表型的改變來(lái)確定。這種方法雖然避免表型的丟失,但給后面的位置克隆帶來(lái)很大不便,甚止難以進(jìn)行,故應(yīng)用較少。得到1cM的congenic大鼠,既可進(jìn)行位置克隆基因。理論上講,1cM大體相當(dāng)于1Mb的堿基,約含有10個(gè)基因,有必要在SNPs和STR等序列標(biāo)記位點(diǎn)(STS)的幫助下,確定該區(qū)域的物理圖譜。鑒于大鼠基因組序列已經(jīng)完成,此項(xiàng)工作目前已不難進(jìn)行。我們?cè)赑IA4的研究中,由于大鼠基因組計(jì)劃尚未完成,首先需要從基因組YAC文庫(kù)構(gòu)建contig,幸運(yùn)地發(fā)現(xiàn)該區(qū)域只有兩個(gè)基因,測(cè)序比較DA和E3大鼠兩個(gè)基因序列的差異,只發(fā)現(xiàn)NCF1基因兩者間存在著多態(tài)性。我們認(rèn)為:NCF1可能是PIA4的易感基因。當(dāng)然,也有其他的研究策略,如侯選基因法,在QTLs區(qū)域內(nèi),選擇可能和疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)的基因,進(jìn)行測(cè)序,對(duì)比分析,以確定易感基因。另外,可以與DNA芯片結(jié)合,即將區(qū)域內(nèi)的基因或ESTs點(diǎn)在芯片上,比較congenic系和對(duì)照在mRNA水平的差異?？赡茏畲蟛町愓呔褪且赘谢?用此方法,己有獲得成功的報(bào)道。但是,如果mRNA表達(dá)無(wú)差異,而蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變,難以達(dá)到滿意的結(jié)果。復(fù)雜性疾病的易感基因,往往表現(xiàn)為多態(tài)性,較少地表現(xiàn)為基因的沉默,即無(wú)功能蛋白的表達(dá)。這些多態(tài)性可存在于編碼區(qū),更多地存在于基因的非編碼區(qū)。如果確定為疾病的易感基因,一定有基因的改變對(duì)基因功能的影響。同時(shí)在轉(zhuǎn)基因小鼠,包括基因敲除、敲入小鼠中,均對(duì)疾病的發(fā)生有影響。另外,針對(duì)易感基因的靶向干預(yù),能夠達(dá)到預(yù)期的目的。采用動(dòng)物模型尋找關(guān)節(jié)炎的致病基因,對(duì)大鼠純系間的互交或回交,在大量的遺傳標(biāo)記幫肋下,通過(guò)連鎖分析,進(jìn)而通過(guò)選擇性回交,建立重組系以達(dá)到精確定位基因,克服了上述在人群研究中遇到的諸多問(wèn)題,而且,動(dòng)物模型可以有效地控制和操作環(huán)境因素,這樣有利于檢測(cè)基因的功能。迄今為止,我們從采用Pristane誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型已篩選出十余個(gè)調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)炎的非MHC基因位點(diǎn),在此基礎(chǔ)上克隆的Pia4基因被鑒定為是中性粒細(xì)胞胞漿因子1(Ncf1),這說(shuō)明此一研究策略是完全可行的,并且可能發(fā)現(xiàn)新的功能基因或已知基因的新功能。由于人類和大鼠基因組制圖的研究揭示了不同物種之間存在著高度的同源區(qū),而且不同炎癥性疾病不論在人類還是嚙齒類動(dòng)物基因組上都分享著相同的基因區(qū)域或簇。所以利用該新模型進(jìn)行遺傳分析,將為RA的易感基因定位、分子機(jī)理研究以及新藥研發(fā)等提供重要理論依據(jù),而且,這項(xiàng)研究也將有利于其他復(fù)雜性疾病特別是慢性炎癥疾病易感基因的鑒定和克隆。3.1選擇親代交系，建立關(guān)節(jié)炎模型3.2通過(guò)分離育種、香氣分析和確定定量遺傳點(diǎn)qlc3.3建立一個(gè)狹窄的區(qū)域，并將狹窄化趨勢(shì)暴露開來(lái)3.4位置克隆基因3.5基本資料和支持致謝:本研究得到theAnnaGretaCrafoordFoundationforRheumatologicalResearch,KingGustafVue78ds80-YearFoundation,theKockandOsterlundFoundations,theSwedishAssociationAgainstRheumatism,theSwedishMedicalResearchCouncil,EuropeanUnionProjectQLG1-CT2001-01407,theSwedishFoundationforStrategicResearch,theBeijerFoundation,theNilsson-EhleFoundation,andtheSwedishSocietyforMedicalResearch經(jīng)費(fèi)支持。感謝瑞典隆德大學(xué)在我作為訪問(wèn)學(xué)者及博士生學(xué)習(xí)期間的資助;感謝theAnnaGretaCrafoordFoundationforRheumatologicalResearch對(duì)我博士后研究